Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Summary

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering is strak gereguleerd en gebalanceerd tijdens de ontwikkeling en homeostase van het vasculatuursysteem Daarom resulteert deregulering in deze signaleringsroute in ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arterie hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie en atherosclerose. Endotheelcellen (EC's), als de binnenste laag van bloedvaten, worden voortdurend blootgesteld aan vloeistofschuifstress (SS). Van abnormale patronen van vloeibare SS is aangetoond dat ze de TGFβ / BMP-signalering verbeteren, die, samen met andere stimuli, atherogenese induceren. In verband hiermee bleek atheroprone, lage laminaire SS de TGFβ/BMP-signalering te verbeteren, terwijl atheroprotectieve, hoge laminaire SS deze signalering vermindert. Om de activering van deze paden efficiënt te analyseren, hebben we een workflow ontworpen om de vorming van transcriptiefactorcomplexen onder lage laminaire SS- en hoge laminaire SS-omstandigheden te onderzoeken met behulp van een in de handel verkrijgbaar pneumatisch pompsysteem en nabijheidsligatietest (PLA).

Actieve TGFβ/BMP-signalering vereist de vorming van trimerische SMAD-complexen bestaande uit twee regulerende SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 en SMAD1/5/8 voor respectievelijk TGFβ- en BMP-signalering) met een gemeenschappelijke bemiddelaar SMAD (co-SMAD; SMAD4). Met behulp van PLA gericht op verschillende subeenheden van het trimerische SMAD-complex, d.w.z. R-SMAD / co-SMAD of R-SMAD / R-SMAD, kan de vorming van actieve SMAD-transcriptiefactorcomplexen kwantitatief en ruimtelijk worden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Het gebruik van stromingsdia's met 6 kleine parallelle kanalen, die in serie kunnen worden aangesloten, maakt het mogelijk om de transcriptiefactorcomplexvorming te onderzoeken en noodzakelijke controles op te nemen.

De hier uitgelegde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor studies die gericht zijn op de nabijheid van SMADs tot andere transcriptiefactoren of tot transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs, in verschillende vloeibare SS-omstandigheden. De hier gepresenteerde workflow toont een snelle en effectieve manier om de vloeistof SS geïnduceerde TGFβ / BMP-signalering in EC's te bestuderen, zowel kwantitatief als ruimtelijk.

Introduction

Eiwitten van de transforming growth factors beta (TGFβ) superfamilie zijn pleiotrope cytokines met een verscheidenheid aan leden, waaronder TGFβs, botmorfogenetische eiwitten (BMP's) en Activinen1,2. Ligandbinding induceert de vorming van receptor oligomeren die leiden tot de fosforylering en daarmee activering van cytosolische regulerende SMAD (R-SMAD). Afhankelijk van de subfamilie van liganden worden verschillende R-SMADs ^{geactiveerd1,2}. Terwijl TGFβs en Activins voornamelijk fosforylering van SMAD2/3 induceren, induceren BMP's SMAD1/5/8 fosforyleri....

Protocol

1. Blootstelling aan celkweek en vloeistofafschuivingsstress

OPMERKING: Humane navelstrengader EC's (HUVECs) werden gebruikt als voorbeeld om SS-geïnduceerde interactie van SMADs te bestuderen. Het hieronder beschreven protocol kan worden toegepast op elk SS-responsief celtype.

1. Bestrijk 6-kanaals dia met 0,1% varkenshuidgelatine in PBS gedurende 30 min bij 37 °C.
2. Zaad HUVECs in voorgecoate 6-kanaals dia's met een dichtheid van 2,5 x ¹⁰⁶ cellen per ml in 30 μL M199 volledig medium.
   OPMERKING: Voor meer informatie over het zaaien van cellen in de stroomdia, zie ^referentie24.
3. ....

Results

We hebben eerder PLA gebruikt om interacties van verschillende SMAD-eiwitten te ^detecteren3 en door schuifspanning veroorzaakte veranderingen in SMAD-fosforylering28 geanalyseerd.

Hier werden beide methoden gecombineerd met het hierboven beschreven protocol. HUVECs werden onderworpen aan schuifspanning van 1 dyn/^cm2 en 30 dyn/^cm2 en geanalyseerd op interacties van SMAD transcriptiefactoren. We tonen aan dat, in vergelijking .......

Discussion

Het hier beschreven OP PLA gebaseerde protocol biedt een efficiënte manier om de nabijheid van twee eiwitten (bijvoorbeeld hun directe interactie) te bepalen in EC's die zijn blootgesteld aan schuifspanning met kwantitatieve en ruimtelijke resolutie. Door gebruik te maken van flowglaasjes met meerdere parallelle kanalen kunnen verschillende eiwitinteracties tegelijkertijd worden onderzocht in cellen onder identieke mechanische omstandigheden. Op maat gemaakte stroomkamersystemen maken daarentegen vaak gebruik van een enk.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	6-channel slide
Ammonium Chloride	Carl Roth	K298.1	Quenching
Bovine Serum Albumin	Carl Roth	8076.4	Blocking
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Stain DNA/Nuclei
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement	Corning		supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum			supplement for medium
FIJI			Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered	KLINIPATH/VWR	VWRK4186.BO1	PFA
Full medium			M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A	Sigma Aldrich	G2500	Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H4784-250MG	supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium	ibidi	50001	Liquid mounting medium
ibidi Pump System	ibidi	10902	pneumatic pump
Leica TCS SP8	Leica		confocal microscope
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	supplement for medium (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody	Abcam	ab53745	Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody	BD Bioscience	610843	Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE	ibidi	10963	Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN	ibidi	10964	Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody	Cell Signaling Technologies	9516	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody	Cell Signaling Technologies	8685	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody	Cell Signaling Technologies	9515	Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides	ibidi	10830	serial connection tubes
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilization