Methodenartikel

Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen

DOI:

10.3791/62618

⸱

3 mei 2021

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit methodeartikel beschrijft de belangrijkste stappen in het meten van H + -lek over het binnenste mitochondriale membraan met de patch-clamp-techniek, een nieuwe benadering om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale thermogenese (ook bekend als mitochondriale ontkoppeling) is een van de meest veelbelovende doelen voor het verhogen van het energieverbruik om het metabool syndroom te bestrijden. Thermogene weefsels zoals bruine en beige vetten ontwikkelen zeer gespecialiseerde mitochondriën voor warmteproductie. Mitochondriën van andere weefsels, die voornamelijk ATP produceren, zetten ook tot 25% van de totale mitochondriale energieproductie om in warmte en kunnen daarom een aanzienlijke invloed hebben op de fysiologie van het hele lichaam. Mitochondriale thermogenese is niet alleen essentieel voor het handhaven van de lichaamstemperatuur, maar voorkomt ook door voeding veroorzaakte obesitas en vermindert de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade. Aangezien mitochondriale thermogenese een belangrijke regulator is van het cellulaire metabolisme, zal een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces helpen bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden. Belangrijk is dat de precieze moleculaire mechanismen die acute activering van thermogenese in mitochondriën regelen, slecht gedefinieerd zijn. Dit gebrek aan informatie is grotendeels te wijten aan een gebrek aan methoden voor de directe meting van ontkoppelende eiwitten. De recente ontwikkeling van patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën maakte voor het eerst de directe studie mogelijk van het fenomeen aan de oorsprong van mitochondriale thermogenese, H + lek door de IMM, en de eerste biofysische karakterisering van mitochondriale transporters die ervoor verantwoordelijk zijn, het ontkoppelende eiwit 1 (UCP1), specifiek van bruine en beige vetten, en de ADP / ATP-transporter (AAC) voor alle andere weefsels. Deze unieke aanpak zal nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die H + -lekkage en mitochondriale thermogenese beheersen en hoe ze kunnen worden gericht op het bestrijden van het metabool syndroom. Dit artikel beschrijft de patch-clamp-methodologie die wordt toegepast op mitochondriën om hun thermogene capaciteit te bestuderen door H + - stromen rechtstreeks te meten via de IMM.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën staan bekend als de krachtpatser van de cel. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste bron van chemische energie, ATP. Wat minder bekend is, is dat mitochondriën ook warmte genereren. In feite genereert elk mitochondrion constant de twee soorten energieën (ATP en warmte) en een fijne balans tussen de twee energievormen definieert metabole celhomeostase (figuur 1). Hoe mitochondriën energie verdelen tussen ATP en warmte is zeker de meest fundamentele vraag op het gebied van bio-energetica, hoewel het nog grotendeels onbekend is. We weten wel dat het verhogen van de mitochondriale warmteproductie (mitochondriale thermogenese genoemd) en bijgevolg het verminderen van de ATP-productie het energieverbruik verhoogt en dit is een van de beste manieren om het metabool syndroom te bestrijden1.

Mitochondriale thermogenese is afkomstig van H+ lek over het binnenste mitochondriale membraan (IMM), wat leidt tot ontkoppeling van substraatoxidatie en ATP-synthese met daaruit voortvloeiende productie van warmte, vandaar de naam "mitochondriale ontkoppeling"1 (figuur 1). Dit H+ lek is afhankelijk van mitochondriale transporters die ontkoppelende eiwitten (UCP's) worden genoemd. UCP1 was het eerste UCP dat werd geïdentificeerd. Het wordt alleen uitgedrukt in thermogene weefsels, bruin vet en beige vet waarin mitochondriën gespecialiseerd zijn voor warmteproductie 2,3,4. De identiteit van UCP in niet-vetweefsels zoals skeletspieren, hart en lever is controversieel gebleven. Mitochondriën in deze weefsels kunnen ongeveer 25% van de totale mitochondriale energie omzetten in warmte, wat de fysiologie van het hele lichaam aanzienlijk kan beïnvloeden1. Naast het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam, voorkomt mitochondriale thermogenese ook door voeding veroorzaakte obesitas door calorieën te verminderen. Bovendien vermindert het de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) door mitochondriën om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade1. Mitochondriale thermogenese is dus betrokken bij normale veroudering, leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en andere aandoeningen met oxidatieve stress, zoals ischemie-reperfusie. Daarom is mitochondriale thermogenese een krachtige regulator van cellulair metabolisme, en een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces zal de ontwikkeling van therapeutische strategieën bevorderen om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden.

