Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

Yi-Tse Hsiao; Angela Yu-Chi Wang; Ting-Yen Lee; Ching-Yuan Chang

doi:10.3791/62611

Methodenartikel

Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

DOI:

10.3791/62611

⸱

5 juni 2021

Yi-Tse Hsiao¹ , Angela Yu-Chi Wang¹ , Ting-Yen Lee¹ , Ching-Yuan Chang¹

¹Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurowetenschappers gebruiken miniatuurmicroscopen (miniscopen) om neuronale activiteit bij vrij gedragende dieren te observeren. Het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA) biedt open bronnen voor onderzoekers om zelf miniscopen te bouwen. De V3 UCLA Miniscope is een van de meest populaire open-source miniscopen die momenteel in gebruik zijn. Het maakt beeldvorming mogelijk van de fluorescentietransiënten die worden uitgezonden door genetisch gemodificeerde neuronen door een objectieve lens geïmplanteerd op de oppervlakkige cortex (een systeem met één lens), of in diepe hersengebieden door een combinatie van een relaislens geïmplanteerd in de diepe hersenen en een objectieve lens die is voorgeanchoreerd in de miniscoop om het doorgegeven beeld te observeren (een systeem met twee lenzen). Zelfs onder optimale omstandigheden (wanneer neuronen fluorescentie-indicatoren uitdrukken en de relaislens correct is geïmplanteerd), kan een volumeverandering van het tandcement tussen de bodemplaat en de bevestiging ervan aan de schedel bij cementuitharding een verkeerde uitlijning veroorzaken met een veranderde afstand tussen de objectief- en relaislenzen, wat resulteert in de slechte beeldkwaliteit. Een bodemplaat is een plaat die helpt de miniscoop op de schedel te monteren en de werkafstand tussen het objectief en de relaislenzen vast te stellen. Veranderingen in het volume van het tandcement rond de bodemplaat veranderen dus de afstand tussen de lenzen. Het huidige protocol heeft tot doel het verkeerde uitlijningsprobleem veroorzaakt door volumeveranderingen in het tandcement te minimaliseren. Het protocol vermindert de verkeerde uitlijning door een eerste fundering van tandcement te bouwen tijdens de implantatie van relaislenzen. De hersteltijd na implantatie is voldoende voor de fundering van tandcement om de bodemplaat volledig uit te harden, zodat de bodemplaat op deze steiger kan worden gecementeerd met zo min mogelijk nieuw cement. In dit artikel beschrijven we strategieën voor baseplating bij muizen om beeldvorming van neuronale activiteit mogelijk te maken met een objectieve lens verankerd in de miniscoop.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescerende activiteitsreporters zijn ideaal voor beeldvorming van de neuronale activiteit omdat ze gevoelig zijn en een groot dynamisch bereik hebben^van ^1,2,3. Daarom gebruikt een toenemend aantal experimenten fluorescentiemicroscopie om neuronale activiteit direct te observeren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,¹⁶. De eerste geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop (miniscoop) met één foton werd in 2011 ontworpen door Mark Schnitzer et ^al.5. Deze miniscoop stelt onderzoekers in staat om de fluorescentiedynamiek van cerebellaire cellen te volgen bij zich vrij gedragende dieren⁵ (d.w.z. zonder enige fysieke beperking, hoofdsteun, sedatie of anesthesie voor de dieren). Momenteel kan de techniek worden toegepast om oppervlakkige hersengebieden zoals de cortex ^6,8,15,16 te monitoren; subcorticale gebieden zoals de dorsale hippocampus 8,11,13,14 en striatum ^6,17; en diepe hersengebieden zoals de ventrale hippocampus¹⁴, amygdala ^10,18 en hypothalamus ^8,12.

In de afgelopen jaren zijn er verschillende open-source miniscopen ontwikkeld.⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁷^,¹⁹. De miniscoop kan economisch worden samengesteld door onderzoekers als ze de stapsgewijze richtlijnen volgen van het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA)⁴^,⁷^,¹¹^,¹³. Omdat optische monitoring van neurale activiteit wordt beperkt door de beperkingen van lichttransmissie⁷ van en naar de neuronale populatie van belang, werd een miniscoop ontworpen die vereist dat een objectieve gradiënt brekingsindex (GRIN) lens (of objectieve lens) aan de onderkant van de miniscoop wordt voorgeanchored om het gezichtsveld te vergroten dat wordt doorgegeven door een relais GRIN-lens (of relaislens)⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Deze relaislens wordt geïmplanteerd in het doelhersengebied, zodat de fluorescentieactiviteit van het doelbreingebied wordt doorgegeven aan het oppervlak van de relaislens⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Ongeveer 1/4 van een volledige sinusoïdale periode van licht reist door de objectieve GRIN-lens (~ 0,25 toonhoogte) (Figuur 1A1), wat resulteert in een vergrote fluorescentieafbeelding⁶^,⁷. De objectieflens is niet altijd aan de onderkant van de miniscoop bevestigd, noch is de implantatie van de relaislens nodig⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. Concreet zijn er twee configuraties: een met een vaste objectieflens in de miniscoop en een relaislens geïmplanteerd in de hersenen⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶ (Figuur 1B1) en een andere met alleen een verwijderbare objectieflens⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (Figuur 1B2). In het ontwerp op basis van het vaste doel en de geïmplanteerde relaislenscombinatie worden de fluorescentiesignalen van de hersenen naar het bovenoppervlak van de relaislens gebracht (Figuur 1A1)⁷^,⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶. Vervolgens kan de objectieflens het gezichtsveld vanaf het bovenoppervlak van de relaislens vergroten en verzenden (Figuur 1A2). Aan de andere kant is het ontwerp van de verwijderbare objectieve GRIN-lens flexibeler, wat betekent dat pre-implantatie van een relaislens in de hersenen niet verplicht is (Figuur 1B2)⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. Bij het gebruik van een miniscoop op basis van een verwijderbaar objectieflensontwerp, moeten onderzoekers nog steeds een lens in het doelhersengebied implanteren, maar ze kunnen een objectieve lens implanteren⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ of een relaislens in de hersenen⁶^,⁷. De keuze van een objectief of een relaislens voor implantatie bepaalt de miniscoopconfiguratie die de onderzoeker moet gebruiken. De V3 UCLA Miniscope is bijvoorbeeld gebaseerd op een verwijderbaar objectief GRIN-lensontwerp. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om een objectieve lens rechtstreeks in het hersengebied van belang te implanteren en de "lege" miniscoop op de objectieve lens te monteren⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (een systeem met één lens; Figuur 1B2) of om een relaislens in de hersenen te implanteren en een miniscoop te monteren die vooraf is voorzien van een objectieve lens⁶^,⁷ (een systeem met twee lenzen; Figuur 1B1). De miniscoop werkt vervolgens als een fluorescentiecamera om livestreambeelden vast te leggen van neuronale fluorescentie geproduceerd door een genetisch gecodeerde calciumindicator¹^,²^,³. Nadat de miniscoop op een computer is aangesloten, kunnen deze fluorescentiebeelden naar de computer worden overgebracht en als videoclips worden opgeslagen. Onderzoekers kunnen neuronale activiteit bestuderen door de relatieve veranderingen in fluorescentie te analyseren met sommige analysepakketten²⁰^,²¹ of schrijf hun codes voor toekomstige analyse.

De V3 UCLA Miniscope biedt gebruikers flexibiliteit om te bepalen of ze neuronale activiteit in beeld willen brengen met een systeem met één of twee lenzen⁷. De keuze van het opnamesysteem is gebaseerd op de diepte en grootte van het doelhersengebied. Kortom, een systeem met één lens kan alleen een gebied in beeld brengen dat oppervlakkig (minder dan ongeveer 2,5 mm diep) en relatief groot (groter dan ongeveer 1,8 x 1,8 mm²) is omdat de fabrikanten slechts een bepaalde grootte objectieflens produceren. Daarentegen kan een systeem met twee lenzen worden toegepast op elk doelgebied van de hersenen. Het tandcement voor het lijmen van de bodemplaat heeft echter de neiging om een verkeerde uitlijning te veroorzaken met een veranderde afstand tussen het objectief en de relaislenzen, wat resulteert in een slechte beeldkwaliteit. Als het systeem met twee lenzen wordt gebruikt, moeten twee werkafstanden nauwkeurig worden gericht om de optimale beeldkwaliteit te bereiken (figuur 1A). Deze twee kritische werkafstanden liggen tussen de neuronen en het onderste oppervlak van de relaislens en tussen het bovenoppervlak van de relaislens en het onderste oppervlak van de objectieflens (figuur 1A1). Elke verkeerde uitlijning of misplaatsing van de lens buiten de werkafstand resulteert in beeldfalen (figuur 1C2). Het systeem met één lens daarentegen vereist slechts één precieze werkafstand. De grootte van de objectieve lens beperkt echter de toepassing ervan voor het monitoren van diepe hersengebieden (de objectieve lens die bij de miniscoop past, is ongeveer 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daarom is implantatie van een objectieve lens beperkt voor de observatie van het oppervlak en relatief grote hersengebieden, zoals de cortex ^6,15 en dorsale cornu ammonis 1 (CA1) bij muizen^11,13 . Bovendien moet een groot deel van de cortex worden geaspireerd om de dorsale CA1^11,13 te targeten. Vanwege de beperking van de configuratie met één lens die beeldvorming van diepe hersengebieden voorkomt, bieden commerciële miniscoopsystemen alleen een gecombineerd objectief lens / relaislens (twee-lens) ontwerp. Aan de andere kant kan de V3 UCLA-miniscoop worden gewijzigd in een systeem met één lens of twee lenzen, omdat de objectieflens verwijderbaar is 6,11,13,15. Met andere woorden, V3 UCLA-miniscoopgebruikers kunnen profiteren van de verwijderbare lens door deze in de hersenen te implanteren (een systeem met één lens te creëren), bij het uitvoeren van experimenten met oppervlakkige hersenobservaties (minder dan 2,5 mm diep), of door deze vooraf in de miniscoop te implanteren en een relaislens in de hersenen te implanteren (waardoor een systeem met twee lenzen ontstaat), bij het uitvoeren van experimenten met diepe hersenobservaties. Het systeem met twee lenzen kan ook worden toegepast voor het oppervlakkig observeren van de hersenen, maar de onderzoeker moet de nauwkeurige werkafstanden tussen de objectieve lens en de relaislens kennen. Het grote voordeel van het systeem met één lens is dat er een kleinere kans is om de werkafstanden te missen dan bij een systeem met twee lenzen, aangezien er twee werkafstanden zijn die nauwkeurig moeten worden gericht om een optimale beeldkwaliteit in het systeem met twee lenzen te bereiken (figuur 1A). Daarom raden we aan om een systeem met één lens te gebruiken voor oppervlakkige hersenobservaties. Als het experiment echter beeldvorming in het diepe hersengebied vereist, moet de onderzoeker leren om verkeerde uitlijning van de twee lenzen te voorkomen.

Het basisprotocol voor de configuratie van miniscopen met twee lenzen voor experimenten omvat lensimplantatie en baseplating 8,10,16,17. Baseplating is het lijmen van een bodemplaat op het hoofd van een dier, zodat de miniscoop uiteindelijk bovenop het dier kan worden gemonteerd en de fluorescentiesignalen van neuronen kan worden gefilmd (figuur 1B). Deze procedure omvat het gebruik van tandcement om de bodemplaat op de schedel te lijmen (figuur 1C), maar de krimp van tandcement kan onaanvaardbare veranderingen veroorzaken in de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens ^8,17. Als de verschoven afstand tussen de twee lenzen te groot is, kunnen cellen niet scherp worden gesteld.

Gedetailleerde protocollen voor diepe calciumbeeldvormingsexperimenten in de hersenen met behulp van miniscopen zijn al gepubliceerd⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. De auteurs van deze protocollen hebben het Inscopix-systeem gebruikt⁸^,¹⁰^,¹⁶ of andere aangepaste ontwerpen¹⁷ en hebben de experimentele procedures voor virale selectie, chirurgie en baseplate attachment beschreven. Hun protocollen kunnen echter niet precies worden toegepast op andere open-sourcesystemen, zoals het V3 UCLA Miniscope-systeem, NINscope⁶en Finchscope¹⁹. Verkeerde uitlijning van de twee lenzen kan optreden tijdens de opname in een configuratie met twee lenzen met een UCLA-miniscoop vanwege het type tandcement dat wordt gebruikt om de bodemplaat aan de schedel te cementeren⁸^,¹⁷ (Figuur 1C). Het huidige protocol is nodig omdat de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens gevoelig is voor verschuiving als gevolg van de ongewenste krimp van tandcement tijdens de baseplating-procedure. Tijdens baseplating moet de optimale werkafstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens worden gevonden door de afstand tussen de miniscoop en de bovenkant van de relaislens aan te passen, en de bodemplaat moet vervolgens op deze ideale locatie worden gelijmd. Nadat de juiste afstand tussen de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens is ingesteld, kunnen longitudinale metingen worden verkregen met cellulaire resolutie (Figuur 1B; in vivo opname). Omdat het optimale bereik van werkafstanden van een relaislens klein is (50 - 350 μm)⁴^,⁸kan overmatige cementkrimp tijdens het uitharden het moeilijk maken om de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens binnen het juiste bereik te houden. Het algemene doel van dit rapport is om een protocol te bieden om de krimpproblemen te verminderen⁸^,¹⁷ die optreden tijdens de baseplating-procedure en om het slagingspercentage van miniscoopregistraties van fluorescentiesignalen in een configuratie met twee lenzen te verhogen. Succesvolle miniscoopopname wordt gedefinieerd als opname van een livestream van merkbare relatieve veranderingen in de fluorescentie van individuele neuronen in een vrij gedragend dier. Hoewel verschillende merken tandcement verschillende krimpsnelheden hebben, kunnen onderzoekers een merk selecteren dat eerder is getest⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,²². Niet elk merk is echter gemakkelijk te verkrijgen in sommige landen / regio's vanwege de importvoorschriften voor medische materialen. Daarom hebben we methoden ontwikkeld om de krimpsnelheden van beschikbare tandheelkundige cementen te testen en, belangrijker nog, een alternatief protocol te bieden dat het krimpprobleem minimaliseert. Het voordeel ten opzichte van het huidige baseplating protocol is een toename van het slagingspercentage van calcium beeldvorming met gereedschappen en cement dat gemakkelijk kan worden verkregen in laboratoria. De UCLA-miniscoop wordt als voorbeeld gebruikt, maar het protocol is ook van toepassing op andere miniscopen. In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerde baseplating-procedure en bevelen we ook enkele strategieën aan voor het monteren van het UCLA-miniscoopsysteem met twee lenzen (Figuur 2A). Zowel voorbeelden van succesvolle implantatie (n = 3 muizen) als voorbeelden van mislukte implantatie (n = 2 muizen) voor de configuratie met twee lenzen met de UCLA-miniscoop worden samen met de discussies gepresenteerd om de redenen van de successen en mislukkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de National Taiwan University Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: NTU-109-EL-00029 en NTU-108-EL-00158).

1. Beoordeling van de volumeverandering van tandcement

OPMERKING: Veranderingen in het volume tandcement treden op tijdens het uithardingsproces. Test de volumeveranderingen van tandcement vóór implantatie en baseplating. Onderzoekers kunnen elk merk tandcement testen en het merk met de laagste volumeverandering gebruiken om de bodemplaat te cementeren. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 3.

Weeg 0,5 g van elk tandcementpoeder af en meng dit met de juiste oplossing (1 ml).
OPMERKING: De aanbevolen poeder/vloeistofverhouding in de tandheelkundige cementinstructies is 0,5 g poeder tot 0,25 ml van de oplossing om een vaste vorm te verkrijgen. Dit testprotocol verdunt de verhouding tot 0,5 g/ml, zodat het mengsel in vloeibare vorm kan worden aangezogen om de volumeverandering in pipetpunten te meten.
Gebruik 0,1-10 μL pipetpunten om 2,5 μL van het tandcementmengsel te verwijderen en sluit vervolgens de pipetpunt af met een lichte uithardingslijm.
Plaats de uiteinden op een rek, markeer de bovenste niveaus van het tandheelkundige cementmengsel en meet het niveau van het tandheelkundige cementmengsel na 40 minuten (aanvullende video S1).
Naast het bewaken van de niveauveranderingen tijdens het uitharden van tandcement in de uiteinden, meet u de resterende droge tandcementdichtheid. Om de dichtheid te berekenen, meet u het gewicht van het tandcement en meet u het volume met het principe van Archimedes.
1. Kortom, plaats het resterende droge tandcement in een beker gevuld met water en weeg het water dat overloopt.
Gebruik het tandcement met de minste krimp voor alle onderstaande protocollen.

2. Anesthesie, chirurgische implantatie, virale injectie en dummy baseplating

Anesthesie
OPMERKING: Dit rapport heeft tot doel de operatie- en baseplatingprocedure voor de UCLA-miniscoop te optimaliseren; daarom werd aangenomen dat de optimale virale titer voor het infecteren van de doelhersengebieden bekend was. De methoden voor het vinden van de optimale virale titer zijn te vinden in stap 1 tot en met 5 van Resendez et al.⁸. Zodra de virale verdunning is geoptimaliseerd, kan chirurgische implantatie worden gestart.
1. Plaats de muis in een inductiecontainer en geef zuurstof (100% bij een luchtdebiet van 0,2 l/min). Preoxygeneer de muis gedurende 5 tot 10 minuten.
2. Dien 5% isofluraan gemengd met 100% zuurstof (luchtdebiet: 0,2 l/min) toe totdat de muis zijn evenwicht begint te verliezen en uiteindelijk wordt verdoofd.
3. Verwijder de muis uit de inductiekamer en injecteer atropine (0,04 mg/kg; subcutane injectie) om de ophoping van speeksel en buprenorfine (0,03 mg/kg; subcutane injectie) als analgeticum te voorkomen.
4. Scheer het hoofd van de muis.
5. Draag een masker, steriele jurk en handschoenen. Bereid een steriele ruimte en steriele chirurgische instrumenten voor op een operatie. Stabiliseer het hoofd van de muis (onderhoud anesthesie met 3 tot 2,5% isofluraan tijdens deze stap) op het stereotaxische apparaat. Zorg er na de pijnstillende en anesthetische procedures voor dat de oorstaven het hoofd stevig stabiliseren. Zorg voor thermische ondersteuning.
6. Zorg ervoor dat het hoofd in een rechte positie staat, steriliseer het geschoren hoofd met betadine en spuit het hoofd vervolgens met xylocaïne (10%), een lokaal analgeticum.
7. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
  OPMERKING: Gebruik oogzalf voor oogbescherming tijdens alle anesthetische gebeurtenissen om oogletsel te voorkomen.
8. Test de diepe pijnreflex van het dier door in zijn achterpoot te knijpen. Zodra het dier geen pootontwenningsreflex vertoont, gaat u verder met chirurgische ingrepen.
9. Maak een kleine incisie langs het middelste sagittale vlak van de schedel (beginnend bij ongeveer 2 mm voor de bregma en eindigend ongeveer 6 mm achter de bregma). Reinig vervolgens het bindweefsel op de schedel en veranker drie roestvrijstalen schroeven op de linker frontale en interpariëtale botten.
  1. Verminder op dit punt het isofluraan tot 1-2%. Controleer de ademhalingsfrequentie tijdens de hele chirurgische ingreep. Als de ademhalingsfrequentie te langzaam is (ongeveer 1/s, afhankelijk van het dier), verlaag dan de concentratie isofluraan.
10. Voer een craniotomie uit voor de implantatie van de relaislens onder een chirurgische microscoop of stereomicroscoop met behulp van een braamboor met een tipdiameter van 0,7 mm. Gebruik een microboor om de braamboor te pakken en een omtrek van het beoogde cirkelgebied te tekenen (de volledige dikte van het calvarium hoeft niet te worden gepenetreerd).
  OPMERKING: De relaislens die in het huidige protocol wordt gebruikt, had een diameter van 1,0 mm, een lengte ~ 9,0 mm een toonhoogte van 1 en een werkafstandsbereik van ~ 100 μm - 300 μm; daarom had de craniotomie een diameter van 1,2 mm.
  1. Verdiep de omtrek voorzichtig totdat de dura bloot komt te liggen.
  2. Bereid 3 ml steriele zoutoplossing in een spuit van 3 ml en koel deze af in een ijsemmer. Spoel het blootgestelde gebied regelmatig af met 0,1 ml zoutoplossing uit de spuit om het gebied af te koelen en hitteschade en bloedingen te voorkomen.
11. Pluk en pel de dura lichtjes af met een 27G naald.
12. Plaats een markering op een stompe naald van 27 G op 1 mm van de punt en gebruik deze om de cortex van de hersenen zorgvuldig op te zuigen om een venster te creëren voor lensimplantatie 8,11,13,17 (figuur 2B1). Maak indien nodig een stompe naald door de punt van een injectienaald van 27 G met schuurpapier te vermalen. Sluit vervolgens de naald aan op een spuit, sluit de spuit aan op een buis en sluit de buis aan op een zuigbron om een vacuüm te creëren.
  OPMERKING: De relaislens is bot en zal het hersenweefsel comprimeren wanneer het in het diepe hersengebied wordt geplaatst. Aspiratie van de cortex vermindert dus weefselschade als gevolg van estafettelensimplantatie. De cortex is ongeveer 1 mm dik bij muizen, maar is moeilijk te visualiseren onder een stereomicroscoop. Het merkteken creëert een oriëntatiepunt om de diepte van de naald nauwkeuriger te kunnen bepalen dan met een stereomicroscoop alleen. Bovendien kan men bepalen of het cortexgebied is bereikt of gepasseerd, afhankelijk van de weerstand; het bovenste deel van de cortex voelt relatief zacht aan, terwijl het subcorticale gebied dicht aanvoelt. Daarom, zodra de textuur dichter begint aan te voelen, stop dan de aspiratie (figuur 2B3).
13. Bereid 3 ml steriele zoutoplossing in een spuit van 3 ml en koel deze af in een ijsemmer. Spoel het gebied met zoutoplossing om het bloeden te stoppen en de kans op hersenoedeem te verminderen.
Adeno-geassocieerd virus (AAV) injectie
OPMERKING: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE werd gebruikt in dit experiment. jGCaMP7s is een genetisch gecodeerde calciumindicator die groene fluorescentie uitzendt³. Omdat de huidige studie een wild-type muis als onderwerp gebruikte, was een virale vector nodig om de neuronen te transfecteren met het groen-fluorescerende calciumindicatorgen en de expressie mogelijk te maken. Onderzoekers die transgene muizen gebruiken die de groen-fluorescerende calciumindicator tot expressie brengen, omdat hun proefpersonen protocol 2.2 kunnen overslaan.
1. Monteer de binnenste naald van een intraveneuze katheter van 20 G (i.v.) op de stereotaxische arm en prik de hersenen langzaam (~100 - 200 μm/min) door op de juiste coördinaten (dezelfde coördinaten die worden gebruikt tijdens de implantatie van de relaislens) (figuur 2B3).
2. Laat de micro-injectienaald met een snelheid van 100-200 μm/min in de ventrale CA1 zakken en injecteer (~ 25 nL/min) 200 nL van de virale vector in het doelgebied (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML en -3,50 mm DV van de bregma).
3. Wacht 10 minuten om het virus te laten diffunderen en de terugstroom te minimaliseren.
4. Trek de microinjectielaald op (~100-200 μm/min).
Implantatie van relaislenzen
1. Desinfecteer de relaislens met 75% alcohol^10,16 en spoel vervolgens af met pyrogene zoutoplossing. Week de lens in koude pyrogene-vrije zoutoplossing tot implantatie.
  OPMERKING: Een koude lens minimaliseert hersenoedeem wanneer het in de hersenen wordt geplaatst.
2. Houd de relaislens vast met behulp van een micro-bulldogklem (figuur 2B3) waarvan de tanden zijn bedekt met krimpkousen.
  OPMERKING: De bulldogklem kan de lens stevig vasthouden zonder deze te beschadigen. Raadpleeg Resendez et ^al.8 voor de methode om de met slangen bedekte bulldog te laten klemmen.
3. Plaats de relaislens langzaam (~ 100 - 200 μm / min) bovenop het doelgebied (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML en -3,50 mm DV van de bregma) en stabiliseer deze met tandcement.
Dummy baseplating
OPMERKING: Het doel van "dummy baseplating" tijdens de implantatiechirurgie is om een tandheelkundige cementbasis te creëren om de hoeveelheid tandheelkundig cement te verminderen die enkele weken later tijdens de echte baseplating-procedure moet worden aangebracht. Op deze manier wordt het risico op een verandering in het volume van het tandcement geminimaliseerd.
1. Bevestig de objectieflens aan de onderkant van de miniscoop en monteer de bodemplaat op de miniscoop (in deze stap is de assemblage van de verankerde objectieflens, bodemplaat en miniscoop nog niet over de schedel van de muis geplaatst).
2. Wikkel 10 cm paraffinefolie rond de buitenkant van de bodemplaat (figuur 4A).
3. Houd de miniscoop vast met de stereotaxische armsonde met behulp van herbruikbare kleefklei.
4. Lijn de objectieflens uit op de relaislens met zo min mogelijk ruimte tussen de lenzen (figuur 4B).
5. Gebruik tandcement om de positionering van de bodemplaat vast te zetten (zodat het cement alleen de paraffinefilm raakt).
6. Wanneer het tandcement is opgedroogd, verwijdert u de film.
7. Verwijder de bodemplaat en de miniscoop. De cementbasis van het tandcement is hol (figuur 4B).
8. Om de relaislens te beschermen tegen dagelijkse activiteiten en tegen krassen door de muis, sluit u de relaislens af met wat gegoten siliconenrubber totdat de relaislens is bedekt en bedekt u het siliconenrubber met een dunne laag tandcement (figuur 4B).
9. Ontkoppel de muis van de stereotaxische instrumenten en plaats de muis in een herstelkamer.
10. Injecteer carprofen (5 mg/kg; subcutane injectie) of meloxicam (1 mg/kg; subcutane injectie) voor analgesie en ceftazidim (25 mg/kg; subcutane injectie) om infectie te voorkomen.
  OPMERKING: Het gebruik van antibiotica is geen alternatief voor een aseptische techniek. Perioperatieve antibiotica (d.w.z. ceftazidim) kunnen in bepaalde omstandigheden geïndiceerd zijn, zoals langdurige operaties of plaatsing van chronische implantaten.
11. Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om de strengale lighouding te behouden.
12. Huisvest muizen individueel en injecteer meloxicam (1 mg /kg; subcutane injectie; q24h) gedurende één week om postoperatieve pijn te verlichten. Controleer het dier elke dag na de operatie om er zeker van te zijn dat het normaal eet, drinkt en poept.
13. Voer baseplating uit na 3 of meer weken.

3. Baseplating

OPMERKING: Gewoonlijk kan de baseplating-procedure (figuur 5) niet binnen 2-3 weken na de initiële procedure worden uitgevoerd vanwege de herstel- en virale incubatietijd. De inductieprocedures voor baseplating zijn vergelijkbaar met die beschreven in de stappen 2.1.1 tot en met 2.1.8. Baseplating is echter geen invasieve procedure en het dier heeft alleen lichte sedatie nodig. Daarom is 0,8-1,2% isofluraan voldoende, zolang het dier niet op het stereotaxische frame kan bewegen. Bovendien kan relatief lichte isofluraanane-anesthesie ook helpen bij het vergemakkelijken van de expressie van de fluorescentietransiënten van neuronen tijdens monitoring⁸ (Aanvullende video S2).

Snijd voorzichtig de dunne laag van het tandheelkundige cementdak met een botrongeur en verwijder het siliconenrubber. Reinig het oppervlak van de relaislens met 75% alcohol.
Bevestig een stelschroef naast de bodemplaat om deze aan de onderkant van de miniscoop te bevestigen (figuur 5A1).
OPMERKING: De bodemplaat moet stevig onder de onderkant van de miniscoop worden aangedraaid, omdat het verschil tussen een aangedraaide en licht bevestigde bodemplaat een inconsistente afstand kan veroorzaken.
Stel de scherpstelschuif in op ongeveer 2,7 - 3 mm van de hoofdbehuizing (figuur 5A2).
OPMERKING: Hoewel de lengte verder kan worden aangepast tijdens de baseplating-procedure, bevestigt u deze op ongeveer 2,7 mm, omdat het gelijktijdig aanpassen van de miniscooplengte en de optimale lengte tussen de geïmplanteerde relaislens en de preanchored objectieflens erg verwarrend is.
Sluit de miniscoop aan op het data-acquisitiebord en sluit deze aan op een USB 3.0-poort (of hogere versie) op een computer.
Voer de data-acquisitiesoftware uit die is ontwikkeld door het UCLA-team.
Stel de belichting in op 255, de winst op 64x en de excitatie-LED op 5%. Deze instellingen worden aanbevolen voor initiële baseplating; de specifieke instellingen zullen variëren afhankelijk van de hersengebieden en de expressieniveaus van de genetisch gecodeerde calciumindicator.
Klik op de knop Verbinden om de miniscoop te verbinden met de software voor gegevensverzameling en de livestream te bekijken.
Lijn de miniscoopobjectieflens met de hand uit op de relaislens en begin met zoeken naar de fluorescentiesignalen (figuur 5B₁).
OPMERKING: In eerste instantie vergemakkelijkt het handmatig zoeken naar het fluorescentiesignaal aanpassingen. Omdat een AAV-systeem werd gebruikt om de genetisch gecodeerde calciumindicator tot expressie te brengen, beïnvloedden zowel het promotortype als het AAV-serotype de efficiëntie van transfectie^23,24. Onderzoekers moeten de expressie van de calciumindicator controleren door individuele neuronen te vinden die veranderingen in fluorescentie vertonen voordat ze doorgaan met toekomstige experimenten.
Boor het tandcement op elke plaats waar het de miniscoop blokkeert (optioneel).
Bekijk de livestream van de data-acquisitiesoftware en gebruik de marge van de relaislens als oriëntatiepunt (aanvullende video S2). De marge van de relaislens verschijnt als een maanachtige grijze cirkel op de monitor (figuur 5B1; witte pijlen).
Zodra de relaislens is gevonden, past u de verschillende hoeken en afstanden van de miniscoop zorgvuldig aan totdat de fluorescentiesignalen zijn gevonden.
OPMERKING: De beelden van de neuronen zijn witter dan de achtergrond. Een precieze neuronale vorm geeft aan dat de neuronen perfect op het brandpuntsvlak van de relaislens liggen. Ronde neuronen suggereren dat ze zich in de buurt van het focale vlak bevonden. De neuronale vorm is anders in de hersenen, hier wordt ventrale CA1 als voorbeeld getoond.
Als geen enkel individueel neuron veranderingen in fluorescentie vertoont als functie van de tijd, sluit de basis dan opnieuw met siliconenrubber. Fluorescentie wordt niet waargenomen omdat de incubatietijd ook afhankelijk is van de eigenschap van het virus ^23,24. Voer stap 3.1-3.12 uit na een extra week. (Dit is optioneel).
Houd de miniscoop op de optimale positie en beweeg de stereotaxische arm met een herbruikbare kleefklei naar de miniscoop (figuur 5B2). Bevestig de miniscoop aan de stereotaxische arm met herbruikbare kleefklei.
Pas de x-, y- en z-armen enigszins aan om te zoeken naar de beste weergave (aanvullende video S2). Pas vervolgens de hoek tussen het oppervlak van de objectieflens en de relaislens aan door de oorstang, tandstaaf of herbruikbare kleefklei op de z-as te draaien. Virale expressie en lensimplantatie is succesvol wanneer ten minste één cel fluorescentietransiënten vertoont (figuur 6A; Aanvullende video S2) tijdens baseplating (wat ook afhankelijk is van het gebied van de hersenen, zoals de CA1).
OPMERKING: Als de monitor alleen witte cellen maar geen transiënten toont, is er een andere oorzaak (zie Figuur 6B,C, Aanvullende video's S4,S5, de sectie Resultaten en het gedeelte probleemoplossing).
Cementeer de bodemplaat (figuur 5B2) met het tandcement.
Controleer het gebied van belang tijdens het cementeren om ervoor te zorgen dat de optimale positie niet verandert.
Gebruik de kleinst mogelijke hoeveelheid cement terwijl u de bodemplaat nog steeds stevig op de cementbasis van het tandcement lijmt (figuur 5B2). Breng een tweede en derde laag cement aan rond de bodemplaat, maar pas op dat u de GRIN-lens niet beïnvloedt.
OPMERKING: Het aanbrengen van cement op de bodemplaat is in deze stap eenvoudiger omdat de basis van de bodemplaat werd gevormd tijdens de dummy-beplatingsprocedure.
Maak de miniscoop voorzichtig los van de bodemplaat wanneer het cement is uitgehard. Schroef vervolgens een beschermkap vast.
Verplaats het dier naar een herstelkooi. Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om de strengale lighouding te behouden.
Huismuizen individueel. Zorg ervoor dat het elke dag normaal eet, drinkt en poept. Wacht 5 dagen tot de muis volledig is hersteld en controleer vervolgens de calciumbeeldvorming.
OPMERKING: Er is slechts een kleine hoeveelheid tandcement die de bodemplaat vasthoudt. Daarom, als de bodemplaat aanzienlijk is verschoven sinds de baseplating-procedure, verwijder het tandcement met een boor en voer de baseplating-procedure opnieuw uit.
Anesthetine (door intraperitoneale injectie van een ketamine (87 mg/kg) /xylazine (13 mg/kg) mengsel) en perfuseer²⁵ het dier wanneer alle experimenten zijn uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beoordeling van de volumeverandering van het tandcement
Aangezien het volume tandcement tijdens het uithardingsproces verandert, kan dit de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, aangezien de werkafstand van een GRIN-lens ongeveer 50 tot 350 μm ^4,8 is. Daarom werden in dit geval twee in de handel verkrijgbare tandheelkundige cementen getest, Tempron en Tokuso, vóór de implantatie- en baseplatingprocedure (figuur 5

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige rapport beschrijft een gedetailleerd experimenteel protocol voor onderzoekers die het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen gebruiken. De tools die in ons protocol zijn ontworpen, zijn relatief betaalbaar voor elk laboratorium dat in vivo calciumbeeldvorming wil proberen. Sommige protocollen, zoals virale injectie, lensimplantatie, dummy baseplating en baseplating, kunnen ook worden gebruikt voor andere versies van het miniscoopsysteem om het succespercentage van calciumbeeldvorming te verbeteren. A...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit is geen door de industrie gesteunde studie. De auteurs melden geen financiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	voor chirurgie
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	voor testen van tandcement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	voor chirurgie
27 G naald	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	voor chirurgie
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	voor virale injectie
Atropine sulfaat		Astart; Hsinchu, Taiwan	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	voor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Herbruikbare kleefklei; voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Boten Ronger Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	voor baseplating
Buprenorfine		INDIVIOR; UK	voor chirurgie
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesie
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	infectie voorkomen
Data Acquisition PCB voor UCLA Miniscope	gekocht op https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		voor baseplating
Tandcement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	voor testen van tandcement
Tandcement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	voor testen van tandcement/chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard met muis en rat adapter	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Duratear zalf		Alcon; Geneva, Zwitserland	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesie
Isofluraan		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	voor vergelijking met V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	voor euthanasie
Normale zoutoplossing			voor chirurgie
Micro bulldog klemmen	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	voor lensimplantatie
Microliter Microsyringes, 2,0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Zwitserland	voor virale injectie
Vormsel siliconenrubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italië	voor dummy baseplating
Objectief Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	voor dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	voor dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	voor chirurgie
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	voor dummy baseplating/baseplating
Roestvrijstalen ankerschroeven	1,00 mm diameter, totale lengte 3,00 mm		voor chirurgie
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Stereotactisch apparaat	#51673	Stoelting; IL, USA	voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Duitsland	voor testen van tandcement
V3 UCLA Miniscope	gekocht op https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating
Xylazin	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	voor euthanasie
Xylocaine pomp spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Zweden	voor chirurgie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141(2019).
Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659(2020).
Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548(2020).
Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579(2017).
Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).
Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001(2017).
Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Miniscope beeldvorming calciumtransi nten baseplating bij muizen implantatie van relaislenzen tandheelkundig cement fluorescentiesignalen stereotaxische chirurgie beeldvorming van neurale activiteit virale vectorinjectie

Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen