Activering en conjugatie van oplosbare polysacchariden met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat (CDAP)

Samenvatting

Eiwitten en aminebevattende liganden kunnen covalent worden gekoppeld aan polysacchariden die worden geactiveerd door het cyanylation-reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluoroboraat (CDAP), om covalent eiwit (ligand)-polysaccharideconjugaten te vormen. Dit artikel beschrijft een verbeterd protocol voor het uitvoeren van gecontroleerde CDAP-activering bij 0 °C en variërende pH en het uitvoeren van daaropvolgende conjugatie van de geactiveerde polysacchariden.

Samenvatting

Geconjugeerde vaccins zijn opmerkelijke vooruitgangen in de vaccinologie. Voor de bereiding van polysaccharideconjugaatvaccins kunnen de polysacchariden gemakkelijk worden gefunctionaliseerd en gekoppeld aan vaccindragereiwitten met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluoroboraat (CDAP), een gemakkelijk te hanteren cyanylating-reagens. CDAP activeert polysacchariden door te reageren met koolhydraathydroxylgroepen bij pH 7-9. De stabiliteit en reactiviteit van CDAP zijn sterk pH-afhankelijk. De pH van de reactie neemt ook af tijdens activering als gevolg van de hydrolyse van CDAP, waardoor een goede pH-regeling de sleutel is tot reproduceerbare activering. Het oorspronkelijke CDAP-activeringsprotocol werd uitgevoerd bij kamertemperatuur in niet-gebufferde pH 9-oplossingen.

Vanwege de snelle reactie onder deze omstandigheden (<3 min) en de bijbehorende snelle pH-daling van de snelle CDAP-hydrolyse, was het een uitdaging om de pH van de doelreactie in het korte tijdsbestek snel aan te passen en te handhaven. Het verbeterde protocol dat hier wordt beschreven, wordt uitgevoerd bij 0 °C, wat de CDAP-hydrolyse vertraagt en de activeringstijd verlengt van 3 minuten tot ~ 15 minuten. Dimethylaminopyridine (DMAP) werd ook gebruikt als buffer om de polysaccharide-oplossing vooraf aan te passen aan de pH van de doelactivering voordat het CDAP-reagens werd toegevoegd. De langere reactietijd, in combinatie met de langzamere CDAP-hydrolyse en het gebruik van DMAP-buffer, maakt het gemakkelijker om de activerings-pH gedurende de gehele duur van het activeringsproces te handhaven. Het verbeterde protocol maakt het activeringsproces minder hectisch, reproduceerbaarder en vatbaarder voor opschaling.

Inleiding

Geconjugeerde vaccins, zoals die bestaande uit polysacchariden covalent gekoppeld aan een dragereiwit, behoren tot de opmerkelijke vooruitgang in de vaccinologie^1,2. Polysacchariden, als T-celonafhankelijke antigenen, zijn slecht immunogeen bij zuigelingen en induceren geen geheugen, klasseschakeling of affiniteitsrijping van antilichamen³. Deze tekortkomingen worden overwonnen in polysaccharide geconjugeerde vaccins⁴. Omdat de meeste polysacchariden geen handig chemisch handvat hebben voor conjugatie, moeten ze eerst reactief of "geactiveerd" worden gemaakt. De geactiveerde polysacharide wordt vervolgens direct gekoppeld aan het eiwit (of gemodificeerd eiwit) of wordt gefunctionaliseerd voor extra derivatisatie vóór conjugatie⁴. De meeste gelicentieerde polysaccharide conjugaatvaccins gebruiken reductieve aminatie of cyanylation om polysaccharidehydroxylen te activeren. Cyanogeenbromide (CNBr), een reagens dat eerder werd gebruikt om chromatografieharsen te activeren, werd aanvankelijk gebruikt voor polysaccharide-derivatisatie. CNBr vereist echter een hoge pH, meestal ~ pH 10,5 of hoger, om polysaccharidehydroxylen gedeeltelijk te deprotoneren, zodat ze voldoende nucleofiel zijn om de cyanogroep aan te vallen. De hoge pH kan schadelijk zijn voor base-labiele polysacchariden, en noch CNBr, noch de actieve cyano-ester die aanvankelijk is gevormd, is voldoende stabiel bij zo'n hoge pH.

CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat; Figuur 1) werd geïntroduceerd door Lees et al. voor gebruik als cyanylating agent voor de activering van polysacchariden^5,6. CDAP, dat kristallijn en gemakkelijk te hanteren is, bleek polysacchariden te activeren bij een lagere pH dan CNBr en met minder bijwerkingen. In tegenstelling tot CNBr kunnen CDAP-geactiveerde polysacchariden direct worden geconjugeerd aan eiwitten, waardoor het syntheseproces wordt vereenvoudigd. CDAP-geactiveerde polysacchariden kunnen worden gefunctionaliseerd met een diamine (bijv. Hexaandiamine) of een dihydrazide (bijv. Adipische dihydrazide, ADH) om amino- of hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden te maken. Een hoge concentratie van het homobifunctionele reagens wordt gebruikt om crosslinking van polysacchariden te onderdrukken. Aminopolysacchariden kunnen vervolgens worden geconjugeerd met behulp van een van de talloze technieken die worden gebruikt voor eiwitconjugatie. Hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden worden vaak gekoppeld aan eiwitten met behulp van een carbodiimide-reagens (bijv. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC))⁷. Verdere optimalisatie van CDAP polysaccharide activering is beschreven door Lees et al.⁸ en is opgenomen in het protocol dat hier wordt beschreven.

CDAP-vervoegingsoverzicht
Het CDAP-protocol kan worden geconceptualiseerd als twee fasen: (1) de activering van de polysacharide en (2) conjugatie van de geactiveerde polysaccharide met een eiwit of ligand(figuur 2). Het doel van de eerste stap is om de polysaccharide efficiënt te activeren, terwijl het doel van de tweede is om efficiënt te conjugeren naar de geactiveerde polysaccharide. De geactiveerde polysaccharide verbindt de twee stappen met elkaar. Deze conceptualisering helpt zich te concentreren op de kritieke elementen van elke stap. Figuur 2 breidt deze conceptualisering uit en toont de gewenste activerings- en koppelingsreacties, samen met de hydrolysereacties en nevenreacties.

Tijdens de activeringsfase zijn de drie belangrijkste zorgen de CDAP-stabiliteit, de CDAP-reactie met de polysaccharidehydroxylen en de stabiliteit van de geactiveerde polysacharide(figuur 3). CDAP-hydrolyse neemt toe met de pH, net als de hydrolyse van de geactiveerde polysaccharide en de nevenreacties. De CDAP-reactie met de polysaccharide wordt echter vergemakkelijkt door de pH te verhogen. Het efficiënt activeren van polysachariden met CDAP vereist een balans tussen 1) de reactiviteit van de polysacharide en CDAP en 2) de hydrolyse en nevenreacties van zowel het reagens als het geactiveerde polysacharide.

In het oorspronkelijke CDAP-activeringsprotocol beschreven door Lees et al.⁵, werd CDAP-activering van polysacchariden uitgevoerd bij kamertemperatuur in niet-gebufferde pH 9-oplossing. De activeringssnelheid bleek onder deze voorwaarde snel te zijn en de activering zou binnen 3 minuten voltooid zijn. De reactie ging ook gepaard met snelle hydrolyse van CDAP, waardoor een snelle pH-daling van de niet-gebufferde reactieoplossing ontstond. Het was een uitdaging om de reactie-pH in zo'n kort tijdsbestek snel te verhogen en op de streefwaarde te houden. In het beschreven protocol werd activering uitgevoerd door CDAP van een 100 mg/ml stockoplossing toe te voegen aan de niet-gebufferde polysaccharide-oplossing. De pH werd 30 s later verhoogd met "een gelijk volume van 0,2 M triethylamine". Het te conjugeren eiwit werd vervolgens na 2,5 minuut aan de activeringsreactie toegevoegd. Met name de pH van de activeringsstap was niet goed gecontroleerd en overschreed hoogstwaarschijnlijk aanvankelijk de beoogde pH. De snelle reactie die een snelle aanpassing van de pH vereiste, maakte het activeringsproces moeilijk te controleren en een uitdaging om op te schalen.

In tegenstelling tot het oorspronkelijke protocol heeft het hier beschreven aangepaste protocol twee belangrijke verbeteringen. Eerst wordt de pH van de polysaccharide-oplossing vooraf aangepast aan de pH van de doelactivering, met DMAP als buffer, vóór de toevoeging van CDAP. DMAP heeft een pKa van 9,5 en heeft dus een goed buffervermogen rond pH 9, en in tegenstelling tot veel andere buffers bleek DMAP geen CDAP-hydrolyse te bevorderen⁸. Bovendien is DMAP al een procestussenproduct en voegt daarom geen nieuwe component toe aan het reactiemengsel. Het vooraf aanpassen van de pH voordat CDAP wordt toegevoegd, elimineert de grote pH-schommeling aan het begin van de reactie en zorgt voor een efficiënter onderhoud van de doel-pH tijdens de reactie. De tweede verbetering is het uitvoeren van de activeringsreactie bij 0 °C, waarbij de snelheid van CDAP-hydrolyse aanzienlijk langzamer is dan die bij kamertemperatuur. Met de langere halfwaardetijd van het reagens bij 0 °C wordt de activeringstijd verhoogd van 3 min naar 15 min om de langzamere activeringssnelheid bij de lagere temperatuur te compenseren. De langere reactietijd maakt het op zijn beurt gemakkelijker om de pH van de reactie te handhaven. Het gebruik van 0 °C vertraagt ook de afbraak van pH-gevoelige polysacchariden, waardoor het mogelijk is om conjugaten van dit type polysacharide te bereiden. De verbeteringen in het protocol maken het activeringsproces minder hectisch, gemakkelijker te controleren, meer reproduceerbaar en vatbaarder voor opschaling.

Dit artikel beschrijft het verbeterde protocol voor het uitvoeren van gecontroleerde CDAP-activering van polysaccharide bij 0 °C en bij een gespecificeerde streef-pH en het uitvoeren van daaropvolgende derivatisatie van de geactiveerde polysacchariden met ADH. Ook beschreven is een trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) assay, gebaseerd op de methode van Qi et al.⁹, voor de bepaling van hydrazide niveau op de gemodificeerde polysaccharide. Een gemodificeerde test voor hexoses op basis van resorcinol en zwavelzuur¹⁰ wordt ook beschreven, die kan worden gebruikt voor het bepalen van een breder scala aan polysacchariden. Voor meer informatie over CDAP-activering en -vervoeging wordt de lezer verwezen naar eerdere publicaties^5,6,8 van Lees et al.

Protocol

OPMERKING: Bereid de polysaccharide-oplossing, ADH-oplossing, DMAP-oplossing en CDAP-voorraadoplossing van tevoren voordat u de polysaccharideactiverings- en functionalisatieprocedures uitvoert. Plaats de oplossingen en apparatuur op een georganiseerde, handige en logische locatie. De beschreven reactie is voor 10 mg polysaccharide en kan omhoog of omlaag worden geschaald. Het wordt aanbevolen om het protocol op kleine schaal te evalueren voordat u opschaalt.

1. Bereid 5 mg / ml polysaccharide-oplossing, 2 ml.

1. Voor lyofiliseerde polysaccharide
   1. Laat de polysaccharide container op kamertemperatuur komen voordat u deze opent. Weeg 10 mg polysaccharide af in een buis met schroefdop met behulp van een analytische balans. Gebruik een statische eliminator voor eenvoudigere bemonstering en nauwkeuriger wegen van het poeder.
   2. Voeg 2 ml 0,15 M natriumchloride (NaCl) toe aan de buis om de polysacharide op te lossen. Dop en vortex de buis.
      OPMERKING: Natriumchloride heeft geen invloed op de CDAP-reactie, maar het kan de secundaire structuur van polysaccharide beïnvloeden. Sommige polysacchariden zijn beter oplosbaar bij verschillende zoutconcentraties.
   3. Meng de buis door end-over-end rotatie gedurende 12-24 uur, afhankelijk van het molecuulgewicht van de polysacharide, zodat de polysaccharide volledig kan hydrateren. Verwarm de tube indien nodig voorzichtig om de oplosbaarheid te bevorderen.
2. Voor oplosbare polysacharide in gebufferde oplossing
   OPMERKING: Voor een efficiënte CDAP-activering mag de polysaccharide-oplossing geen buffer bevatten, met name fosfaationen. Volg de onderstaande procedure om de buffer te vervangen door water of een zoutoplossing en om de polysaccharideconcentratie aan te passen tot 5 mg/ml.
   1. Verkrijg een 4 ml of 15 ml centrifugaal-spin filterapparaat van de juiste moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO).
      OPMERKING: De MWCO is idealiter 5-10 keer kleiner dan het molecuulgewicht van de polysaccharide.
   2. Voeg een volume van de gebufferde polysaccharide-oplossing met ~20 mg van de polysaccharide toe aan de filterinzet. Vul tot de volledige markering met water of een zoutoplossing. Sluit het filter goed af. Meng een paar keer end-over-end.
   3. Centrifugeer het filterapparaat met de door de fabrikant voorgestelde centrifugaalkracht. Zorg ervoor dat de centrifugatietijd lang genoeg is om na elke draai ten minste 5-voudige volumereductie te bereiken. Gooi de doorstroming weg. Monteer het filterapparaat opnieuw.
   4. Vul de filterinzet tot de volledige markering met zoet water of zoutoplossing. Sluit het filter goed af. Meng de inhoud in het filter door end-over-end rotatie ~ 10 keer of door zachte vortexing; herhaal de spin.
      OPMERKING: Polysaccharide kan zich ophopen aan de onderkant van de filterinzet van het centrifugaalapparaat en een gel vormen. Het wordt aanbevolen om de retentant in de filterinzet opnieuw te mengen met de verse navulling voor de volgende draaiing.
   5. Herhaal de navul- en spincyclus minimaal 3 keer.
   6. Volg de onderstaande oefening om de polysaccharide-retentant uit de filterinzet te herstellen.
      1. Voeg vers water of zoutoplossing toe aan de filterinzet zodat het volume ~ 1 ml is. Meng door op en neer te pipetteren of door zachtjes te vortexen.
      2. Breng alle gemengde retentanten over in een buis van 5 ml. Voeg 1 ml zoet water of zoutoplossing toe aan de filterinzet. Spoel het filter door op en neer te pipetteren of door zachtjes te vortexen. Breng alle spoelingen over en combineer ze met de teruggewonnen polysacharide.
   7. Bepaal de polysaccharideconcentratie (zie de polysacharidetest in rubriek 7.3). Verdun de polysaccharide met extra water of zoutoplossing tot 5 mg /ml.
3. Wanneer de polysaccharide-oplossing is bereid, koelt u de buis met de polysaccharide-oplossing in een ijsemmer.

2. Bereid 0,5 M adipinezuur dihydrazide (ADH) oplossing, 10 ml.

1. Weeg 0,87 g ADH in een analytische balans en solubiliteer in 8 ml van 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur), pH 8.
2. Pas aan de beoogde pH aan met 1 M natriumhydroxide (NaOH), bewaakt door een pH-meter. Breng tot 10 ml met extra buffer en bevestig de pH opnieuw.

3. Bereid 2,5 M DMAP-oplossing, 10 ml.

OPMERKING: DMAP is giftig en zal de huid binnendringen. Draag nitrilhandschoenen bij het uitvoeren van de procedure.

1. Weeg 3 g DMAP voorzichtig af in een conische buis van 50 ml. Voeg 5 ml water toe aan DMAP en meng door gedurende 5 minuten te vortexen om een troebele oplossing (~ 7 ml) te verkrijgen.
2. Voeg tijdens het mengen stappen van 50 μL van 10 N zoutzuur (HCl) toe aan de DMAP-oplossing. Meng tussen elke toevoeging. Stop met toevoegen wanneer de oplossing duidelijk wordt.
3. Voeg 10 N NaOH toe in stappen van 25 μL om de DMAP-oplossing op ~pH 8 te brengen.
4. Breng de DMAP-oplossing met water op 10 ml om een oplossing van 2,5 M te geven.
5. Verfijn de pH van de 2,5 M DMAP-oplossing.
   OPMERKING: De pH van de DMAP-oplossing verandert met de concentratie en ionische sterkte. Deze oefening is om de 2,5 M DMAP-voorraad af te stemmen op een specifieke pH, zodat wanneer deze wordt gemengd met 10 volumes polysaccharide, de resulterende oplossing dicht bij de beoogde pH voor activering ligt.
   1. Bereid een reeks buizen van 1,5 ml met 1 ml water of de NaCl-oplossing, afhankelijk van wat werd gebruikt voor de bereiding van de polysaccharide-oplossing. Koel de buizen op ijs.
   2. Voeg 100 μL DMAP toe aan een gekoelde buis. Vortex en meet de pH met een pH-meter. Gooi vervolgens de gemeten buis weg.
   3. Als de gemeten pH niet in de buurt van de streefwaarde ligt, past u de pH van de DMAP-voorraad aan met 1 M NaOH of HCl, naargelang het geval. Herhaal stap 3.5.2 en 3.5.3 totdat de gemeten pH dicht bij de streef-pH ligt.

4. Bereid 100 mg/ml CDAP-stamoplossing

OPMERKING: CDAP-poeder moet goed gesloten worden gehouden en worden bewaard bij -20 °C en vóór opening op kamertemperatuur worden gebracht. Draag nitrilhandschoenen bij het uitvoeren van de procedure.

1. Gebruik een microcentrifugebuis met snap-cap van 1,5 ml op een analytische balans. Weeg met behulp van een kleine spatel 10-140 mg CDAP in de buis. Let op het werkelijke gewicht van CDAP.
2. Bepaal het volume acetonitril dat nodig is om 100 mg / ml CDAP te bereiden. Open acetonitril in een zuurkast.
3. Trek met behulp van een geschikt volumepipetter het acetonitril en laat het los om de damp in de pipetpunt in evenwicht te brengen. Wacht tot het oplosmiddel na een paar seconden uit de pipetpunt druipt en wees voorbereid om het rechtstreeks naar de CDAP-buis over te brengen. Teken het berekende volume acetonitril en breng het direct over naar de CDAP-buis. Klik de dop dicht.
   OPMERKING: Acetonitril kan ook worden overgebracht naar de CDAP-buis met behulp van een Hamilton-spuit of het equivalent daarvan van geschikte grootte.
4. Vortex om de CDAP volledig op te laten. Plaats de CDAP-buis in een ijsemmer.
   OPMERKING: CDAP is stabiel in acetonitril in de kou. Oplosbare voorraden mogen gedurende >1 week bij -20 °C worden bewaard. Het verdient echter de voorkeur om verse CDAP-oplossingen te bereiden.

5. Polysaccharide activering en hydrazide functionalisatie

1. Zorg ervoor dat alle volgende items klaar zijn en oplossingen gekoeld op ijs voordat de activering wordt gestart: 2 ml van een polysaccharide-oplossing van 5 mg / ml in een container met platte bodem en brede mond met een roerstaaf, bovenop een magnetische roerder geplaatst; 100 mg/ml CDAP-stamoplossing; 2,5 M DMAP-voorraadoplossing; een pH-meter met een semi-micro pH-sonde, zoals de sonde met een diameter van 6 mm, gekalibreerd voor 0 °C volgens de instructies van de fabrikant; een voor gebruiksklare pipet van 100 μL; een timer gewist en klaar voor gebruik; een autotitratordispenserkop geplaatst of 10 μL pipet klaar voor gebruik; 0,5 M ADH-oplossing.
2. Pas de pH van de polysacharide vooraf aan de pH van het doel aan met behulp van DMAP.
   1. Plaats de pH-sonde in de polysaccharide-oplossing en laat deze tijdens de gehele activeringsprocedure in de oplossing.
   2. Breng 200 μL van de DMAP-stamoplossing over in de polysaccharide-oplossing door druppelsgewijs onder het roeren toe te komen. Pas de pH van de oplossing aan de beoogde pH van activering aan. Voeg 0,1 M HCl toe om de pH te verlagen en 0,1 M NaOH om de pH te verhogen. Vermijd het overschrijden van de beoogde pH met meer dan 0,1 pH-eenheid en houd de reactie gekoeld in een ijswaterbad gedurende de activering.
3. CDAP-activering
   1. Pipetteer 100 μL CDAP op en neer om de damp in de pipetpunt in evenwicht te brengen. Breng onder roeren 100 μL CDAP over in de polysaccharide-oplossing.
      OPMERKING: Deze activering gebruikt 1 mg CDAP voor 1 mg polysaccharide als startverhouding. De verhouding kan worden verhoogd of verlaagd bij het optimaliseren van de activering.
   2. Start de timer en controleer de pH-verandering tijdens de gehele activering. Handhaaf de reactie op de pH van het doel door onmiddellijk stappen van 10 μL van 0,1 M NaOH aan de reactie toe te voegen, met behulp van een autotitratordispenser (of pipet).
      OPMERKING: Het kan helpen de pH-responstijd te verkorten om voorzichtig met een pH-sonde te roeren. De pH daalt in het begin sneller en het kan nodig zijn om de 0,1 M NaOH vaker toe te voegen. Naarmate de reactie vordert, wordt de pH-daling langzamer en wordt de toevoeging minder frequent. De pH moet in wezen ongewijzigd blijven bij het naderen van de optimale activeringstijd, die 10-15 minuten is voor pH 9-activering.
4. ADH functionalisatie
   1. Wanneer de optimale activeringstijd is bereikt, voegt u onder roeren 2 ml van 0,5 M ADH in één keer toe aan de geactiveerde polysaccharide. Controleer of de pH binnen het doelbereik ligt (pH 8-9 voor ADH).
      OPMERKING: Eén toevoeging met snel mengen minimaliseert de kans dat beide uiteinden van het dihydrazide reageren met de geactiveerde polysaccharide, waardoor polysaccharide crosslinking wordt voorkomen.
   2. Blijf het reactiemengsel gedurende ten minste 1 uur roeren. Breng het reactiemengsel over op 4 °C, maar 0-20 °C is aanvaardbaar.
      OPMERKING: De ADH-functionalisatiereactie is niet sterk afhankelijk van de temperatuur. Omdat de grote overmaat aan dihydrazide fungeert als het blusreagens, is het niet nodig om de geactiveerde polysaccharide verder te doven. Bij het direct conjugateren van eiwitten moet de reactie echter worden geblust, meestal met 1 M glycine, pH 8-9.

6. Zuivering van ADH-gefunctionaliseerde polysaccharide door dialyse

OPMERKING: Het ruwe product van de ADH-functionalisatiereactie bevat een hoge concentratie ADH (0,5 M), die het meest efficiënt kan worden verwijderd door uitgebreide dialyse. Gelfiltratie, hetzij met een kolom of een spin-ontsaltingsapparaat, is niet zo efficiënt, vooral wanneer het nodig is om de resterende ADH-verontreiniging te verwijderen.

1. Bepaal de MWCO van het dialysemembraan. Gebruik een cutoff van 3 kDa voor kleinere polysacchariden.
   OPMERKING: De MWCO van het dialysemembraan is idealiter 5-10 keer kleiner dan de MW van polysaccharide.
2. Kies het gewenste dialyseformaat (cassettes of slangen) en de juiste apparaatcapaciteit. Zorg ervoor dat de capaciteit van het apparaat 2 keer groter is dan het monstervolume. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het gebruik van het apparaat.
3. Hydrateer het dialysemembraan in water voor gebruik. Breng de ruwe gederivatiseerde polysaccharide-oplossing over naar het dialyseapparaat volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Draag nitrilhandschoenen om contact met DMAP te voorkomen.
4. Dialyseer in een container gevuld met 2-4 L van 1 M NaCl en een roerstaaf. Plaats de container op een roerplaat in een koude ruimte of in een koelkast. Roer het dialysaat zacht en continu tijdens de dialyse.
5. Na het dialyseren gedurende ten minste 4 uur, overschakelen op verse 1 M NaCl en dialyseren gedurende ten minste 12 uur. Dialyseer tegen 2 veranderingen van 0,15 M zoutoplossing, elk gedurende ten minste 12 uur. Indien gewenst dialyseren tegen 2 verversingen van water.
6. Controleer of alle ADH is verwijderd door het dialysaat 's nachts te testen met behulp van een snelle TNBS-test.
   1. Verkrijg 3 borosilicaatbuizen, label ze als respectievelijk negatief besturingselement (ctrl), positieve ctrl en monster.
   2. Voeg aan de negatieve ctrl-buis 975 μL van 0,1 M boraat, pH 9 toe.
   3. Voeg aan de positieve ctrl-buis 100 μL van 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazide) en 875 μL van 0,1 M boraat, pH 9 toe.
   4. Voeg aan de monsterbuis 500 μL van het overnight dialysaat en 475 μL van 0,1 M boraat, pH 9, toe.
   5. Voeg 25 μL van 1% TNBS toe aan alle drie de buizen. Meng goed. Plaats in het donker gedurende 1 uur.
   6. Vergelijk de kleurintensiteit van de 3 buizen in 1 uur. Zorg ervoor dat de kleurintensiteit van de monsterbuis tussen die van de positieve ctrl en de negatieve ctrl ligt, wat aangeeft dat de ADH-verontreiniging tot 0,01 mM of lager is. Dialyze nog een keer.
      OPMERKING: Het is verstandig om het niveau van de ADH-verontreiniging zoveel mogelijk te verlagen, zodat de ADH-hydrazide minder dan 1% van de totale hydrazide in de gezuiverde hydrazide-polysaccharide uitmaakt.
   7. Herstel de gederivatiseerde polysaccharide uit dialyse. Bepaal de concentratie van de polysacchariden en hydrazide. Bereken de hydrazide/polysaccharideverhouding (zie rubriek 7). Als de gedialyseerde polysacharide geconcentreerd moet zijn tot 5-10 mg/ml, raadpleeg dan rubriek 1.2.

7. Analyse van hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden

OPMERKING: Het doel van de hier beschreven analyse is het bepalen van de polysaccharideconcentratie, de hydrazideconcentratie en het niveau van hydrazide-derivatisatie in termen van de hydrazide / polysaccharide-verhouding.

1. Monstervoorbereiding
   OPMERKING: Polysacchariden die moeten worden getest, moeten vrij zijn van koolhydraten, amine of hydrazide-onzuiverheden met een laag molecuulgewicht. Gelyofiliseerde monsters moeten droog en zoutvrij zijn om een nauwkeurige gewichtsmeting te garanderen. Gewoonlijk is ~ 1 ml van een 1-2 mg / ml oplossing voldoende voor assays.
   1. Weeg ten minste 10 mg van het gelofiliseerde polysaccharidemonster af op een analytische balans, met behulp van een niet-statische spatel of een statische eliminator. Los de polysacharide op in water of zoutoplossing tot een concentratie (bv. 2 mg/ml) zodat de testsignalen binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen.
   2. Meng end-over-end en geef het monster voldoende tijd om het volledig op te lossen. Voer 's nachts hydratatie uit, afhankelijk van het molecuulgewicht van polysaccharide.
2. Polysaccharide assay: resorcinol/zwavelzuur methode
   OPMERKING: De juiste test voor polysacchariden is afhankelijk van de koolhydraatsamenstelling van de polymeren. De oorspronkelijke recircinol/zwavelzuurtest was bedoeld voor hexosesuikers¹⁰. De test werd hier aangepast door de temperatuur van de verwarmingsstap te verhogen van 90 °C naar 140 °C. Bij deze hogere temperatuur verliest de test enige specificiteit, maar kan worden gebruikt om veel suikers te testen. Het is echter nog steeds noodzakelijk om de geschiktheid van de test voor een bepaalde polysaccharide te bepalen. Triplicaten worden aanbevolen voor elk punt, maar sommige accommodatie kan nodig zijn vanwege de capaciteit van het verwarmingsblok.
   1. Bereid 75% zwavelzuur
      OPMERKING: Geconcentreerd zwavelzuur is extreem corrosief en kan ernstige brandwonden veroorzaken. Voer deze procedure uit in een chemische zuurkast. Giet geconcentreerd zuur altijd in water, niet andersom!
      1. Voeg 50 ml water toe aan een glazen fles van 200 ml. Plaats de fles in een koudwaterbad. Voeg langzaam 150 ml zwavelzuur toe. Dop de fles zo dat deze wordt geventileerd.
      2. Laat de oplossing op kamertemperatuur komen. Gebruik de oplossing binnen 3 maanden.
   2. Bereid koolhydraatstandaarden voor
      1. Bereid de ongewijzigde polysaccharide-oplossing met 1 mg/ml voor gebruik als standaard. Als alternatief kunt u een mix van individuele suikers gebruiken in de verhouding die wordt aangetroffen in de herhalingseenheid van de polysaccharide, bij 1 mg / ml van de totale suikerconcentratie, als standaard.
         OPMERKING: Hoewel de suikermix meestal hetzelfde resultaat geeft als het koolhydraatpolymeer met identieke suikersamenstelling, moet dit experimenteel worden bevestigd.
   3. Zorg ervoor dat het verwarmingsblok met buishouders voor 13 x 100 borosilicaat reageerbuizen functioneert. Gebruik een beschermende pad onder en rond het verwarmingsblok in geval van zuur morsen. Verwarm het verwarmingsblok voor op 140 °C gedurende minimaal 1 uur om een stabiele, uniforme temperatuur te bereiken door alle gebruikte blokken.
   4. Label 13 x 100 borosilicaat reageerbuizen, drievoud voor elke standaard en elk monster. Voeg 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (of μL) van de 1 mg/ml koolhydraatstandaard toe aan de overeenkomstig gelabelde standaardbuizen. Voeg water toe aan elke buis om het volume op 100 μL te brengen.
      OPMERKING: De gegenereerde kleur is afhankelijk van specifieke suikers. Omdat sommige suikers meer massa nodig hebben om het volledige absorptiebereik te genereren, kunnen de werkelijke hoeveelheden die voor de standaardcurve worden gebruikt, variëren.
   5. Stel monstertests in door een volume met ~ 5 μg van de gederivatiseerde polysaccharide toe te voegen aan drie monsterbuizen en breng het totale volume op 100 μL met water. Als alternatief, als de polysaccharideconcentratie in het monster onbekend is, voert u een reeks 4-voudige verdunningen uit. Test 100 μL van elke verdunning in drievoud.
   6. Bereid verse resorcinol met 6 mg / ml in gedeïoniseerd (dI) water onmiddellijk voor gebruik. Vortex totdat de resorcinol in oplossing is. Voeg 100 μL 6 mg/ml resorcinol toe aan elke buis.
   7. Giet voorzichtig de geschatte hoeveelheid 75% zwavelzuur in een klein bekerglas.
      OPMERKING: Draag een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril. Wees voorzichtig met druppels, morsen en spatten. Houd natte papieren handdoeken bij de hand om eventuele druppels op te vegen. Aangezien de activiteit van het zwavelzuur verandert bij langdurige blootstelling aan lucht, gebruikt u een uniform mengsel van zwavelzuur voor de gehele test.
   8. Voeg met behulp van een herhaalde pipetter gelijkmatig 300 μL 75% zwavelzuur toe aan elke buis. Vortex de buizen krachtig om goed te mengen, waarbij de buis tijdens het vortexen wordt weggenomen. Plaats de buizen in een verwarmingsblok in een gestaag tempo in opeenvolgende volgorde. Zodra alle buizen binnen zijn, stelt u de timer onmiddellijk in op 3 minuten.
   9. Verwijder na 3 minuten de buizen in een gestaag tempo in dezelfde volgorde en plaats ze direct in een rek in een ijswaterbad. Laat de buisjes staan tot ze ijskoud zijn. Verwijder de buizen en laat ze gedurende ~ 5 minuten op kamertemperatuur balanceren om condensatie op de cuvette tijdens het lezen te voorkomen.
   10. Stel een UV/VIS-spectrofotometer in om de absorptie bij 430 nm af te lezen met behulp van een 10 mm pathlengte cuvette. Blanco met een nul standaard buis. Lees de absorptie van alle buizen af bij 430 nm.
       OPMERKING: Plastic wegwerp cuvetten zijn handig in gebruik.
   11. Construeer een standaardcurve door μg koolhydraatstandaard versus A₄₃₀uit te plotten. Zie figuur 4 voor een typische standaardcurve met glucose als referentiestandaard.
   12. Gebruik de monstertestbuizen met A_430-waarden die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen, bereken de μg-hoeveelheid van de onbekende polysaccharide in de monstertestbuizen uit de standaardcurvevergelijking. Bepaal de concentratie van de onbekende polysaccharide uit het volume van de onbekende toegevoegde, rekening houdend met verdunningen. Converteer de concentratie naar mg/ml of μM herhalingseenheden zoals vereist.
3. Hydrazide assay met behulp van trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)
   1. Bereid 0,9% NaCl met 0,02% natriumazide (monsterbuffer) door 9 g NaCl en 200 mg natriumazide in dI H₂O op te lossen tot een eindvolume van 1 l.
   2. Bereid 0,1 M natriumboraat, pH 9 (assaybuffer), door 100 ml 0,5 M natriumboraat, pH 9, te mengen met 400 ml dI H₂O. Bevestig dat de pH van de oplossing 9 ± 0,1 is; indien nodig aanpassen.
   3. Bereid 1% TNBS door 200 μL van 5% 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuuroplossing te verdunken tot 1 ml met dI H₂O. Markeer de buis als 1% TNBS en bewaar bij 4 °C in het donker gedurende een week.
   4. Bereid 50 mM ADH-voorraad voor (equivalent aan 100 mM hydrazide).
      1. Weeg 871 mg adipisch dihyrazide (ADH) poeder af met behulp van een analytische balans. Los het poeder op in een reagensfles door monsterbuffer toe te voegen aan 100 ml met behulp van een bovenladerbalans.
      2. Label de fles als 100 mM hydrazide/50 mM ADH. Dek de fles goed af en bewaar gedurende 1 jaar bij 4 °C.
   5. Bereid hydrazidestandaarden voor (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 en 0,6 mM hydrazide).
      1. Bereid de 6 hydrazidestandaarden voor door de 100 mM hydrazidevoorraad te verdunnen met monsterbuffer met behulp van een bovenladerbalans. Bereid 100 ml van elke standaard voor om concentratiefouten te minimaliseren. Sluit de flessen goed af en bewaar gedurende 1 jaar bij 4 °C.
   6. Het instellen van testreacties
      OPMERKING: De TNBS-test wordt uitgevoerd op een reactievolume van 1 ml. Elke testbuis bestaat uit 100 μL van een monster (of een standaard), 875 μL assaybuffer en 25 μl van 1% TNBS-oplossing. Alle testreacties (voor zowel monsters als normen) zijn in drievoud opgesteld.
      1. Label 3 borosilicaat glazen buizen (12 x 75 mm) voor elke standaard, inclusief de nulstandaard. Sorteer en rangschik de standaardbuizen in buizenrek in volgorde van toenemende concentratie. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 100 μL of 200 μL om nauwkeurig 100 μL van de normen aan elke overeenkomstige buis toe te voegen. Gebruik voor de nulstandaard 100 μL monsterbuffer.
      2. Etiketteer 3 borosilicaatglasbuizen (12 x 75 mm) voor elk verdund monster dat moet worden getest. Sorteer en schik de monsterbuizen dienovereenkomstig in het buizenrek. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 100 μL of 200 μL om nauwkeurig 100 μL van het monster toe te voegen aan elke overeenkomstige monsterbuis.
      3. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 1000 μL om nauwkeurig 875 μL assaybuffer toe te voegen aan alle testbuizen: de normen en de monsters.
   7. Om de testreactie te starten, gebruikt u een gekalibreerde micropipette van 100 μL om nauwkeurig 25 μL 1% TNBS aan elke testbuis toe te voegen. Begin met de nul standaardbuizen, ga naar de standaardbuizen in volgorde van toenemende concentratie en vervolgens naar de monsterbuizen volgens de vooraf bepaalde volgorde. Verander tips bij het starten van een nieuwe standaard of een nieuw monster en houd de tijd die wordt besteed aan het toevoegen van TNBS aan alle buizen binnen 5 minuten.
      1. Vortex alle testbuizen gedurende 2 s met hoge snelheid of met een snelheidsinstelling waardoor de vloeistof in de testbuis naar boven kan wervelen om een hoogte van 1/2 inch van de buisopening te bereiken.
      2. Noteer de starttijd van de test en stel de timer in op 2 uur. Plaats het assaybuisrek gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur. Wanneer de tijd voorbij is, vortex je alle buizen nog een keer en ga je verder met het verzamelen van gegevens.
   8. Dataverzameling
      1. Laat de UV/VIS-spectrofotometer opwarmen en de basislijn stabiliseren. Stel de detectiegolflengte in op 500 nm voor de hydrazidetest. Gebruik een kwartscuvet van 1 ml van 1 cm pathlengte voor alle absorptiemetingen voor de gehele test.
      2. Begin de gegevensverzameling door een nulstandaardtest over te brengen naar de cuvette; leeg het instrument (stel de absorptie in op nul).
      3. Voer één keer uit op elke buis en noteer de absorptiewaarden in een gegevenstabel. Verwijder alle resterende vloeistof uit de cuvette voordat u een nieuw monster leest. Begin met de nulnormen, ga naar de normen van toenemende concentratie en vervolgens naar de monsters. Eenmaal gestart, voert u alle stappen efficiënt uit zonder te stoppen en leest u alle buizen binnen 10 minuten.
   9. Voorbeeldgegevens analyseren
      1. Maak een standaardcurve door mM hydrazide standaard vs. A_{500 te plotten.} Zoek de standaardcurvevergelijking in de vorm van y = ax + b, waarbij y mM hydrazide vertegenwoordigt en x A₅₀₀. Zie figuur 4 voor een typische standaardcurve.
      2. Bereken mM hydrazide in de monsters met behulp van de standaardcurvevergelijking, waarbij de verdunningsfactoren worden aangepast. Kies voor de berekening alleen de monstertestbuizen met A_500-waarden die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen.
      3. Bereken de molaire verhouding van hydrazide/polysaccharide met behulp van vergelijking (1).
         Hydrazide/polysaccharide = h / c × MW (1)
         Waarbij h de mM hydrazide is, c de mg/ml concentratie van de polysacharide en MW het polysaccharide molecuulgewicht in kDa.
      4. Bereken de hydrazide-etiketteringsdichtheid per 100 kDa polysaccharide met behulp van vergelijking (2).
         Etiketteringsdichtheid per 100 kDa polysaccharide = h / c × 100 (2)
         Waarbij h de mM hydrazide is en c de mg/ml concentratie van de polysacharide.
         OPMERKING: Voor het gemak kunnen de polysacchariden worden beschouwd als een molecuulgewicht van 100.000 dalton. Dit maakt het mogelijk om een "etiketteringsdichtheid" te overwegen bij het vergelijken van het niveau van derivatisatie van verschillende polysacchariden.
      5. Bereken de hydrazide-etiketteringsdichtheid als gewichtspercentage ADH.
         1. Bepaal de effectieve mg/ml-concentratie van ADH met behulp van vergelijking(3).
            mg/ml ADH = (mM hydrazide / 1000) × 174 (3)
            waarbij 174 de MW van ADH is.
         2. Bereken het gewichts % ADH met behulp van vergelijking (4).
            gewicht % ADH = (mg/ml ADH) / (mg/ml polysaccharide) × 100 (4)

Resultaten

Om de activering en derivatisatie van een polysaccharide met behulp van CDAP-chemie te illustreren, werd dextran geactiveerd bij 0,25 en 0,5 mg CDAP / mg dextran. Voor elke reactie werd een dextranoplossing van 10 mg/ml in water gekoeld op ijs en werd 1/10^e volume van een DMAP-voorraad van 2,5 M (bereid zoals beschreven in rubriek 3) toegevoegd. De uiteindelijke oplossing werd op pH 9 gebracht door de toevoeging van 0,1 M NaOH in 10 μL aliquots. De oplossing werd gekoeld en geroerd, CDAP toegevoegd en de pH op pH 9 gehouden door toevoeging van 10 μL aliquots van 0,1 M NaOH gedurende 15 min. Slechts 0,25 ml van 0,5 M ADH bij pH 9 werd toegevoegd (minder dan de gebruikelijke hoeveelheid) en de reactie kon 's nachts bij 4 °C doorgaan.

De gelabelde dextran werd vervolgens sequentieel gedialyseerd tegen 1 M NaCl, 0,15 M NaCl en water zoals beschreven in rubriek 6. De ADH-dextran werd vervolgens getest op dextran met behulp van de resorcinol/zwavelzuurtest (rubriek 7.2). Een typische standaardcurve met glucose als suikerstandaard wordt weergegeven in figuur 4A. Het hydrazidegehalte werd bepaald met behulp van de TNBS-test beschreven in rubriek 7.3. Een typische hydrazide standaardcurve met ADH als standaard wordt gegeven in figuur 4B.

Representatieve berekeningen van de activering van dextran op de twee activeringsniveaus zijn weergegeven in figuur 4A(B). De gegevens worden gepresenteerd als zowel hydraziden per 100 kDa dextranpolymeer als als gewichtspercentage van ADH tot dextran, zoals beschreven in respectievelijk rubrieken 7.9.3.4 en 7.9.3.5 in figuur 4C. De mate van derivatisatie verdubbelde ongeveer naarmate de CDAP-ratio werd verdubbeld.

Figuur 1: Chemische structuur van CDAP. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Proces van CDAP-activering en -conjugatie. Het proces is conceptueel verdeeld in twee fasen, waarbij de geactiveerde polysaccharide voor beide geldt. Onder basisomstandigheden activeert CDAP polysaccharidehydroxylen, waardoor DMAP (reactie 1) vrijkomt. CDAP-hydrolyse geeft ook DMAP (reactie 3) vrij. Hoewel een cyano-ester wordt getoond, is dit mogelijk niet het eigenlijke tussenproduct. Het tussenproduct wordt daarom aangeduid als (CDAP) "geactiveerde" polysaccharide. Tijdens de eerste activeringsfase kan de geactiveerde polysacharide hydrolyseren (reactie 4) of nevenreacties ondergaan (reactie 5). In de tweede conjugatiefase (reactie 2) reageert de geactiveerde polysacharide met een amine om naast reacties 4 en 5 ook een stabiele isoureabinding te vormen. Afkortingen: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; R-NH₂ = amine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: CDAP activering en conjugatie. Het proces vereist het balanceren van CDAP-reactiviteit met de polysaccharide, de stabiliteit van de CDAP en geactiveerde polysaccharide, evenals de reactiviteit van de geactiveerde polysaccharide met die van de amine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten voor CDAP-activering van dextran. Typische standaardcurven voor de (A) resorcinol/zwavelzuur en (B) TNBS assays. De testresultaten voor dextran geactiveerd met 0,25 en 0,5 mg CDAP/mg dextran worden getoond. Glucose werd gebruikt als de standaard voor de resorcinol-test. Dextran, in mg/ml, wordt gedeeld door 100 kDa om een molaire concentratie te geven. De hydrazideconcentratie wordt bepaald met behulp van ADH als standaard en de resultaten uitgedrukt als μM Hz. (C) Berekening van hydrazide: dextran-verhoudingen. Het niveau van derivatisatie werd berekend als hydraziden per 100 kDa dextran om de vergelijking tussen polymeren van verschillende gemiddelde molecuulgewichten te vergemakkelijken. De % gewichtsverhouding van g ADH/g dextran werd berekend met behulp van een MW van 174 g/mol voor ADH. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

CDAP is een handig reagens om polysacchariden te derivatiseren en te conjugeren. Dit artikel beschrijft de algemene methode om CDAP te gebruiken om polysacchariden te derivatiseren met hydraziden (PS-ADH) en bevat recent gepubliceerde^{verbeteringen 8}. Ten eerste benadrukt de techniek het belang van het handhaven van de doel-pH om het activeringsproces te beheersen. We ontdekten dat hoewel veel voorkomende buffers de CDAP-activeringsreactie verstoren, DMAP met succes kan worden gebruikt als buffer om de pH⁸te beheren. Bovendien is DMAP al een reactiebijproduct van CDAP-activering. Ten slotte vergemakkelijkt het bufferen van de polysaccharide-oplossing met DMAP voordat de CDAP wordt toegevoegd, nauwkeurige targeting en onderhoud van de pH van de reactie. Zoals we beschrijven, is het nuttig om de pH van de geconcentreerde DMAP-stamoplossing zodanig aan te passen dat deze bij verdunnen de beoogde pH bereikt. Ten tweede vertraagde het uitvoeren van het proces in de kou de reactietijd, waardoor het activeringsproces minder hectisch en vergevingsgezinder werd. Lagere temperatuur verlaagde de snelheid van CDAP-hydrolyse en de optimale activeringstijd bij pH 9 neemt toe van ~ 3 min tot ~ 15 min. Bovendien is er minder CDAP nodig om hetzelfde activeringsniveau te bereiken dan bij kamertemperatuur.

ADH-gederivatiseerde polysacchariden kunnen worden geconjugeerd aan eiwitten met behulp van carbodiimiden (bijv. EDAC)⁷. Verschillende gelicentieerde Haemophilus influenzae b (Hib) -vaccins gebruiken bijvoorbeeld het polyribosylribitolfosfaat (PRP) gederivatiseerd met ADH om te conjugeren naar tetanustoxoïde met behulp van EDAC. CNBr werd aanvankelijk gebruikt, maar CDAP is een veel gemakkelijker reagens om voor dit doel te gebruiken. In onze ervaring is een goed doelbereik voor ADH-derivatisatie 10-30 hydraziden per 100 kDa polysaccharide of ~ 1-3% ADH per gewicht.

Hetzelfde proces kan worden gebruikt om polysacchariden te derivatiseren met primaire amines door de ADH te vervangen door een diamine. Het wordt aanbevolen om hexaandiamine te gebruiken om polysacchariden met amines te derivatiseren⁸. De verontreinigde polysacharide (PS-NH₂) kan worden geconjugeerd met behulp van reagentia die zijn ontwikkeld voor eiwitconjugatie¹¹. Meestal wordt de PS-NH₂ gederivatiseerd met een maleimide (bijv. Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) of N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), en het eiwit wordt ge thioleerd (bijv. Met succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionaat (SPDP)). Thiol-maleimide chemie is zeer efficiënt.

Eiwitten kunnen ook direct worden gekoppeld aan CDAP-geactiveerde polysacchariden via het ɛ-amine op lysines. Hoewel het gebruikte activeringsprotocol over het algemeen vergelijkbaar is met het hier beschreven protocol, is het noodzakelijk om het niveau van activering, polysaccharide en eiwitconcentratie te optimaliseren, evenals de eiwit: polysaccharide-verhouding^5,6,8.

Dextran is een van de gemakkelijkste polysacchariden om te activeren met CDAP vanwege de relatief hoge dichtheid van hydroxylgroepen, maar sommige polysacchariden, zoals Vi-antigeen, kunnen een uitdaging zijn. Bijgevolg is er geen enkel "beste" protocol voor CDAP-conjugatie rechtstreeks naar eiwitten. We stellen voor om eerst een protocol te ontwikkelen om geschikte niveaus van activering te bereiken, zoals bepaald door de mate van hydrazide-derivatisatie, en vervolgens over te gaan tot directe eiwitconjugatie naar CDAP-geactiveerd polysaccharide.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetonitrile	Sigma	34851
Adipic acid dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	MW cutoff kan 30 kDa zijn voor 200 kDa PS
Analytische weegschaal
Autotitrator of elektronische pijp
Kolf   2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122,2
Vlokijs
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Micro roerstaaf	VWR	76001-878
Microfuge buis (voor CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH-meter
pH-sonde	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH-temperatuursonde
Pijpetten & tips
Zoutoplossing of PBS
Kleine kolf 5-20 mL	VWR	10754-696	Een 10 mL kolf geeft ruimte voor pH-sonde & pijp
Klein ijsemmertje
Kleine spatel
Rolplaat
Resorcinol-test
Combitip	Eppendorf	10 ml
DI-water
Dialyseslang	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Dialyseslangklemmen	Repligen	142150
Verwarmingsblok
Nitrilhandschoenen	VWR
Repeat pijp	Eppendorf	M4
Resorcinol	Sigma	398047
Suiker standaard		Zoals passend
Zwavelzuur 75%	VWR	BT126355-1L
Timer
TNBS-test
Adipic dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Borosilicate testbuizen 12 x 75	VWR	47729-570
Natriumboraat, 0,5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293,17