Mitochondriale ademhaling was de eerste techniek die de cruciale rol van mitochondriale thermogenese in het cellulaire metabolisme onthulde en is nog steeds de meest populaire in de gemeenschap1. Deze techniek is gebaseerd op het meten van het zuurstofverbruik door de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) die toeneemt wanneer mitochondriaal H+ lek wordt geactiveerd. Deze techniek, hoewel instrumenteel, kan mitochondriaal H + -lek over de IMM1 niet rechtstreeks bestuderen, waardoor de precieze identificatie en karakterisering van de eiwitten die ervoor verantwoordelijk zijn moeilijk wordt, met name in niet-vetweefsels waarin warmteproductie secundair is in vergelijking met ATP-productie. Onlangs leverde de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek toegepast op mitochondriën de eerste directe studie van H + -lek over het hele IMM in verschillende weefsels 5,6,7.

De mitochondriale patch-clamp van de hele IMM werd voor het eerst op een reproduceerbare manier vastgesteld door Kirichok et al.8. Ze beschreven de eerste directe meting van mitochondriale calcium uniporter (MCU) stromen in 2004 met behulp van mitoplasten uit COS-7 cellijnen8. Later toonde het Kirichok-lab calciumstromen van IMMS van muis9- en Drosophila-weefsels 9. Andere laboratoria gebruiken deze techniek nu routinematig om de biofysische eigenschappen van MCU 10,11,12,13,14 te bestuderen. Hele IMM patch-clamp analyse van kalium- en chloridegeleiding is ook mogelijk en is genoemd in verschillende artikelen, maar is nog niet het hoofdonderwerp geweest van een publicatie 6,7,9. De eerste meting van H + -stromen over de IMM werd gerapporteerd in 2012 van muisbruine vet mitochondriën6 en van muisbeige vet mitochondriën in 20177. Deze stroom is te wijten aan het specifieke ontkoppelingseiwit van thermogene weefsels, UCP1 6,7. Recent werk gepubliceerd in 2019 karakteriseerde OC als het belangrijkste eiwit dat verantwoordelijk is voor mitochondriaal H + -lek in niet-vetweefsels zoals het hart en de skeletspieren5.

Deze unieke aanpak maakt nu de directe hoge-resolutie functionele analyse mogelijk van de mitochondriale ionkanalen en transporters die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Om de uitbreiding van de methode te vergemakkelijken en andere studies zoals mitochondriale ademhaling aan te vullen, wordt hieronder een gedetailleerd protocol beschreven voor het meten van de H + -stromen die door UCP1 en AAC worden gedragen. Drie belangrijke stappen worden beschreven: 1) mitochondriale isolatie van muisbruin vet om UCP1-afhankelijke H + -stroom en mitochondriale isolatie van het hart te analyseren om AAC-afhankelijke H + -stroom te analyseren, 2) voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van het buitenste mitochondriale membraan (OMM), 3) patch-clamp-opnames van UCP1- en AAC-afhankelijke H + -stromen over de hele IMM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierexperimentele procedures die werden uitgevoerd, voldoen aan de richtlijnen van de National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

OPMERKING: De mitochondriale isolatieprocedure is gebaseerd op differentiële centrifugatie en varieert enigszins van weefsel tot weefsel. Omdat bruin vetweefsel bijvoorbeeld extreem rijk is aan lipiden, vereist het een extra stap om celresten en organellen van de lipidefase te scheiden voordat de mitochondriën worden geoogst. Om verwarring te voorkomen, worden de twee mitochondriale isolatieprocedures (een van het bruine vet en de andere van het hart) hieronder beschreven.

