Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

Summary

De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.

Abstract

Neurowetenschappers gebruiken miniatuurmicroscopen (miniscopen) om neuronale activiteit bij vrij gedragende dieren te observeren. Het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA) biedt open bronnen voor onderzoekers om zelf miniscopen te bouwen. De V3 UCLA Miniscope is een van de meest populaire open-source miniscopen die momenteel in gebruik zijn. Het maakt beeldvorming mogelijk van de fluorescentietransiënten die worden uitgezonden door genetisch gemodificeerde neuronen door een objectieve lens geïmplanteerd op de oppervlakkige cortex (een systeem met één lens), of in diepe hersengebieden door een combinatie van een relaislens geïmplanteerd in de diepe hersenen en een objectieve lens die is voorgeanchoreerd in de miniscoop om het doorgegeven beeld te observeren (een systeem met twee lenzen). Zelfs onder optimale omstandigheden (wanneer neuronen fluorescentie-indicatoren uitdrukken en de relaislens correct is geïmplanteerd), kan een volumeverandering van het tandcement tussen de bodemplaat en de bevestiging ervan aan de schedel bij cementuitharding een verkeerde uitlijning veroorzaken met een veranderde afstand tussen de objectief- en relaislenzen, wat resulteert in de slechte beeldkwaliteit. Een bodemplaat is een plaat die helpt de miniscoop op de schedel te monteren en de werkafstand tussen het objectief en de relaislenzen vast te stellen. Veranderingen in het volume van het tandcement rond de bodemplaat veranderen dus de afstand tussen de lenzen. Het huidige protocol heeft tot doel het verkeerde uitlijningsprobleem veroorzaakt door volumeveranderingen in het tandcement te minimaliseren. Het protocol vermindert de verkeerde uitlijning door een eerste fundering van tandcement te bouwen tijdens de implantatie van relaislenzen. De hersteltijd na implantatie is voldoende voor de fundering van tandcement om de bodemplaat volledig uit te harden, zodat de bodemplaat op deze steiger kan worden gecementeerd met zo min mogelijk nieuw cement. In dit artikel beschrijven we strategieën voor baseplating bij muizen om beeldvorming van neuronale activiteit mogelijk te maken met een objectieve lens verankerd in de miniscoop.

Introduction

Fluorescerende activiteitsreporters zijn ideaal voor beeldvorming van de neuronale activiteit omdat ze gevoelig zijn en een groot dynamisch bereik hebben^{van 1,2,3}. Daarom gebruikt een toenemend aantal experimenten fluorescentiemicroscopie om neuronale activiteit direct te observeren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15

Protocol

Alle procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de National Taiwan University Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: NTU-109-EL-00029 en NTU-108-EL-00158).

1. Beoordeling van de volumeverandering van tandcement

OPMERKING: Veranderingen in het volume tandcement treden op tijdens het uithardingsproces. Test de volumeveranderingen van tandcement vóór implantatie en baseplating. Onderzoekers kunnen elk merk tandcement testen en het merk met de laagste volumeverandering gebruiken om de bodemplaat te cementeren. Een voorbeeld is weergegeven in

Results

Beoordeling van de volumeverandering van het tandcement
Aangezien het volume tandcement tijdens het uithardingsproces verandert, kan dit de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, aangezien de werkafstand van een GRIN-lens ongeveer 50 tot 350 μm ^4,8 is. Daarom werden in dit geval twee in de handel verkrijgbare tandheelkundige cementen getest, Tempron en Tokuso, vóór de implantatie- en baseplatingprocedure (figuur 5

Discussion

Het huidige rapport beschrijft een gedetailleerd experimenteel protocol voor onderzoekers die het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen gebruiken. De tools die in ons protocol zijn ontworpen, zijn relatief betaalbaar voor elk laboratorium dat in vivo calciumbeeldvorming wil proberen. Sommige protocollen, zoals virale injectie, lensimplantatie, dummy baseplating en baseplating, kunnen ook worden gebruikt voor andere versies van het miniscoopsysteem om het succespercentage van calciumbeeldvorming te verbeteren. A.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery