Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Summary

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering is strak gereguleerd en gebalanceerd tijdens de ontwikkeling en homeostase van het vasculatuursysteem Daarom resulteert deregulering in deze signaleringsroute in ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arterie hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie en atherosclerose. Endotheelcellen (EC's), als de binnenste laag van bloedvaten, worden voortdurend blootgesteld aan vloeistofschuifstress (SS). Van abnormale patronen van vloeibare SS is aangetoond dat ze de TGFβ / BMP-signalering verbeteren, die, samen met andere stimuli, atherogenese induceren. In verband hiermee bleek atheroprone, lage laminaire SS de TGFβ/BMP-signalering te verbeteren, terwijl atheroprotectieve, hoge laminaire SS deze signalering vermindert. Om de activering van deze paden efficiënt te analyseren, hebben we een workflow ontworpen om de vorming van transcriptiefactorcomplexen onder lage laminaire SS- en hoge laminaire SS-omstandigheden te onderzoeken met behulp van een in de handel verkrijgbaar pneumatisch pompsysteem en nabijheidsligatietest (PLA).

Actieve TGFβ/BMP-signalering vereist de vorming van trimerische SMAD-complexen bestaande uit twee regulerende SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 en SMAD1/5/8 voor respectievelijk TGFβ- en BMP-signalering) met een gemeenschappelijke bemiddelaar SMAD (co-SMAD; SMAD4). Met behulp van PLA gericht op verschillende subeenheden van het trimerische SMAD-complex, d.w.z. R-SMAD / co-SMAD of R-SMAD / R-SMAD, kan de vorming van actieve SMAD-transcriptiefactorcomplexen kwantitatief en ruimtelijk worden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Het gebruik van stromingsdia's met 6 kleine parallelle kanalen, die in serie kunnen worden aangesloten, maakt het mogelijk om de transcriptiefactorcomplexvorming te onderzoeken en noodzakelijke controles op te nemen.

De hier uitgelegde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor studies die gericht zijn op de nabijheid van SMADs tot andere transcriptiefactoren of tot transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs, in verschillende vloeibare SS-omstandigheden. De hier gepresenteerde workflow toont een snelle en effectieve manier om de vloeistof SS geïnduceerde TGFβ / BMP-signalering in EC's te bestuderen, zowel kwantitatief als ruimtelijk.

Introduction

Eiwitten van de transforming growth factors beta (TGFβ) superfamilie zijn pleiotrope cytokines met een verscheidenheid aan leden, waaronder TGFβs, botmorfogenetische eiwitten (BMP's) en Activinen1,2. Ligandbinding induceert de vorming van receptor oligomeren die leiden tot de fosforylering en daarmee activering van cytosolische regulerende SMAD (R-SMAD). Afhankelijk van de subfamilie van liganden worden verschillende R-SMADs ^{geactiveerd1,2}. Terwijl TGFβs en Activins voornamelijk fosforylering van SMAD2/3 induceren, induceren BMP's SMAD1/5/8 fosforylering. Er zijn echter steeds meer aanwijzingen dat BMP's en TGFβs/Activinen ook R-SMADs van de respectieve andere subfamilie activeren, in een proces dat wordt aangeduid als 'laterale signalering'3,4,5,6,7,8 en dat er gemengde SMAD-complexen zijn die bestaan uit zowel SMAD1/5 als SMAD2/3, ^leden3,9 . Twee geactiveerde R-SMADs vormen vervolgens trimerische complexen met de gemeenschappelijke mediator SMAD4. Deze transcriptiefactorcomplexen zijn vervolgens in staat om naar de kern te transloceren en de transcriptie van doelgenen te reguleren. SMADs kunnen interageren met een verscheidenheid aan verschillende transcriptionele co-activatoren en co-repressoren, wat leidt tot de diversificatie van de mogelijkheden om doelgenen te ^reguleren10. Deregulering van SMAD-signalering heeft ernstige gevolgen voor een verscheidenheid aan ziekten. In lijn hiermee kan onevenwichtige TGFβ / BMP-signalering leiden tot ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arteriële hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie of atherosclerose3,11,12,13,14.

Endotheelcellen (EC's) vormen de binnenste laag van bloedvaten en worden daarom blootgesteld aan schuifspanning (SS), een wrijvingskracht die wordt uitgeoefend door de viskeuze bloedstroom. Interessant is dat EC's die zich bevinden in de delen van de vasculatuur, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van uniforme, laminaire SS, in een homeostatische en rustige toestand worden gehouden. Daarentegen zijn EC's die lage, niet-uniforme SS ervaren, bijvoorbeeld bij bifurcaties of de kleinere kromming van de aortaboog, proliferatief en activeren ^{ontstekingsroutes15}. Op hun beurt zijn plaatsen van disfunctionele EC's vatbaar voor het ontwikkelen van atherosclerose. Interessant is dat EC's in deze atheroprone gebieden afwijkend hoge niveaus van geactiveerde SMAD2 / 3 en SMAD1 / ^{516, 17,18} vertonen. In deze context bleek verbeterde TGFβ/BMP-signalering een vroege gebeurtenis te zijn in de ontwikkeling van atherosclerotische ^laesies19 en interferentie met BMP-signalering bleek vasculaire ontsteking, atheromavorming en bijbehorende calcificatie aanzienlijk te ^{verminderen20}.

Proximity Ligation Assay (PLA) is een biochemische techniek om eiwit-eiwit interacties in ^situ21,22 te ^bestuderen. Het is gebaseerd op de specificiteit van antilichamen van verschillende soorten die doeleiwitten van belang kunnen binden, waardoor zeer specifieke detectie van endogene eiwitinteracties op eencellig niveau mogelijk is. Hier moeten primaire antilichamen zich binden aan hun doelepithop op een afstand van minder dan 40 nm om de detectie mogelijk te ^maken23. Daarom is PLA zeer gunstig ten opzichte van traditionele co-immunoprecipitatiebenaderingen, waarbij enkele miljoenen cellen nodig zijn om endogene eiwitinteracties te detecteren. In PLA binden soortspecifieke secundaire antilichamen, covalent gekoppeld aan DNA-fragmenten (plus- en minus-sondes genoemd), de primaire antilichamen en als de eiwitten van belang op elkaar inwerken, komen plus- en minus-sondes in de buurt. Het DNA wordt in de volgende stap geligeerd en de rollende cirkelversterking van het circulaire DNA wordt mogelijk gemaakt. Tijdens amplificatie binden fluorescerend gelabelde complementaire oligonucleotiden aan het gesynthetiseerde DNA, waardoor deze eiwitinteracties kunnen worden gevisualiseerd door conventionele fluorescentiemicroscopie.

Het hier beschreven protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal actieve SMAD-transcriptiecomplexen bij atheroprotectieve en atheroprone SS-condities in vitro kwantitatief te vergelijken met behulp van PLA. RVS wordt gegenereerd via een programmeerbaar pneumatisch pompsysteem dat in staat is om laminaire unidirectionele stroom van gedefinieerde niveaus te genereren en stapsgewijze verhogingen van debieten mogelijk maakt. Deze methode maakt het mogelijk om interacties tussen SMAD1/5 of SMAD2/3 met SMAD4 te detecteren, evenals gemengde R-SMAD-complexen. Het kan eenvoudig worden uitgebreid om interacties van SMADs met transcriptionele co-regulatoren te analyseren of om transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs te analyseren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van het protocol hieronder.

Figuur 1: Schematische weergave van het beschreven protocol. (A) Cellen gezaaid in 6-kanaals dia's worden blootgesteld aan schuifspanning met een pneumatisch pompsysteem. (B) Vaste cellen worden gebruikt voor PLA-experimenten of voor controleomstandigheden. (C) Beelden van PLA-experimenten worden verkregen met een fluorescentiemicroscoop en worden geanalyseerd met behulp van ImageJ-analysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Blootstelling aan celkweek en vloeistofafschuivingsstress

OPMERKING: Humane navelstrengader EC's (HUVECs) werden gebruikt als voorbeeld om SS-geïnduceerde interactie van SMADs te bestuderen. Het hieronder beschreven protocol kan worden toegepast op elk SS-responsief celtype.

1. Bestrijk 6-kanaals dia met 0,1% varkenshuidgelatine in PBS gedurende 30 min bij 37 °C.
2. Zaad HUVECs in voorgecoate 6-kanaals dia's met een dichtheid van 2,5 x ¹⁰⁶ cellen per ml in 30 μL M199 volledig medium.
   OPMERKING: Voor meer informatie over het zaaien van cellen in de stroomdia, zie ^referentie24.
3. Laat cellen zich 1 uur hechten bij 37 °C in een bevochtigde incubator.
4. Voeg 60 μL voorverwarmd M199 vol medium toe aan elk van de reservoirs.
5. Kweek gedurende 2 dagen, met een zachte medium uitwisseling eenmaal daags, bij 37 °C in een bevochtigde incubator.
   1. Zuig de reservoirs volledig aan, voeg 120 μL voorverwarmd M199 volledig medium toe in een van de reservoirs en zuig vanaf de andere kant op.
   2. Voeg 60 μL voorverwarmd M199 vol medium toe aan beide reservoirs.
6. Monteer en start de stroomopstelling zoals beschreven in de ^reference25.
   1. Monteer slangen op vloeistofeenheden. Hier worden siliconenbuizen met een diameter van 0,8 mm en 1,6 mm gebruikt om schuifspanning van respectievelijk 1 kleurstof /^cm2 en 30 kleurstof / ^cm2 toe te passen.
      OPMERKING: Het materiaal en de buislengte moeten constant blijven, omdat veranderingen de resulterende schuifspanning kunnen beïnvloeden. Over het algemeen kunnen andere combinaties van pompsystemen en slangen worden gebruikt, zolang de resulterende schuifspanning bekend is en de pomp een constante laminaire stroom creëert.
   2. Vul de reservoirs met een geschikte hoeveelheid voorverwarmd M199 vol medium (minimaal 10 ml).
   3. Sluit vloeistofeenheden met de slang aan op het pompsysteem en voer een voorloop uit zonder cellen om het medium in evenwicht te brengen en eventuele resterende lucht te ^{verwijderen25}.
   4. Verbind de afzonderlijke kanalen op de 6-kanaals schuif serieel met elkaar door middel van seriële verbindingsslangen. Het eerste en het laatste kanaal op de dia worden aangesloten op de in 1.6.1 gemonteerde buis (zie figuur 1A voor een schema). Zorg ervoor dat u geen lucht in het systeem brengt, omdat dit de cellen ernstig kan schaden. Meer informatie over de seriële verbinding is te vinden in ^reference26.
   5. Gebruik voor de blootstelling van cellen aan hoge niveaus van schuifspanning (>20 dyn / ^cm2) een rampfase, d.w.z. verhoog de schuifspanning stapsgewijs met aanpassingsfasen. Stappen kunnen worden ingesteld in stappen van 5 dyn/^cm2 per 30 min.

2. Fixatie

1. Maak de glijdingen van de pompen los na blootstelling aan de vloeistof SS. Gebruik klemmen op de slang bij het losmaken, om te voorkomen dat het medium in de couveuse wordt gemorst.
2. Breng onmiddellijk stromingsglijbanen over op ijs, terwijl de resterende buizen sequentieel worden losgemaakt. Bij het verwijderen van de slang uit reservoirs moet het reservoir aan de andere kant met een vinger worden gesloten om te voorkomen dat luchtbellen in het kanaal worden opgesloten. Dit kan de fixatiestappen verstoren.
3. Houd de cellen op ijs en zuig het medium voorzichtig op uit de reservoirs, maar niet uit het kanaal waar de cellen zich bevinden. Was vervolgens monsters met koud steriel PBS (4 °C) met driemaal het kanaalvolume (90 μL). Voeg PBS toe in het ene reservoir en zuig voorzichtig op uit het andere reservoir. Herhaal deze stap in elk van de 6 kanalen per dia.
   OPMERKING: Voor alle was- en incubatiestappen wordt de respectieve oplossing toegevoegd in een van de reservoirs, wat leidt tot een uitwisseling van oplossingen in het kanaal. Om volledige vervanging van oplossingen in het kanaal mogelijk te maken, wordt de overtollige oplossing vervolgens aangezogen uit het andere reservoir. Oplossing aan de bovenkant van de cellen in het kanaal wordt niet verwijderd. Cellen mogen op geen enkel moment drogen. Daarom is het belangrijk om zorgvuldig te wassen zonder dat er luchtbellen in de dia's worden ingebracht.
4. Fixeer de cellen door 90 μL gebufferde 4% PFA-oplossing toe te voegen aan hetzelfde reservoir waar de PBS vooraf is toegevoegd en zuig op dezelfde manier de vloeistof uit het andere reservoir aan. Herhaal deze stap in elk kanaal in elke dia. Breng na de toevoeging van de PFA-oplossing de monsters over van ijs naar kamertemperatuur (RT) en incubeer gedurende 20 minuten.
   LET OP: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld. Gebruik handschoenen en werk onder een zuurkast.
5. Was cellen 3x met PBS (RT) door het in het ene reservoir toe te voegen en voorzichtig uit het andere reservoir te zuigen. Leeg alleen de reservoirs en zorg ervoor dat het kanaal niet uitdroogt. Herhaal deze stap voor elk van de 6 kanalen per dia.
6. Blus de PFA-fixatie door 90 μL omgevingsactief 50 mM ammoniumchloride in PBS toe te voegen in een van de reservoirs. Zuig overtollige oplossing uit het andere reservoir. Herhaal dit voor elk kanaal in de dia. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT.
7. Wassen zoals beschreven in stap 2.5.
   OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters 's nachts bij 4 °C worden bewaard, of het protocol kan onmiddellijk worden voortgezet met blokkering en primaire antilichaamincubatie (zie stap 3).

3. Blokkering en primaire antilichaamincubatie

1. Om de cellen te permeabiliseren, voegt u 90 μL van 0,3% Triton-X-100 in PBS toe aan een leeg reservoir en zuigt u voor elk kanaal uit het andere reservoir. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
2. Wassen zoals beschreven in stap 2.5.
3. Voeg 90 μL steriele PLA-blokkerende oplossing toe in het ene reservoir van een kanaal en adem vanaf de andere kant op. Herhaal deze stap voor elk kanaal. Blok gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.
   1. Om een bevochtigde kamer te maken, gebruikt u een schaal van 10 cm met nat weefsel afgesloten met wasfolie en plaatst u de schaal in de couveuse. Als alternatief kunnen andere vochtigheidskamerformaten worden gebruikt die een vochtige atmosfeer leveren.
      OPMERKING: Als alternatief kan een zelfgemaakte blokkeringsoplossing worden gebruikt (bijv. 3% (w / v) BSA in PBS, steriel gefilterd).
4. Bereid primaire antilichamen (1:100) voor in PLA-antilichaamverdunningsmiddel. Bereid 30 μL van de oplossing per kanaal. Voeg beide primaire antilichamen tegelijkertijd en vortex toe.
   OPMERKING: Als alternatief kan zelfgemaakt antilichaamverdunningsmiddel worden gebruikt (bijv. 1% (w / v) BSA in PBS). Antilichamen die hier worden gebruikt zijn combinaties van SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 en fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Gedetailleerde informatie is te vinden in de Tabel met Materialen.
5. Voordat primaire antilichamen worden aangebracht, zuigt u de blokkerende oplossing op uit de reservoirs en ook voorzichtig uit het kanaal. Pipetteer 30 μL van de primaire antilichaamoplossing onmiddellijk in het lege kanaal door het kanaal te kantelen terwijl de oplossing wordt toegevoegd.
   OPMERKING: Voer de verwijdering van de blokkerende oplossing en toevoeging van de antilichaamoplossing kanaal voor kanaal uit om ervoor te zorgen dat cellen niet tussendoor uitdrogen.
6. Incubateer monsters met de primaire antilichamen 's nachts in bevochtigde kamers bij 4 °C.
   OPMERKING: De incubatie kan ook gedurende 1 uur bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, als u geïnteresseerd bent om op dezelfde dag door te gaan met de volgende stappen.