1. Mitochondriale isolatie van interscapulair bruin vet van muizen (gewijzigd van Bertholet et al. 2020)15

  1. Euthanaseer C57BL /6 mannelijke muis met behulp van CO 2-verstikking en daaropvolgende cervicale dislocatie, zoals aanbevolen door het American Veterinary Medical Association Panel en het IACUC-comité.
  2. Nadat je de muis met zijn buik naar de tafel hebt geplaatst, spuit je alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken (aangepast van Mann et al., 2014)16.
  3. Maak een incisie van 2 cm in de bovenrug na het vastpakken van de huid met een pincet.
  4. Extraheer het bruine interscapulaire vet van de muis dat overeenkomt met een tweelobbig orgaan met een vlindervorm16.
  5. Breng het bruine vet over in een petrischaaltje van 35 mm gevuld met 5 ml koude-isolatiebuffer (tabel 1) die eerder op ijs is geplaatst.
  6. Reinig het bruine vet van het witte vet onder een verrekijker.
  7. Breng het bruine vet over in een bekerglas van 10 ml met 5 ml koude isolatiebuffer (tabel 1) om het in dunne stukjes te hakken. Breng over op de ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 ml (kunststof polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper).
  8. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties / min.
  9. Centrifugeer het homogenaat bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C in een ijskoude conische buis van 15 ml. Gooi het supernatant met de lipidefase weg.
  10. Resuspend de pellet in 5 ml ijskoude isolatiebuffer (tabel 1) en homogeniseren, een tweede keer, de suspensie op ijs met zes langzame slagen met een snelheid van 275 rotatie / min.
  11. Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 700 x g om alle kernen en ongebroken cellen te pelleteren.
  12. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 ml en plaats het op ijs.
  13. Centrifugeer het supernatant bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om een pellet met mitochondriën te verkrijgen.
  14. Resuspend pellet met mitochondriën in 3,8 ml ijskoude hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10-15 minuten.

2. Mitochondriale isolatie van het muizenhart (gewijzigd van Garg et al. 2019)17

  1. Euthanaseer C57BL /6 mannelijke muis met behulp van CO 2-verstikking en daaropvolgende cervicale dislocatie, zoals aanbevolen door het American Veterinary Medical Association Panel en het IACUC-comité.
  2. Nadat je de muis op zijn rug hebt geplaatst, spray je alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken. Maak vervolgens een incisie van 2 cm op de thorax nadat u de huid met een pincet hebt vastgepakt.
  3. Ontleed het hart uit de borst van het dier en spoel het om al het bloed te verwijderen in een bekerglas van 10 ml met 5 ml koude-isolatieoplossing (tabel 1).
  4. Zodra het hart is ontdaan van bloedsporen, breng het over naar een ander bekerglas van 10 ml met 5 ml koude-isolatiebuffer (tabel 1) om het in dunne stukjes te hakken. Breng vervolgens over in een ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 ml (PTFE-stamper).
  5. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties / min.
  6. Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 700 x g tot pelletkernen en ongebroken cellen.
  7. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 ml en plaats het op ijs.
  8. Centrifugeer het supernatant bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om een pellet met mitochondriën te verkrijgen.
  9. Resuspend de mitochondriale pellet in 3,8 ml ijskoude hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10-15 minuten.

3. Voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van de OMM.

OPMERKING: De Franse persprocedure maakt het mogelijk dat de IMM wordt vrijgegeven van de OMM met behoud van zijn integriteit, inclusief de matrix en crista (figuur 2)18. Mitochondriën worden voorgeïncubeerd in een hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en onderworpen aan een lagere druk tijdens de Franse persprocedure om drastische uitrekking van de IMM te voorkomen wanneer de OMM wordt gescheurd.

  1. Vul de mitochondriaal-hypertonische-mannitol-suspensie in een gekoelde minidrukcel (zuigerdiameter 3/8") van de Franse pers (figuur 3A).
  2. Selecteer de mediummodus van de French Press en comprimeer de suspensie door de minidrukcel op 110 op de wijzerplaat van de French Press voor de bruinvette mitochondriën en op 140 voor de hart mitochondriën (~ 2.000 psi).  Zorg ervoor dat de suspensie uit de minidrukcel komt met een snelheid van ongeveer 1 druppel/s.
  3. Verzamel de druppels in een 15 ml ijsgekoelde conische buis.
  4. Centrifugeer de suspensie bij 10.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  5. Resuspend de mitoplastenkorrel in 0,5-2 ml ijskoude Hypertonic-KCl-buffer (tabel 3) en bewaar de suspensie op ijs.
    OPMERKING: Bruin vet en hart mitoplasten zijn klaar voor patch-clamp opnames en moeten bruikbaar blijven voor ongeveer 3-6 uur.

4. Elektrofysiologische opnames van H+ lek via UCP1 en AAC 5,7,15

OPMERKING: Gebruik de volgende elektrofysiologische opstelling (figuur 3B): omgekeerde microscoop met differentieel interferentiecontrast (DIC), 60x waterdompelingsobjectief, trillingsisolatietafel en een kooi van Faraday, een standaardversterker die geluidsarme opnames ondersteunt, een standaard digitizer die wordt gebruikt voor elektrofysiologische opstelling, pClamp 10, een micromanipulator, badreferentieelektrode (3 M KCl-agar zoutbrug geplaatst in een micro-elektroderodehouder met een zilver/ zilverchloride pellet gegoten in het houderlichaam (beschreven in Liu et al. 2021)19, perfusiekamer met een glazen afdekvloer van 0,13 mm, verbonden met een door zwaartekracht gevoed perfusiesysteem.

  1. Trek de filamenten van borosilicaatglas op de dag van opname met behulp van een micropipette-trekker. Stel een programma in op de trekker die wordt gebruikt voor het genereren van pipetten met een hoge mate van reproduceerbaarheid20.
    OPMERKING: Dit programmaontwerp vereist verschillende pogingen om pipetten te verkrijgen die zijn geoptimaliseerd voor de IMM-patchklem. Een standaardpipet heeft fijne uiteinden met een progressieve conische vorm.
  2. Plaats een glazen gloeidraad in de trekker en trek om bijna twee identieke patchpipeten uit één borosilicaatfilament te verkrijgen.
  3. Pas het programma aan wanneer pipetten inconsistent worden tussen trekcycli als gevolg van veroudering van de gloeidraad van de verwarmingsdoos van de trekker.
  4. Plaats de pipet in de pipetpolijster en plaats de punt in de buurt van de gloeidraad onder 100x vergroting om deze vuur te polijsten.
  5. Druk meerdere keren op het voetpedaal om de gloeidraad te verwarmen zonder de tipcurve te verstoppen of te beschadigen.
  6. Pipetten met een weerstand tussen 25 en 35 MΩ worden gepolijst totdat pipetten op basis van TMA (TMA voor tetramethylammoniumhydroxide, tabel 4) worden gevuld.
  7. Voorincubeer coverslips (5 mm diameter, 0,1 mm dikte) met 0,1% gelatine om de adhesie van mitoplast te verminderen en spoel ze af met de KCl-badoplossing (tabel 5) voordat de mitoplast-suspensie wordt afgezet.
  8. Bereid een ruwe verdunning door ~35 μL van de geconcentreerde mitoplast-suspensie te mengen met 500 μL van de KCl-badoplossing (tabel 5) en plaats deze op coverslips die eerder in een put van een 4-well plaat zijn geplaatst.
  9. Incubeer op ijs gedurende 15 tot 20 minuten voor mitoplasten tot sediment op de deklip.
  10. Vul de badkamer volledig met ~50 μL van de KCl-badoplossing (tabel 5).
  11. Breng een coverslip met mitoplasten over in de kamer met behulp van een dun microdissectiepincet met een gebogen punt.
  12. Schik de coverslip aan de onderkant van de kamer. Laat de kamer niet perfuseren om de mitoplasten stabiel op de deklip te houden.
  13. Kies een individuele niet-klevende mitoplast in de vorm van 8 door de coverslip onder de microscoop te scannen met een 60x objectief.
  14. Laad de pipet met de pipetoplossing (~50 μL) en plaats deze in de pipethouder.
  15. Breng de pipet met een micromanipulator in de badoplossing en benader deze net boven de geselecteerde mitoplast om dicht bij de IMM te komen. Het versterkerprogramma geeft de weerstand van de pipet zodra deze in de badoplossing zit. Houd de membraanpotentiaal op 0 mV en pas 10 mV-pulsen toe met behulp van het membraantestcommando in het versterkerprogramma.
  16. Oefen lichte onderdruk uit om snel een gigaseal te creëren met de IMM (figuur 2B).
  17. Verhoog de pipet met de mitoplast bevestigd om ze uit de buurt van de afdekkingslip te houden om te voorkomen dat de afdichting breekt als gevolg van de pipetdrift tijdens het experiment.
  18. Compenseer de verdwaalde capaciteitstransiënten met het commando "membraantest" in het versterkerprogramma voordat de hele mitoplastconfiguratie wordt getest om een correcte capaciteitsmeting (Cm) voor het mitoplastmembraan na de inbraak te verkrijgen.
  19. Breng kortdurende (5-15 ms) spanningspulsen (250-600 mV) aan met het versterkerprogramma om de membraanpleister onder de glazen pipet te scheuren en de hele mitoplast-configuratie te bereiken (figuur 2C). Succesvolle inbraak wordt weerspiegeld door de terugkeer van capaciteitstransiënten.
  20. Pas na de inbraak de capaciteitstransiënten aan met de membraantestoptie van het versterkerprogramma om de membraancapaciteit (die de grootte van de mitoplast weerspiegelt) en de toegangsweerstand Ra (die de kwaliteit van de hele mitoplast-configuratie weerspiegelt) te beoordelen. Na de inbraak moet Ra tussen de 40 en 80 MΩ zijn. Mitoplasten (2-6 μm groot) die worden gebruikt voor patchklemexperimenten hebben doorgaans membraancapaciteiten van 0,5-1,1 pF.
  21. Vervang onmiddellijk na de inbraak de KCl-badoplossing (tabel 5) door de HEPES-badoplossing (tabel 6) door de perfusie te starten.
  22. Pas een 850 ms rampprotocol toe dat is ontworpen met het versterkerprogramma, van -160 mV tot +100 mV met een interval van 5 s, terwijl u de mitoplast op 0 mV houdt. Dit protocol werkt voor UCP1 6,7,15 en AAC5 studies (Figuur 4 en Figuur 5).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen voor UCP1- en AAC-afhankelijke H+ -stroommetingen om alle elektrofysiologische gegevens bij 10 kHz te verkrijgen en op 1 kHz te filteren met behulp van adequate software die de versterker en digitizer aandrijft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van de patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën leverde de eerste directe studie van H + lek door de IMM en de mitochondriale transporters, UCP1 en AAC, die ervoor verantwoordelijk zijn. De elektrofysiologische analyse van UCP1- en AAC-afhankelijke H+ -lekken kan een eerste blik werpen op de thermogene capaciteit van mitochondriën. De resultatensectie beschrijft de standaardprocedures voor het meten van H+ lekken via UCP1 en AAC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit methodeartikel heeft tot doel de patch-clamp-techniek te presenteren die onlangs is toegepast op mitochondriën, een nieuwe benadering om H + -lek rechtstreeks te bestuderen via de IMM die verantwoordelijk is voor mitochondriale thermogenese 5,6,7,15. Deze techniek is niet beperkt tot weefsels en kan ook worden gebruikt om H + -lekken en andere geleidingen van de IMM te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur verklaart geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ik dank Dr. Yuriy Kirichok voor de grote wetenschap waar ik deel van uitmaakte in zijn lab en de leden van het Kirichok lab voor de nuttige discussies. Ik dank ook Dr. Douglas C. Wallace voor het verstrekken van AAC1 knock-out muizen. Financiering: A.M.B werd ondersteund door een American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% gelatinMilliporeES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20OlympusUPLSAPO60XW
Axopatch 200B versterkerMolecular Devices
Borosilicaat glas capillairenSutter InstrumentsBF150-86-10
Digidata 1550B DigitizerMolecular Devices
Faraday kooiZelfgemaakt
French PressGlen Mills5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratorium overhead roerder
Omgekeerde microscoopOlympusIX71 of IX73
Micro Forge(Narishige)MF-830
Micromanipulator MPC-385Sutter InstrumentsFG-MPC325
Micro-elektrode houder voor agar brugWorld Precision InstrumentsMEH3F4515
Micropipet puller(Sutter Instruments)P97
Mini Cell voor French PressGlen Mills5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPMCole ParmerEW-50705-50
Objectief 100X vergrotingNikon  lensMPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10Molecular Devices
PerfusiekamerWarner InstrumentsRC-24E
Potter-Elvehjem homogenisator 10 mlWheaton358039
Gekoelde centrifuge SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
Kleine ronde glazen dekglasjes: 5 mm diameter, 0.1 mm dikteWarner Instruments640700
Vibratie-isolatie tafelNewportVIS3036-SG2-325A
Chemicaliën
D-gluconzuurSigma AldrichG1951
D-mannitol Sigma AldrichM4125
EGTA Sigma Aldrich3777
HEPES Sigma AldrichH7523
KCl Sigma Aldrich60128
MgCl2 Sigma Aldrich63068
sucrose Sigma AldrichS7903
TMA Sigma Aldrich331635
TrisBase Sigma AldrichT1503
TrisCl Sigma AldrichT3253

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
  5. Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
  6. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  7. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
  8. Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
  9. Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317(2012).
  10. Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704(2013).
  11. Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
  12. Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
  13. Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
  14. Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
  15. Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).
  16. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).
  17. Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
  18. Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
  19. Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
  20. Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
  21. Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondriale thermogeneseprotonlekkagebinnenste mitochondriale membraanontkoppelingsprotein 1bruikvettmitochondri nmitoplastpreparatieprotonstroommetingADP ATP transportermetabool syndroom

Gerelateerde artikelen