De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurowetenschappers gebruiken miniatuurmicroscopen (miniscopen) om neuronale activiteit bij vrij gedragende dieren te observeren. Het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA) biedt open bronnen voor onderzoekers om zelf miniscopen te bouwen. De V3 UCLA Miniscope is een van de meest populaire open-source miniscopen die momenteel in gebruik zijn. Het maakt beeldvorming mogelijk van de fluorescentietransiënten die worden uitgezonden door genetisch gemodificeerde neuronen door een objectieve lens geïmplanteerd op de oppervlakkige cortex (een systeem met één lens), of in diepe hersengebieden door een combinatie van een relaislens geïmplanteerd in de diepe hersenen en een objectieve lens die is voorgeanchoreerd in de miniscoop om het doorgegeven beeld te observeren (een systeem met twee lenzen). Zelfs onder optimale omstandigheden (wanneer neuronen fluorescentie-indicatoren uitdrukken en de relaislens correct is geïmplanteerd), kan een volumeverandering van het tandcement tussen de bodemplaat en de bevestiging ervan aan de schedel bij cementuitharding een verkeerde uitlijning veroorzaken met een veranderde afstand tussen de objectief- en relaislenzen, wat resulteert in de slechte beeldkwaliteit. Een bodemplaat is een plaat die helpt de miniscoop op de schedel te monteren en de werkafstand tussen het objectief en de relaislenzen vast te stellen. Veranderingen in het volume van het tandcement rond de bodemplaat veranderen dus de afstand tussen de lenzen. Het huidige protocol heeft tot doel het verkeerde uitlijningsprobleem veroorzaakt door volumeveranderingen in het tandcement te minimaliseren. Het protocol vermindert de verkeerde uitlijning door een eerste fundering van tandcement te bouwen tijdens de implantatie van relaislenzen. De hersteltijd na implantatie is voldoende voor de fundering van tandcement om de bodemplaat volledig uit te harden, zodat de bodemplaat op deze steiger kan worden gecementeerd met zo min mogelijk nieuw cement. In dit artikel beschrijven we strategieën voor baseplating bij muizen om beeldvorming van neuronale activiteit mogelijk te maken met een objectieve lens verankerd in de miniscoop.
Inleiding
Fluorescerende activiteitsreporters zijn ideaal voor beeldvorming van de neuronale activiteit omdat ze gevoelig zijn en een groot dynamisch bereik hebbenvan 1,2,3. Daarom gebruikt een toenemend aantal experimenten fluorescentiemicroscopie om neuronale activiteit direct te observeren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de National Taiwan University Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: NTU-109-EL-00029 en NTU-108-EL-00158).
1. Beoordeling van de volumeverandering van tandcement
OPMERKING: Veranderingen in het volume tandcement treden op tijdens het uithardingsproces. Test de volumeveranderingen van tandcement vóór implantatie en baseplating. Onderzoekers kunnen elk merk tandcement testen en het merk met de laagste volumeverandering gebruiken om de bodemplaat te cementeren. Een voorbeeld is weergegeven in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Beoordeling van de volumeverandering van het tandcement
Aangezien het volume tandcement tijdens het uithardingsproces verandert, kan dit de beeldkwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, aangezien de werkafstand van een GRIN-lens ongeveer 50 tot 350 μm 4,8 is. Daarom werden in dit geval twee in de handel verkrijgbare tandheelkundige cementen getest, Tempron en Tokuso, vóór de implantatie- en baseplatingprocedure (figuur 5
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het huidige rapport beschrijft een gedetailleerd experimenteel protocol voor onderzoekers die het UCLA Miniscope-systeem met twee lenzen gebruiken. De tools die in ons protocol zijn ontworpen, zijn relatief betaalbaar voor elk laboratorium dat in vivo calciumbeeldvorming wil proberen. Sommige protocollen, zoals virale injectie, lensimplantatie, dummy baseplating en baseplating, kunnen ook worden gebruikt voor andere versies van het miniscoopsysteem om het succespercentage van calciumbeeldvorming te verbeteren. A.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dit is geen door de industrie gesteunde studie. De auteurs melden geen financiële belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | voor chirurgie |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | voor testen van tandcement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | voor chirurgie |
| 27 G naald | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | voor chirurgie |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | voor virale injectie |
| Atropine sulfaat | Astart; Hsinchu, Taiwan | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | voor dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Herbruikbare kleefklei; voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating |
| Boten Ronger Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | voor baseplating |
| Buprenorfine | INDIVIOR; UK | voor chirurgie | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesie |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | infectie voorkomen | |
| Data Acquisition PCB voor UCLA Miniscope | gekocht op https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | voor baseplating | |
| Tandcement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | voor testen van tandcement |
| Tandcement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | voor testen van tandcement/chirurgie/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard met muis en rat adapter | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear zalf | Alcon; Geneva, Zwitserland | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesie | |
| Isofluraan | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | voor vergelijking met V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | voor euthanasie | |
| Normale zoutoplossing | voor chirurgie | ||
| Micro bulldog klemmen | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | voor lensimplantatie |
| Microliter Microsyringes, 2,0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Zwitserland | voor virale injectie |
| Vormsel siliconenrubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italië | voor dummy baseplating |
| Objectief Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | voor dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | voor dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | voor chirurgie |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | voor dummy baseplating/baseplating |
| Roestvrijstalen ankerschroeven | 1,00 mm diameter, totale lengte 3,00 mm | voor chirurgie | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotactisch apparaat | #51673 | Stoelting; IL, USA | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Duitsland | voor testen van tandcement |
| V3 UCLA Miniscope | gekocht op https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | voor chirurgie/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazin | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | voor euthanasie |
| Xylocaine pomp spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Zweden | voor chirurgie |
Referenties
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Dana, H., et a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
