Methodenartikel

Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62605

⸱

14 mei 2021

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol voor immunofluorescente etikettering van zowel plantaardige viruseiwitten als vectorinsecteneiwitten in weggesneden insectendarmen kan worden gebruikt om interacties tussen virus- en vectorinsecten, insecteneiwitfuncties en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan virusoverdracht te bestuderen.

Samenvatting

De meeste plantenvirussen in de natuur worden van de ene plant op de andere overgedragen door hemipteran insecten. Een hoge bevolkingsdichtheid van de vectorinsecten die zeer efficiënt zijn in virusoverdracht speelt een sleutelrol bij virusepidemieën in velden. Het bestuderen van virus-insect vectorinteracties kan ons begrip van virusoverdracht en epidemieën verbeteren met als doel nieuwe strategieën te ontwerpen om plantenvirussen en hun vectorinsecten te beheersen. Immunofluorescentie-etikettering is op grote schaal gebruikt om interacties tussen pathogenen en gastheren te analyseren en wordt hier gebruikt in de white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), die efficiënt het zuidelijke rijstzwart gestreepte dwergvirus (SRBSDV, genus Fijivirus, familie Reoviridae) overbrengt, om de virionen en insecteneiwitten in de midgutepitheelcellen te lokaliseren. Met behulp van laserscanning confocale microscopie bestudeerden we de morfologische kenmerken van midgut-epitheelcellen, cellulaire lokalisatie van insecteneiwitten en de colocalisatie van virionen en een insecteneiwit. Dit protocol kan worden gebruikt om virusactiviteiten bij insecten, functies van insecteneiwitten en interacties tussen virus en vectorinsect te bestuderen.

Inleiding

De meeste beschreven plantenvirussen worden overgedragen door insecten uit de orde Hemiptera die bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en tripsomvat 1,2. De piercing-zuigende monddelen van hemipteran-insecten doorboren het plantenweefsel voor het voeden en afscheiden van speeksel, waardoor het virus tegelijkertijd efficiënt wordt overgedragen2. Verschillende overdrachtsmechanismen van plantenvirussen door vectorinsecten zijn beschreven. Deze omvatten niet-persistent, semipersistent en persistent. Het persistente type is niet-propagatief of voortplantingsf3,4, maar voor beide typen moet het overgedragen virus door het lichaam van het insect bewegen. In de persistent-propagatieve modus infecteren en repliceren virussen aanvankelijk in de epitheelcellen van de darm van het insect, verspreiden zich vervolgens in verschillende weefsels en uiteindelijk in de speekselklieren, van waaruit ze vervolgens via het speeksel in een plant kunnen worden geïntroduceerd tijdens insectenvoeding 5,6. Persistente overgedragen virussen bewegen zich door verschillende organen en repliceren in hun insectenvectoren, wat specifieke interacties tussen virus- en vectorcomponenten in verschillende stadia vereist 7,8.

Virale eiwitten en insecteneiwitten moeten interageren om kritieke processen voor virusherkenning, infectie, replicatie of verspreiding in de vectorinsectente vergemakkelijken 9,10. Hoewel optische microscopie kan worden gebruikt om cellulaire structuren bij insecten te observeren, kan het geen virionverdeling, cellulaire lokalisatie of colocalisatie van virale eiwitten en insecteneiwitten, of de ultrastructuur van insectenweefsels en -cellen laten zien. Immunofluorescentie-etikettering werd voor het eerst uitgevoerd door Coons et al. in de fagocytische cellen van de muis door middel van het labelen van specifieke fluoresceïne-antilichamen, en nu wordt het op grote schaal gebruikt11. De immunofluorescentietechniek, ook bekend als de fluorescentie-antilichaamtechniek, is een van de vroegste immunologische etiketteringstechnieken die is ontwikkeld en is gebaseerd op de specifieke bindingsreactie tussen het antigeen en het antilichaam11,12. Het bekende antilichaam wordt eerst gelabeld met fluoresceïne, dat wordt gebruikt als een sonde om de overeenkomstige antigenen in de cellen of weefsels te detecteren13,14. Nadat het fluoresceïne-gelabelde antilichaam zich bindt aan het overeenkomstige antigeen in cellen of weefsels, zal de sonde heldere fluorescentie uitzenden wanneer bestraald met excitatiegolflengten en bekeken met een fluorescentiemicroscoop om het antigeen15 te lokaliseren.

De meeste vectorinsecten van plantenvirussen zijn hemipterans. Een hogere populatiedichtheid van vectorinsecten met een hoge transmissie-efficiëntie voor het plantenvirus kan leiden tot virusepidemieën5. Zuidelijk rijstzwart gestreept dwergvirus (SRBSDV, geslacht Fijivirus, familie Reoviridae), een van de ernstigste ziekteverwekkers van rijst, heeft zich snel verspreid over rijstteeltgebieden in Oost- en Zuidoost-Azië en veroorzaakte ernstige opbrengstverliezen sinds 201016,17. Volwassenen en nimfen van de witrugplanthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) brengen SRBSDV op rijst over op een persistent-vermeerderingsve manier met een hoge efficiëntie. Veldstudies hebben aangetoond dat uitbraken van SRBSDV-geïnduceerde rijstzwart gestreepte dwergziekte meestal samenvallen met massale langeafstandsmigratie van WBPHs, een cruciale factor in SRBSDV-epidemieën 7,8,18. Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) is een oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment protein receptor (SNARE), die het transport van stoffen via vesikelfusie kan bemiddelen. VAMP7 interageert in vitro met het buitenste belangrijke capsid-eiwit van SRBSDV, wat aangeeft dat VAMP7 nauw geassocieerd kan zijn met virusoverdracht16.

In het hier gepresenteerde protocol hebben we de darm uit virulifere WBPH weggesneden als voorbeeld om SRBSDV-virionen en VAMP7 in midgut-epitheelcellen te labelen16. Als de eerste invasieplaats van het virus speelt het midgut-epitheel een vitale rol bij virusinfectie, replicatie en overdracht. Eerst hebben we de stappen beschreven om de darm te verwijderen van nimfen en volwassenen van WBPHs. Ten tweede gebruikten we specifieke fluoresceïne-gelabelde antilichamen om SRBSDV-virionen en VAMP7 in darmepitheelcellen te labelen. Vervolgens observeerden we epitheelcellen en de cellulaire locatie van de virionen en VAMP7 via een laserscannende confocale microscoop. De resultaten toonden aan dat SRBSDV-virionen en VAMP7 konden colokaliseren in het cytoplasma van de midgutepitheelcellen, wat suggereert dat de specifieke functie van VAMP7 gerelateerd kan zijn aan de verspreiding van virionen uit midgutepitheelcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Niet-virulifere insectenkweek

  1. Verzamel WBPHs van rijstvelden en achteraan met rijstzaailingen in glazen bekers van 1 L bedekt met insectenbestendig net in een incubator bij 28 °C met 16 h licht en 8 h donker. Omdat SRBSDV niet via eieren wordt overgedragen, zijn pas uitgekomen nimfen niet virulifer.
  2. Borstel met een penseelpen insecten voorzichtig uit het bekerglas dat insecten opfokt in een nieuw bekerglas verse rijstzaailingen elke week totdat WBPH-nimfen zijn uitgekomen. Ga door met het grootbrengen van deze uitgekomen niet-virulifere nimfen tot 2- of 3-instar.
    OPMERKING: Borstel voorzichtig om te voorkomen dat WBPHs uit het bekerglas vliegen of ze beschadigen.

2. Virusverwerving en verzameling van virulifere insecten

  1. Breng niet-virulifere insecten van de glazen bekers over op verse SRBSDV-geïnfecteerde rijstplanten bedekt met een insectenbestendig net gedurende een 2 d virus-acquisitie toegangsperiode (AAP) door zich te voeden met planten. Verzamel vervolgens de insecten in glazen bekers met verse rijstzaailingen.
  2. Verzamel na 2 d de insecten uit glazen bekers met een handmatige aspirator voor dissectie en excisie van de darm.
    OPMERKING:De minimale AAP van SRBSDV is 5 min voor zowel WBPH-nimfen als volwassenen, maar de insecten moeten zich gedurende 2 d kunnen voeden met verse SRBSDV-geïnfecteerde rijstplanten om de acquisitie-efficiëntie van maximaal 80% te bereiken.

3. Reagensbereiding

  1. Los 8,5 g NaCl, 3,5 g Na 2 HPO 4·12H 2 O en 0,25 g NaH 2 PO4 op in 1 ml ddH2O om 0,01 M-oplossing van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te bereiden.
  2. Voeg 4 g paraformaldehyde toe aan 100 ml PBS om 4% (m/v) paraformaldehyde in PBS te bereiden.
  3. Voeg 2 ml Triton X-100 toe aan 98 ml PBS om 2% (v/v) Triton X-100 te bereiden.

4. Dissectie van volwassenen en excisie van darmen

  1. Gebruik een pipettor om 100 μL PBS op een glasplaat te plaatsen. Plaats de dia op het podium van een optische microscoop.
  2. Verzamel de SRBSDV-geïnfecteerde volwassenen uit glazen bekers met een handmatige aspirator en plaats ze in buizen van 1,5 ml. Plaats de buizen op ijs om insecten te verlammen en breng vervolgens een verlamde volwassene over in de 100 μL PBS op de glijbaan met de buik omhoog.
    OPMERKING: De insecten zijn na 5 minuten op ijs grondig verlamd.
  3. Gebruik een pincet in de ene hand om het lichaam vast te klemmen en verwijder vervolgens het hoofd met een ander pincet in de andere hand.
  4. Klem de zijkanten van de buik vast met een pincet en klem de legboor of het copulatorische orgaan van de staart vast met de andere set. Trek vervolgens het intersegmentale membraan van een buiksegment voorzichtig weg en leg langzaam de darm in de buik bloot.
  5. Ga door met het wegscheuren van het membraan en trek geleidelijk de volledige darm uit de buik. Trek voorzichtig de staart af, die verbonden is met het uiteinde van de darm, om de volledige darm te verwijderen.
    OPMERKING: Trek heel voorzichtig of de darm zal beschadigd raken.
  6. Plaats weggesneden ingewanden in een centrifugebuis van 200 μl, voeg 200 μl PBS toe aan de buis en zuig de oplossing voorzichtig los met een pipet om de ingewanden grondig te wassen.

5. Dissectie van nimfen en excisie van ingewanden

OPMERKING: Nimflichamen zijn kwetsbaarder dan volwassen lichamen en de darm wordt gemakkelijk beschadigd wanneer deze uit de staart wordt getrokken. Daarom is de meest betrouwbare methode om de nimfdarm te verwijderen door uit het hoofd te trekken.

  1. Gebruik een pipettor om 100 μL PBS op een glasplaat te plaatsen. Plaats de dia op het podium van een optische microscoop.
  2. Verzamel de SRBSDV-geïnfecteerde nimfen uit glazen bekers met een handmatige aspirator en plaats ze in buizen van 1,5 ml. Plaats de buizen op ijs om insecten te verlammen. Breng vervolgens een verlamde nimf over in de 100 μL buffer op de glijbaan met de buik naar boven gericht.
  3. Gebruik een pincet om de staart van de nimf los te maken. Klem vervolgens het insectenlichaam om voorzichtig te fixeren en gebruik de andere set om het hoofd te klemmen. Trek het hoofd voorzichtig weg van het lichaam terwijl je nog steeds zijn aanhechting aan de darm behoudt, zodat het hoofd loskomt van het lichaam, maar de darm nog steeds vastzit aan de thorax en de buik.
    OPMERKING: Nadat het hoofd is losgemaakt, zal het corpus adiposum van de nimf naar buiten stromen, waardoor de PBS troebel wordt. Verwijder de troebele PBS-oplossing en vervang met 100 μL verse PBS.
  4. Met het pincet nog steeds klemmend op het lichaam, gebruik je de andere set om het hoofd voorzichtig te bewegen en trek je geleidelijk de darm eruit.
  5. Maak de darm voorzichtig los van het hoofd met een pincet en verkrijg uiteindelijk een intacte darm zonder het lichaam van de planthopper te beschadigen.
  6. Plaats weggesneden ingewanden in een centrifugebuis van 200 μl, voeg 200 μl PBS toe aan de buis en zuig de oplossing voorzichtig los met een pipet om de ingewanden grondig te wassen.
    OPMERKING: De weggesneden ingewanden moeten goed worden gereinigd met PBS om eventuele vervuilende vetlichamen uit de buikholte te verwijderen; Ze kunnen het kleuringsprotocol verstoren.

6. Etiketteringsprotocollen voor SRBSDV-virionen en een insecteneiwit

  1. Bereid de antilichamen en het montagemedium voor die bij deze test worden gebruikt. Antilichamen zijn anti-SRBSDV-antilichamen gelabeld met Dylight 549 (rood) tegen SRBSDV-virionen 18, anti-VAMP7-antilichaam gelabeld met Dylight 488 (groen) tegen het insecteneiwit VAMP716,19, Dylight 633 falloidine (blauw) en montagemedium met 4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, blauw).
  2. Plaats de vers uitgesneden en PBS-gewassen WBPH-darmen onmiddellijk in 100 μL 4% (m/v) paraformaldehyde in een centrifugebuis van 200 μL en houd deze 2 uur op kamertemperatuur.
    OPMERKING: De vers weggesneden WBPH-darmen mogen niet voor een langere duur in PBS worden gedrenkt, anders worden de epitheelcellen beschadigd.
  3. Verwijder 4% (m/v) paraformaldehyde met een pipettor en voeg vervolgens 200 μL PBS toe aan de 200 μL centrifugebuis. Verwijder PBS na 10 minuten met een pipettor om paraformaldehyde te verwijderen.
  4. Herhaal deze PBS-wasstap twee keer.
  5. Verwijder de PBS en voeg 200 μL niet-ionisch wasmiddel Triton X-100 (2%, v/v) toe. Permeabiliseer de monsters in het niet-ionische wasmiddel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder 2% (v/v) Triton X-100 met een pipettor en was vervolgens het resterende wasmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met 200 μL PBS (zie stappen 6.3 en 6.4).
  7. Verdun anti-SRBSDV-antilichaam gelabeld door Dylight 549 (rood) en anti-VAMP7-antilichaam gelabeld door Dylight 488 (groen) 1:50 met 50 μL bull serum albumine (3%, m/v).
  8. Voeg de verdunde antilichamen toe aan de buis en incubeer de monsters gedurende een nacht bij 4 °C.
  9. Verwijder het antilichaamverdunningsmiddel met een pipettor en spoel vervolgens het resterende antilichaamverdunningsmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met 200 μL PBS.
  10. Verdun 1 μL Dylight 633 falloidine met 50 μL PBS.
  11. Voeg 50 μL verdund falloidine toe aan de buis en incuber de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  12. Verwijder het falloidineverdunningsmiddel met een pipettor en spoel vervolgens de resterende falloidine weg met drie wasbeurten van 10 minuten met 200 μL PBS.
    OPMERKING: Grondige wasbeurten zijn van cruciaal belang om de achtergrond en niet-specifieke binding te verminderen.
  13. Plaats een druppel montagemedium met DAPI op een microscoopglaasje en breng de ingewanden over op het medium.
    OPMERKING: Vouw elke darm voorzichtig uit met een pincet en vermijd het creëren van bubbels. Er zijn ongeveer 15 ingewanden per dia.
  14. Plaats voorzichtig een afdekglas over de monsters zonder bubbels te creëren.
    OPMERKING: De dia moet in het donker op 4 °C worden gehouden om fluorescentie-doven te voorkomen voordat deze wordt waargenomen met een confocale microscoop die een laser scant.
  15. Bekijk alle monsters met een laser scanning confocale microscoop. Leg de beelden vast met blauw licht en sla de bestanden op een computer op.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, excisie van de darm, immunofluorescente etikettering en het maken van de dia.

Weggesneden WBPH-darmen van volwassenen werden gefixeerd in 4% (m/v) paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met 2% (v/v) Triton X-100 en vervolgens geïncubeerd met Dylight 633 falloidine10,18. De laserscanning confocale micrograaf in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor de beste resultaten moeten een paar belangrijke punten worden overwogen. Ten eerste is een hoge verhouding van virulifere insecten onder de totale populatie noodzakelijk. Hoewel de minimale AAP voor SRBSDV door WBPH-nimfen en volwassenen 5 min17 is, moeten de insecten zich gedurende 2 d kunnen voeden met verse SRBSDV-geïnfecteerde rijstplanten om een acquisitie-efficiëntie van maximaal 80% te bereiken. Omdat de SRBSDV-virionen in 80% van de midguts18 kunnen worden gede...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31630058 aan X.W. en 31772134 aan W.L.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3% Bull serum albumin (BSA)CoolaberSL1331Verdunnen antilichamen
DekglasSolarbioYA0771-18*18mmVoor het maken van dia's
DissectiemicroscoopBeitjaXTL-7045B1Voor insectendissectie
Laserscanning confocale microscoopZeissZeiss LSM880Fluorescentie signaal observeren
MicroscoopglazenSolarbioZBP-7105Voor het maken van dia's
Montagemedium met 4'6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)AbcamAB104139Label cel nucleüs
ParaformaldehydeSigma158127Voor weefselfixatie
Phalloïdine InvitrogenA22284Label actine van darm epitheel
Triton X-100Amresco0290C484Voor weefselpermeatie
Pincet (5-SA)AsOne6-7905-40Voor insectendissectie

Referenties

  1. Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
  2. Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
  3. Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069(2020).
  4. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  5. Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  6. Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
  7. Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
  8. Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262(2021).
  9. Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
  10. Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201(2018).
  11. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
  12. Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
  13. Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591(2017).
  14. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).
  15. Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728(2020).
  16. Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445(2016).
  17. Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
  18. Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
  20. Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1(1985).
  21. Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563(1996).
  22. Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
  23. Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531(2017).
  24. Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
  25. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Plantenvirusprote nenvirus insectinteractieconfocale microscopieepitheelcellen van de middendarmvirustransmissieprote necolocalisatiedissectie van het darmkanaal

Gerelateerde artikelen