4. PLA probe incubatie

OPMERKING: Voor alle stappen in rubriek 4.1-7.3 worden de wasbuffers A en B bewaard bij 4 °C en moeten ze vóór gebruik worden opgewarmd tot RT.

1. Verdun PLA-probes (+)-muis en (-)-konijn tot 1:5 in PLA antilichaam verdunningsmiddel (of 1% BSA) oplossing. Bereid 30 μL per kanaal.
2. Was monsters 2x gedurende 5 minuten met behulp van 90 μL van de wasbuffer A bij RT door deze toe te voegen in een van de reservoirs en voorzichtig uit het andere reservoir te zuigen. Herhaal deze stap voor elk van de 6 kanalen per dia.
3. Zuig de wasbuffer A voorzichtig op en voeg 30 μL PLA-sondeoplossing (bereid in stap 4.1) toe, vergelijkbaar met de toevoeging van primaire antilichamen in stap 3.5.
4. Incubeer monsters gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer.

5. Ligatie

1. Was monsters 2x gedurende 5 minuten met 90 μL van de wasbuffer A bij RT, zoals beschreven in 4.2.
2. Bereid een 1:5 verdunning van de ligatiebuffer in gedeïoniseerd water. Gebruik deze buffer om het ligase-enzym te verdunnen tot 1:40 (op ijs). Gebruik 30 μL per kanaal.
3. Zuig de wasbuffer A volledig aan en voeg de ligatieoplossing toe zoals beschreven in punt 3.5.
4. Incubeer monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.

6. Versterking

1. Was monsters 2x gedurende 2 minuten met 90 μL wasbuffer A bij RT, zoals beschreven in 4.2.
2. Bereid de amplificatiebuffer voor door deze 1:5 te verdunnen in gedeïoniseerd water en gebruik deze om het polymerase-enzym te verdunnen tot 1:80 (op ijs). Bescherm tegen licht. Bereid 30 μL per kanaal.
3. Zuig de wasbuffer A volledig aan en voeg onmiddellijk de bereide versterkingsoplossing toe aan het lege kanaal, zoals beschreven in punt 3.5. Incubeer monsters gedurende 100 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.

7. Montage

1. Was monsters 2x gedurende 10 minuten met 90 μL wasbuffer B bij RT zoals beschreven in 4.2. Voeg DAPI (1:500) van 1 mg/ml stamoplossing (in gedeïoniseerd water) toe aan de eerste wasbeurt om kernen te bevlekken. Droog het kanaal niet.
2. Verdun de wasbuffer B in gedeïoniseerd water (1:10) en was 1x met 90 μL 0,1x buffer B-oplossing zoals beschreven in 4.2.
3. Zuig de wasbuffer B volledig op en voeg onmiddellijk 2-3 druppels van het vloeibare montagemedium toe aan één reservoir. Verdeel het in het kanaal door de schuif te kantelen. Bewaar monsters bij 4 °C in een bevochtigde omgeving totdat ze worden ingebeeld.

8. Beeldverwerving

1. Verkrijg beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat de respectievelijke filters die op de fluorescerende PLA-sondes passen, beschikbaar zijn.
   OPMERKING: Het is gunstig om gebruik te maken van een confocale microscoop, indien mogelijk, omdat verkregen PLA-vlekken meer gedefinieerd zijn. Dit ondersteunt ook verdere beeldverwerking en data-analyse.

9. Beeldanalyse en kwantificering met behulp van ImageJ / FIJI

1. Verwerk geëxporteerde afbeeldingen (.tiff) met een beeldverwerkingsprogramma, zoals ^ImageJ27.
   OPMERKING: Alle scripts die in deze studie worden gebruikt en die nodig zijn voor het automatisch tellen van cellulaire, nucleaire en alle PLA-gebeurtenissen (per cel) zijn te vinden in een GitHub-repository: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Voer statistische analyses uit met behulp van een geschikt programma of hulpmiddel.

Results

We hebben eerder PLA gebruikt om interacties van verschillende SMAD-eiwitten te ^detecteren3 en door schuifspanning veroorzaakte veranderingen in SMAD-fosforylering28 geanalyseerd.

Hier werden beide methoden gecombineerd met het hierboven beschreven protocol. HUVECs werden onderworpen aan schuifspanning van 1 dyn/^cm2 en 30 dyn/^cm2 en geanalyseerd op interacties van SMAD transcriptiefactoren. We tonen aan dat, in vergelijking ...

Discussion

Het hier beschreven OP PLA gebaseerde protocol biedt een efficiënte manier om de nabijheid van twee eiwitten (bijvoorbeeld hun directe interactie) te bepalen in EC's die zijn blootgesteld aan schuifspanning met kwantitatieve en ruimtelijke resolutie. Door gebruik te maken van flowglaasjes met meerdere parallelle kanalen kunnen verschillende eiwitinteracties tegelijkertijd worden onderzocht in cellen onder identieke mechanische omstandigheden. Op maat gemaakte stroomkamersystemen maken daarentegen vaak gebruik van een enk...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	6-kanaals slide
Ammonium Chloride	Carl Roth	K298.1	Quenching
Bovine Serum Albumin	Carl Roth	8076.4	Blocking
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Stain DNA/Nuclei
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	PLA-kit met Ligase, ligatiebuffer, polymerase en amplificatiebuffer (met groen gelabelde oligonucleotiden)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA-wasbuffers A en B
Endothelial Cell Growth Supplement	Corning		supplement voor medium (ECGS)
Fetal calf Serum			supplement voor medium
FIJI			Beeldanalysesoftware
Formaldehyde solution 4% buffered	KLINIPATH/VWR	VWRK4186.BO1	PFA
Full medium			M199 basaal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A	Sigma Aldrich	G2500	Gebruik 0,1% in PBS voor coating van flowkanalen
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Statistisch programma gebruikt voor de grafieken en statistische berekeningen
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H4784-250MG	supplement voor medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium	ibidi	50001	Vloeibaar montagemedium
ibidi Pump System	ibidi	10902	pneumatische pomp
Leica TCS SP8	Leica		confocale microscoop
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	supplement voor medium (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Basismedium
mouse anti- SMAD1 Antibody	Abcam	ab53745	Geschikt voor PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody	BD Bioscience	610843	Niet geschikt voor PLA in combinatie met CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Geschikt voor PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	supplement voor medium (P/S)
Perfusion Set WHITE	ibidi	10963	Slangen gebruikt voor 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN	ibidi	10964	Slangen gebruikt voor 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody	Cell Signaling Technologies	9516	Geschikt voor PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody	Cell Signaling Technologies	8685	Geschikt voor PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody	Cell Signaling Technologies	9515	Niet geschikt voor PLA in combinatie met BD 610843
Serial Connector for µ-Slides	ibidi	10830	serieverbindingsbuizen
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilisatie