Hier presenteren we een protocol om een compressiemodel voor het ruggenmerg van ratten te genereren, de gedragsscore te beoordelen en het gecomprimeerde ruggenmerggebied te observeren. De gedragsbeoordelingen toonden een verminderde motorische handicap aan. Hematoxyline- en eosinekleuring en immunokleuring onthulden aanzienlijke neuronale apoptose in het gecomprimeerde gebied van het ruggenmerg.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een neuronaal apoptosemodel geïnduceerd door compressie van het ruggenmerg bij ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Als een ernstige progressieve degeneratieve ziekte heeft cervicale spondylotische myelopathie (CSM) een slechte prognose en wordt het geassocieerd met fysieke pijn, stijfheid, motorische of sensorische disfunctie en een hoog risico op ruggenmergletsel en acroverlamming. Er is dus dringend behoefte aan therapeutische strategieën die een efficiënte regeneratie van het ruggenmerg bij deze chronische en progressieve ziekte bevorderen. Effectieve en reproduceerbare compressiemodellen voor het ruggenmerg bij dieren zijn nodig om het complexe biologische mechanisme dat aan de basis ligt van CSM te begrijpen. De meeste modellen voor ruggenmergletsel weerspiegelen acute en structurele destructieve aandoeningen, terwijl diermodellen van CSM een chronische compressie in het ruggenmerg vertonen. Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van een compressiemodel voor het ruggenmerg van ratten, dat verder werd geëvalueerd door de gedragsscore te beoordelen en het gecomprimeerde ruggenmerggebied te observeren. De gedragsbeoordelingen toonden een verminderde motorische handicap aan, waaronder gewrichtsbewegingen, stapvermogen, coördinatie, rompstabiliteit en spierkracht van de ledematen. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en immunokleuring onthulden aanzienlijke neuronale apoptose in het gecomprimeerde gebied van het ruggenmerg.
Inleiding
Als een veel voorkomende progressieve degeneratieve ziekte is CSM verantwoordelijk voor 5-10% van alle cervicale spondylose1. Als patiënten die aan CSM lijden hun symptomen negeren en deze niet tijdig en effectief behandelen, kan dit leiden tot ernstige complicaties, zoals ruggenmergletsel en verlamming van ledematen, die zouden verslechteren met het ouder worden, wat een aanzienlijke economische en mentale last vormt voor patiënten en hun families 2,3. De pathogenese van CSM is complex en omvat statische en dynamische factoren, de hypoxie-ischemietheorie, endotheelcelbeschadiging, de theorie van de vernietiging van de bloedruggenmergbarrière en de ontstekings- en apoptosetheorie 4,5,6,7.
De statische en dynamische mechanismen van compressie op het ruggenmerg veroorzaken klinische symptomen. Uitstekende wervelschijven, misvormde wervellichamen en verkalkte ligamenten kunnen langdurige compressie van het ruggenmerg veroorzaken, wat geleidelijk de bloed-ruggenmergbarrière en de lokale microvasculatuur in het ruggenmerg zal aantasten 4,8. Ischemie, ontsteking en apoptose tasten op hun beurt de neuronen, axonen en gliacellenaan 6,9.
De experimentele diermodellen van ruggenmergletsel omvatten kneuzend letsel, drukletsel, tractieletsel, fotochemisch geïnduceerd letsel en ischemie-reperfusieletsel. De meeste van deze modellen weerspiegelen ook enkele acute en structurele destructieve omstandigheden (doorsnede of chemische toxiciteit). Deze diermodellen van CSM kunnen echter geen progressieve neuronale apoptose in het ruggenmerg vertonen.
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van een compressiemodel voor het ruggenmerg van ratten, dat verder werd geëvalueerd door de gedragsscore te beoordelen en het gecomprimeerde gebied van het ruggenmerg te observeren. Dit compressiemodel voor het ruggenmerg van ratten is een betrouwbaar diermodel voor verder onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij CSM.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De volgende procedure werd uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Alle overlevingsoperaties werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden zoals uiteengezet in de NIH-richtlijnen. Pijn en het risico op infecties werden behandeld met de juiste pijnstillers en antibiotica om een succesvol resultaat te garanderen. Deze chirurgische ingreep is geoptimaliseerd voor Sprague-Dawley (SD) gekruiste mannelijke ratten op een leeftijd van 12 weken en een gewicht van 400 g.
1. PVA-polyacrylamide hydrogel preparaat
OPMERKING: Zoals weergegeven in Figuur 1G, 1H, is de PVA-polyacrylamide hydrogel een waterabsorberende polymeerplaat. In de natuurlijke staat is de gel uiterst moeilijk in kleine stukjes te snijden. Het preparaat wordt als volgt beschreven.
- Plaats een PVA-polyacrylamide hydrogel 24 uur in water om het snijden na hydratatie te vergemakkelijken.
- Gebruik een zelfgemaakt snijgereedschap (Figuur 1H) om de hele hydrogel in stukken te verdelen, met een afmeting van 2 mm x 2 mm x 2 mm.
- Breng deze hydrogelstukjes over in een oven op 60 °C gedurende 12 uur voor uitdroging in kleine stukjes van 1 mm x 1 mm x 1 mm als implantatiemateriaal.
2. Anesthesie en voorbereiding
OPMERKING: Zorg ervoor dat u tijdens het steriele chirurgische proces een chirurgische kap, medische wegwerpmaskers en steriele chirurgische handschoenen draagt.
- Leg de rat op een verwarmingskussen en zorg ervoor dat de rectale temperatuur tijdens de narcose op 37±1 °C blijft.
- Plaats de rat gedurende 3 minuten in de anesthesiekamer gevuld met 3% isofluraan.
- Knijp voorzichtig in de ledematen en tenen van de rat met een pincet om te testen op verlies van ontwenningsreactie, wat wijst op succesvolle anesthesie.
- Bevestig de rat in buikligging op de operatietafel en zorg ervoor dat de ledematen en het hoofd van de rat stevig vastzitten.
- Bevestig het anesthesiemasker op het gezicht van de rat. Dien 2% isofluraan toe in een zuurstof/luchtmengsel via een standaard neusmasker van de rat om de rat te verdoven tijdens de compressieoperatie van de wervelkolom.
- Plaats een cilindrisch gaasje (afmeting van ongeveer 30 mm x 20 mm x 60 mm) tussen de rat en de operatietafel (Figuur 1A) om een onbelemmerde luchtweg en volledig blootgestelde operatieplaats tijdens de operatie te garanderen.
- Scheer het haar rond het operatiegebied van de nek van de rat met een elektrisch scheerapparaat.
- Breng ontharingscrème aan om de resterende haren te verwijderen en de huid bloot te leggen.
- Desinfecteer het operatiegebied met jodofoor.
- Bedek het gedesinfecteerde gebied met een steriele handdoek met een gat dat alleen het operatiegebied aan de dorsale zijde van de nek van de rat blootlegt.
3. Chirurgische aanpak
- Maak een longitudinale incisie in de dorsale middellijn met een scalpel van de tweede processus cervicale spinosus naar de tweede processus thoracale spinosus, na percutane positionering van de tweede processus cervicale spinosus en de tweede processus thoracale spinosus.
- Blunt scheidt de spieren van beide zijden met een hemostatische tang om de C2-T2-lamina bloot te leggen na het laag voor laag doorsnijden van onderhuids weefsel en fascia.
- Boor een gat (1 mm x 1 mm) op de cervicale laminaat (Figuur 1B).
OPMERKING: Om overmatig letsel aan het ruggenmerg te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de nek van de rat in een dorsale boogtoestand wordt gehouden, zodat er voldoende ruimte is tussen de cervicale lamina's. - Gebruik een microchirurgische tang om een stuk PVA-polyacrylamide hydrogel van 1 mm x 1 mm x 1 mm vast te pakken en steek het in het eerder geboorde gat (Figuur 1C, 1D).
OPMERKING: Voorbijgaande spiertrekkingen geven aan dat het compressiemodel voor het ruggenmerg met succes is vastgesteld. - Hecht de spier-, fascia-, onderhuidse en huidweefsels laag voor laag, met behulp van driehoekige naalden en 5-0 hechtdraad.
- Breng de dieren na desinfectie terug naar de kooi en houd ze warm.
- Injecteer subcutaan buprenorfinehydrochloride-analgesie (0,03 mg/kg) elke 6 uur gedurende 3 dagen na de operatie en indien nodig daarna.
4. Postoperatieve behandeling
- Injecteer eenmaal per dag een equivalent van 100.000 eenheden penicilline intraperitoneaal in de ratten om postoperatieve infectie te voorkomen en pijn te verlichten.
- Breng de ratten over naar nieuwe kooien die continu zijn verwarmd met een infraroodlamp om ervoor te zorgen dat de warmte na de operatie voldoende behouden blijft.
OPMERKING: Verwijder de verwarmingslamp nadat het bewustzijn van de rat is hersteld - Zorg voor hygiëne en ventilatie van de voerkooi van de rat.
- Help de ratten twee keer per dag met eten en drinken. Indien nodig kunt u een blaasmassage toedienen om het plassen te vergemakkelijken totdat de urinefunctie is hersteld.
5. Gedragsbeoordeling
- Gebruik de beoordelingsschaal Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) om postoperatief gedrag te beoordelen.
OPMERKING: De BBB-beoordelingsschaal is een gouden standaard (tabel 1) die wordt gebruikt om de functie van het ruggenmerg bij ratten te evalueren. Het beoordeelt de beweging van ratten aan de hand van scores variërend van 0 (er werd geen beweging van de achterpoten waargenomen) tot 21 (loopcoördinatie, consistentie van de teenruimte, hoofdklauwpositie parallel in de hele houding, consistente rompstabiliteit en consistente staarthoogte).
6. Test van de grijpkracht
- Gebruik een elektronische grijpkrachtmeter om de grijpkracht te meten.
- Pak de onderste helft van de rat vast om de rat op te hangen en laat hem de metalen staaf van de voorste greepmeter vastpakken.
- Wanneer de rat de metalen staaf vastpakt, trekt u deze weg en registreert u de grijpkracht.
- Meet de grijpkracht drie keer voor elke rat en noteer de hoogste score.
7. Test van de schuine plaat
- Plaats de rat op een rubberen plaat met een verstelbare hoek.
- Verhoog de schuine plaathoek geleidelijk met telkens 5° totdat de rat erin slaagt om 5 s in evenwicht te blijven en stevig te staan.
- Noteer de maximale hoek waaronder de rat zichzelf kan balanceren op de schuine plaat.
- Meet drie keer de maximale hoek voor elke rat en noteer de hoogste score.
8. Euthanasie, scheiding van het ruggenmerg en bevroren inbedding
NOTITIE: Zorg ervoor dat een geschikte oogveiligheidsbril en gelaatsscherm/masker worden gedragen om de ogen, het gezicht en de luchtwegen te beschermen tegen paraformaldehyde en formaldehydegas.
- Injecteer een equivalent van 10% chloraalhydraat intraperitoneaal om de ratten te verdoven voordat u het borstbeen opent om het hart bloot te leggen.
- Steek een perfusienaald in de top van het hart, fixeer deze met een hemostatische tang en giet langzaam met normale zoutoplossing.
- Boor een gat in het rechter atriumaanhangsel totdat er een schone, normale zoutoplossing uit het rechter atrium stroomt, wat wijst op een succesvolle infusie.
- Stop de normale perfusie van zoutoplossing nadat de lever wit is geworden.
- Infuseer met een equivalent van 10% paraformaldehyde totdat het lichaam van de rat stijf wordt.
- Verwijder na paraformaldehydeperfusie de huid, spieren en zachte weefsels rond de wervelkolom; scheid het C2-C7-segment van de cervicale wervelkolom; En dompel het onder in 10% paraformaldehyde voor fixatie 's nachts.
- Scheid het cervicale ruggenmerg van de wervelkolom en plaats het in een concentratiegradiënt van 10%, 20% en 30% sucrose-oplossingen voor geleidelijke uitdroging.
- Breng het gecomprimeerde ruggenmerg van 2 mm hoogte samen met een OCT-inbeddingsmiddel over in een vriezer van -80 °C.
- Na het doorsnijden in plakjes van 7 μm dik en het kleuren (H&E-kleuring en dUTP nick end labeling (TUNEL)/neuronale kernen (NeuN), zie rubriek 9), observeer de histopathologie van respectievelijk het ruggenmerg en neuronale apoptose.
9. TUNEL/NeuN immunokleuring
- Dompel de delen van het ruggenmerg 10 minuten onder in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur en blokkeer vervolgens gedurende 1 uur met PBS-oplossing die 0,3% Triton X-100 en 5% runderserumalbumine (BSA) bevat.
- Incubeer de delen van het ruggenmerg met een polyklonaal anti-NeuN-antilichaam bij konijnen (verdund 1:200;) 's nachts bij 4 °C.
- Spoel de delen van het ruggenmerg drie keer af in PBS. Incubeer vervolgens met Alexa Fluor 594-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Voer de eenstaps TUNEL-apoptose-testkit (groene fluorescentie) uit om de apoptotische kernen van de ruggenmergsecties te kleuren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ruggenmergcompressieletsel kan leiden tot neuromusculaire invaliditeit in ledematen
Naarmate het hydrogelstuk geleidelijk uitzet, drukt het het ruggenmerg gedurende een langere periode aanhoudend samen, wat de handicaps van de voorpoten simuleert die worden veroorzaakt door cervicale ruggenmergaandoeningen 8,10. In het huidige model werd bij de meeste ratten (9/10) in de modelgroep een aanzienlijke ipsilateral...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van deze chirurgische ingreep was het genereren van reproduceerbare, langdurige, neurale apoptose in het ruggenmerg van de rat. Een belangrijk voordeel van dit model is dat de uitbreidbare hydrogelimplantaten zorgen voor een langdurige compressie van het ruggenmerg, wat leidt tot een progressieve neurale apoptotische respons (Figuur 2C), die consistent is met het pathologische proces van CSM. In de huidige studie was de mortaliteit door dwarslaesie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken en stellen dat er geen beperkingen zijn op volledige toegang tot al het materiaal dat in dit onderzoek is gebruikt.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het National Key R&D Program of China (2018YFC1704300), National Natural Science Foundation of China (81930116, 81804115, 81873317 en 81704096), Shanghai Sailing Program (18YF1423800), Natural Science Foundation of Shanghai (20ZR1473400). Dit project werd ook ondersteund door de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2019LK057).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antibiotic ointment | Voorkom wondinfectie | ||
| Buprenorphine-SR | Pijnverlichting | ||
| Isofluraan | Veteasy | Anesthesie | |
| Inhalatie-anesthesiegereedschap | Anesthesie | ||
| Micro oogheelkundig forceps | Mingren medisch apparatuur | Lengte: 11 cm, Diameter kop: 0,3 mm | Klem de spier |
| Oogheelkundig forceps | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Chirurgische Instrumentenfabriek | JD1050 | Klem de huid |
| Oogheelkundig schaar (10 cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Chirurgische Instrumentenfabriek | Y00030 | Huidincisie |
| SD mannelijke ratten | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | SCXK2018-0004 | Diermodel |
| Steriele chirurgische bladen (22#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Spier incisie |
| Kleine dieren trimmer | Haarverwijdering | ||
| Veet haarverwijderingscrème | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | Haarverwijdering | |
| Venus schaar | Mingren medisch apparatuur | Lengte: 12,5 cm | Spier incisie |
Referenties
- Lebl, D. R., Bono, C. M. Update on the diagnosis and management of cervical spondylotic myelopathy. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 23 (11), 648-660 (2015).
- Haddas, R., et al. Spine and lower extremity kinematics during gait in patients with cervical spondylotic myelopathy. The Spine Journal. 18 (9), 1645-1652 (2018).
- Song, D. W., Wu, Y. D., Tian, D. D. Association of Vdr-Foki and Vdbp-Thr420 Lys polymorphisms with cervical spondylotic myelopathy: A case-control study in the population of China. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (2), 22669(2019).
- Kurokawa, R., Murata, H., Ogino, M., Ueki, K., Kim, P. Altered blood flow distribution in the rat spinal cord under chronic compression. Spine. 36 (13), 1006-1009 (2011).
- Wen, C. Y., et al. Is Diffusion anisotropy a biomarker for disease severity and surgical prognosis of cervical spondylotic myelopathy. Radiology. 270 (1), 197-204 (2014).
- Long, H. Q., Li, G. S., Hu, Y., Wen, C. Y., Xie, W. H. Hif-1A/Vegf signaling pathway may play a dual role in secondary pathogenesis of cervical myelopathy. Medical Hypotheses. 79 (1), 82-84 (2012).
- Karadimas, S. K., Erwin, W. M., Ely, C. G., Dettori, J. R., Fehlings, M. G. Pathophysiology and natural history of cervical spondylotic myelopathy. Spine. 38, 21-36 (2013).
- Wilson, J. R., et al. State of the art in degenerative cervical myelopathy: an update on current clinical evidence. Neurosurgery. 80, 33-45 (2017).
- Baptiste, D. C., Fehlings, M. G. Pathophysiology of cervical myelopathy. The spine Journal. 6, 190-197 (2006).
- Wilcox, J. T., et al. Generating level-dependent models of cervical and thoracic spinal cord injury: exploring the interplay of neuroanatomy, physiology, and function. Neurobiology of Disease. 105, 194-212 (2017).
- Takano, M., et al. Inflammatory cascades mediate synapse elimination in spinal cord compression. Journal of Neuroinflammation. 11, 40(2014).
- Hu, Y., et al. Somatosensory-evoked potentials as an indicator for the extent of ultrastructural damage of the spinal cord after chronic compressive injuries in a rat model. Clinical Neurophysiology. 122 (7), 1440-1447 (2011).
- Yang, T., et al. Inflammation level after decompression surgery for a rat model of chronic severe spinal cord compression and effects on ischemia-reperfusion injury. Neurologia Medico-Chirurgica. 55 (7), 578-586 (2015).
- Ijima, Y., et al. Experimental rat model for cervical compressive myelopathy. Neuroreport. 28 (18), 1239-1245 (2017).
- Yamamoto, S., Kurokawa, R., Kim, P. Cilostazol, a selective type iii phosphodiesterase inhibitor: prevention of cervical myelopathy in a rat chronic compression model. Journal of Neurosurgery. Spine. 20 (1), 93-101 (2014).
- Holly, L. T., et al. Dietary therapy to promote neuroprotection in chronic spinal cord injury. Journal of Neurosurgery. Spine. 17 (2), 134-140 (2012).
- Zhao, P., et al. In vivo diffusion tensor imaging of chronic spinal cord compression: a rat model with special attention to the conus medullaris. Acta Radiologica. 57 (12), 1531-1539 (2016).
- Kurokawa, R., Nagayama, E., Murata, H., Kim, P. Limaprost alfadex, a prostaglandin E1 derivative, prevents deterioration of forced exercise capability in rats with chronic compression of the spinal cord. Spine. 36 (11), 865-869 (2011).
- Lee, J., Satkunendrarajah, K., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel rat model of cervical spondylotic myelopathy: the impact of chronic cord compression on clinical, neuroanatomical, and neurophysiological outcomes. Journal of Neurotrauma. 29 (5), 1012-1027 (2012).
- Chen, B., et al. Reactivation of dormant relay pathways in injured spinal cord by Kcc2 manipulations. Cell. 174 (3), 521-535 (2018).
- Yu, W. R., Liu, T., Kiehl, T. R., Fehlings, M. G. Human neuropathological and animal model evidence supporting a role for Fas-mediated apoptosis and inflammation in cervical spondylotic myelopathy. Brain. 134, 1277-1292 (2011).
- Yu, W. R., et al. Molecular mechanisms of spinal cord dysfunction and cell death in the spinal hyperostotic mouse: implications for the pathophysiology of human cervical spondylotic myelopathy. Neurobiology of Disease. 33 (2), 149-163 (2009).
- Iyer, A., Azad, T. D., Tharin, S. Cervical spondylotic myelopathy. Clinical Spine Surgery. 29 (10), 408-414 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
