Methodenartikel

Chromosoomscreening van menselijke pre-implantatie-embryo's met behulp van gebruikt kweekmedium: monsterafname en chromosomale ploïdieanalyse

DOI:

10.3791/62619

⸱

7 september 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie rapporteert een protocol voor chromosoomscreening van menselijke embryo's waarbij gebruik wordt gemaakt van gebruikt kweekmedium, waardoor embryobiopsie wordt vermeden en chromosoomploïdie-identificatie met behulp van NGS mogelijk wordt. Het huidige artikel presenteert de gedetailleerde procedure, inclusief de voorbereiding van kweekmedium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) bibliotheekvoorbereiding en data-analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij klinische in-vitrofertilisatie (IVF) vereist de heersende methode voor PGT-A een biopsie van enkele cellen uit het trophectoderm (TE). Dit is de afstammingslijn die de placenta vormt. Deze methode vereist echter gespecialiseerde vaardigheden, is invasief en lijdt aan valse positieven en negatieven omdat het aantal chromosomen in de TE en de binnenste celmassa (ICM), die zich ontwikkelt tot de foetus, niet altijd hetzelfde zijn. NICS, een technologie die sequencing vereist van DNA dat vrijkomt in het kweekmedium van zowel TE als ICM, kan een uitweg bieden voor deze problemen, maar het is eerder aangetoond dat het een beperkte werkzaamheid heeft. De huidige studie rapporteert het volledige protocol van NICS, dat bemonsteringsmethoden voor kweekmediums, amplificatie van het hele genoom (WGA) en bibliotheekvoorbereiding omvat, en NGS-gegevensanalyse door analysesoftware. Gezien de verschillende cryopreservatietijden in verschillende embryolaboratoria, hebben embryologen twee methoden voor het verzamelen van embryokweekmedium die kunnen worden geselecteerd op basis van de werkelijke omstandigheden van het IVF-laboratorium.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geassisteerde voortplantingstechnologieën (ART's) worden steeds vaker gebruikt voor de behandeling van onvruchtbaarheid. Het slagingspercentage van ART, zoals IVF, is echter beperkt en het zwangerschapsverliespercentage is aanzienlijk hoger dan dat van de normale populatie1. De belangrijkste oorzaak van deze problemen zijn chromosomale afwijkingen, die vaak voorkomen in pre-implantatie menselijke embryo's2. PGT-A is een effectieve methode om embryo's te screenen op chromosomale balans vóór implantatie 3,4. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat PGT-A het aantal abortussen kan verminderen en het aantal zwangerschappen kan verbeteren 5,6,7,8. PGT-A vereist echter complexe technische expertise die specifieke training en ervaring vereist. De invasieve embryobiopsieprocedure kan mogelijk ook schade aan de embryo's veroorzaken9. Studies hebben aangetoond dat blastomeerbiopsie de latere ontwikkeling kan belemmeren en dat het aantal biopsieën van TE's de implantatiesnelheden kan beïnvloeden10. Hoewel het bioveiligheidsprobleem op lange termijn van embryobiopsie nog niet grondig is geëvalueerd bij mensen, hebben dierstudies aangetoond dat het een negatieve invloed heeft op de ontwikkeling van embryo's11,12,13.

Eerdere rapporten gaven aan dat sporen van DNA-materiaal werden uitgescheiden in het kweekmedium tijdens de ontwikkeling van het embryo, en er zijn inspanningen geleverd om uitgebreide chromosoomscreening (CCS) uit te voeren met behulp van gebruikt embryocultuurmedium 14,15,16,17,18. De detectiepercentages en de nauwkeurigheid van de tests voldeden echter niet aan de vereisten voor uitgebreid klinisch gebruik. De huidige studie rapporteerde een verbetering in de NICS-test voor het verhogen van de detectiepercentages en de nauwkeurigheid van de NICS-test19. In de afgelopen jaren is blastocoelevloeistof (BF) bestudeerd als een analytisch monster van minimaal invasieve PGT-A. Het aandeel van succesvolle genoombrede amplificatie en detecteerbaar DNA in blastocystvloeistofmonsters varieert echter van 34,8% tot 82%20,21,22. Het volume BF dat in verschillende onderzoeken wordt gerapporteerd, varieert van 0,3 nL tot 1 μL. Gezien de lage hoeveelheid DNA in BF is het mogelijk om de hoeveelheid celvrij DNA te verhogen door blastocystvloeistof en kweekmedium te mengen om het slagingspercentage en de consistentie van de detectie te verbeteren. Kuznyetsov et al.23 en Li et al.24 behandelden de zona pellucida met een laser en gaven blastocystvloeistof af in het kweekmedium om de totale hoeveelheid embryonaal DNA te verbeteren, en de amplificatiesnelheid van het gecombineerde medium/BF-monsters na WGA was respectievelijk 100% en 97,5%. Jiao et al.25 verkregen ook een slagingspercentage van 100% door dezelfde methode te gebruiken.

De huidige studie rapporteert een gedetailleerd protocol dat de voorbereiding van gebruikte mediamonsters, NGS-voorbereiding en gegevensanalyse omvat. Door zorgvuldig cumuluscellen uit eicellen te verwijderen, voerde de huidige studie intracytoplasmatische enkelvoudige sperma-injectie (ICSI) en blastocystkweek uit. Het medium van dag 4 - dag 5 / dag 6 werd verzameld voor de voorbereiding van de WGA- en NGS-bibliotheek. Door gebruik te maken van NICS-technologie stroomlijnde de huidige studie de voorbereidingsstappen van de WGA- en NGS-bibliotheek in ongeveer 3 uur en verkreeg het niet-invasieve CCS-resultaten in ongeveer 9 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische toestemming werd verkregen van de ethische commissie van het derde ziekenhuis van de Universiteit van Peking.

1. Voorbereiding

NOTITIE: De benodigde materialen en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

  1. Reagentia
    1. Voorverwarmen en equilibraat (gebalanceerd) 20-30 μL gametenmedium/bevruchtingsmedium en splijtings-/blastocyststadiumkweekmedium (bedekt met minerale olie) en hyaluronidase (in een goed afgesloten buisje) bij 37 °C, 5% CO 2 en 5% O2 in een Tri-gas incubator 's nachts voor gebruik.
    2. Verwarm hyaluronidase voor tot 37 °C op een werkblad in een zuurkast.
    3. Bereid de verglazingsbuffer en de monsterafnamereagentia voor volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Gereedschap
    1. Bereid monsterafname- en transferpipetten (binnendiameter van ~200 tot 250 μm), denudatie-/stripperpipetten (binnendiameter van ≥150 μm, ~130-140 μm en ~120 μm) en pipetten voor het wassen (binnendiameter van ~150 μm) voor door glazen pasteurpipetten te trekken om vuurgepolijste open fijne punten te genereren.
      OPMERKING: De pipetten die worden gebruikt voor het verzamelen/overbrengen van monsters, denudatie en wassen, kunnen direct worden gekocht. De houdnaalden en injectienaalden kunnen ook direct worden gekocht.

2. Protocol nr. 1: Monsterneming

  1. Voorbehandeling van oöcyt-corona-cumuluscomplex (OCCC's) vóór vertering met hyaluronidase
    1. Bereik ovariële stimulatie met zowel follikelstimulerend hormoon (FSH) als humane menopauzale gonadotrofine (hMG) preparaten. Wanneer de loodfollikel >18 mm is, gebruik dan 10.000 IE choriongonadotrofine (hCG) voor de uiteindelijke rijping van de eicel.
    2. Voer 36 uur na het triggershot het ophalen van de eicel uit. Pak de eicellen op en breng ze over in weefselkweekschaaltjes met 2,5 ml voorverwarmde m-HTF bedekt met minerale olie.
    3. Breng de OCCC's snel over naar het centrale putje van een orgaankweekschaaltje met 1 ml bevruchtingsmedium met behulp van een transferpipet en incubeer vervolgens met de eicellen bij 37 °C in een incubator van 5% CO 2 en 5 % O 2 gedurende2-4 uur.
  2. Verbeter OCCC's met hyaluronidase door 1 ml voorverwarmde hyaluronidase van 37 °C (80 IE/ml) toe te voegen aan het centrale putje van een orgaankweekschaaltje met OCCC's (stap 2.1.3). Houd de eindconcentratie hyaluronidase op 40 IE/ml en meng grondig.
    1. Incubeer de OCCC's gedurende 2 minuten op een thermisch platform van 37 °C. Observeer de veranderingen elke 30 seconden onder een microscoop totdat er nog maar 1-2 lagen granulosacellen overblijven.
  3. Denudatie van granulosacellen
    1. Breng de verteerde OCCC's snel over in de kweekschaal voor eicelbehandeling en bedek ze in elk putje met minerale olie.
    2. Observeer de gescheiden granulosacellen onder een microscoop. Zuig de eicellen voorzichtig op en laat ze 5 keer los om resterende granulosacellen rond de eicellen te verwijderen.
    3. Herhaal de vorige stap in de resterende 3 putjes om de granulosacellen volledig te verwijderen.
      OPMERKING: De bovenstaande stappen (2.1-2.3) kunnen worden uitgevoerd volgens de routinematige werking van elk laboratorium.
  4. Evaluatie van de eicel
    1. Evalueer de volledigheid van granulosacelverwijdering met behulp van een microscoop. Als de cellen niet volledig kunnen worden verwijderd, is het behoud van 5 of minder granulosacellen op dit moment acceptabel.
      OPMERKING: Als er nog steeds cumuluscellen aan de eicel vastzitten, kan het restant later op dag 3 worden verwijderd voordat het embryo wordt overgebracht van kweekmedium in het splitsingsstadium naar kweekmedium in het blastocyststadium.
  5. Breng na het uitvoeren van intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)26 de eicellen over in microdruppels van 20-30 μl splijtingsembryokweekmedium (één eicel komt overeen met één microdruppel) met behulp van transferpipetten en incubeer ze in een incubator van 37 °C, 5% CO 2 en 5 % O2.
    1. Noteer de dag van ICSI als dag 0. Controleer de embryo's en scoor volgens de Istanbul consensus workshop over embryobeoordeling van dag 1 voor bevruchting (ongeveer 18 uur), dag 2 (ongeveer 45 uur) en dag 3 (ongeveer 68 uur) voor embryosplitsing27.
  6. Embryo wassen
    1. Bereid 20-30 μl microdruppels blastocystkweekmedium voor elk embryo bedekt met minerale olie in weefselkweekschaaltjes op dag 2 in een incubator van 37 °C, 5% CO 2 en 5% O2.
    2. Bereid nog eens drie microdruppels bedekt met minerale olie en label de nieuwe weefselkweekschalen voor het wassen nr. 1-3.
    3. Breng de embryo's van dag 3 over in de wasmicrodruppels. Zuig de embryo's voorzichtig op en laat ze 3 keer in elke druppel los met behulp van denudatiepipetten.
      OPMERKING: Deze procedure kan ook helpen bij het verwijderen van de resterende korrelige cellen die aan het embryo zijn bevestigd.
    4. Observeer en evalueer de embryo's onder een microscoop op dag 3 voordat het medium werd veranderd van een kweekmedium in het splitsingsstadium naar een blastocystkweekmedium voor morfologische scores. Als er nog steeds cumuluscellen aan het embryo vastzaten, pipetteer dan op de juiste manier op en neer in een andere voorverwarmde en gebalanceerde blastocystkweekmediumdruppel bedekt met minerale olie met een stripperpipet totdat de cumuluscellen volledig waren verwijderd.
      OPMERKING: Alle aangehechte cumuluscellen moesten op dag 3 volledig worden verwijderd voordat het embryo werd overgebracht van de plaat van het kweekmedium in het splitsingsstadium naar de plaat van het kweekmedium in het blastocyststadium. Eventuele resterende cumuluscellen zullen interfereren met de uiteindelijke analyse en vals-negatieve resultaten geven.
  7. Twee opties voor het verzamelen van kweekmedia
    OPMERKING: Het IVF-centrum kan kiezen uit een van de twee methoden voor het verzamelen van kweekmedia op basis van de middelen, eisen en voorkeuren van het centrum.
    1. Optie 1: Embryowassen en kweken
      OPMERKING: Deze optie is voor IVF-laboratoria die vitrificatie uitvoeren op de ochtend van dag 5.
      1. Breng het embryo over in voorverwarmde (37 °C) microdruppels kweekmedium en was elk embryo voorzichtig serieel in 3 microdruppels door te pipetteren op dag 4 's middags.
      2. Breng elk embryo over in een unieke voorverwarmde (37 °C) enkele microdruppel kweekmedium voor monsterafname. Het volume van een enkele druppel kweekmedium mag niet groter zijn dan 25 μL.
      3. Voer blastocyst-embryokweek uit op dag 5/dag 6 bij 37 °C, 5% CO 2 en 5% O2.
    2. Optie 2: Embryo wassen en kweken
      OPMERKING: Deze optie is voor IVF-laboratoria die vitrificatie uitvoeren op dag 5 middag of dag 6.
      1. Breng het embryo over in voorverwarmde (37 °C) microdruppels van 10-15 μL kweekmedium en was elk embryo voorzichtig serieel in 3 microdruppels door op dag 5 te pipetteren.
      2. Breng elk embryo over in een unieke voorverwarmde (37 °C) enkele microdruppel kweekmedium voor monsterafname. Het volume van een enkele druppel kweekmedium mag niet groter zijn dan 15 μL.
      3. Voer blastocyst-embryokweek uit op dag 5/dag 6 bij 37 °C en 5% CO2.
  8. Sample Collectie
    1. Pas de ICM voorzichtig aan op een aanzienlijke afstand van het beoogde punt van de laserstraal, die zich richt op de celovergang van het trophectoderm om een klein gaatje in het trophectoderm te genereren om de vloeistof uit de blastocoelholte vrij te maken. Vervolgens worden de embryo's verplaatst naar een invriesoplossing voor cryopreservatie volgens het conventionele proces.
    2. Breng kweekmedium van elk gekweekt embryo over in een RNase/DNase-vrije PCR-buis met 5 μL cellysebuffer.
    3. Verzamel dezelfde hoeveelheid kweekmedium zonder te worden gebruikt voor embryokweek als negatieve controle. Vries alle verzamelde monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof in en bewaar ze vervolgens bij −80 °C nadat ze zijn verzameld totdat ze aan de NICS-test worden onderworpen.
  9. Voer vitrificatie uit zoals beschreven in het protocol.

3. Protocol 2: Bouw van bibliotheken

  1. Kweek medium lysis
    1. Verdun 1 μL positieve controle (10 ng humaan gDNA) met 199 μL vers kweekmedium. Meng grondig en centrifugeer de buis kort (200 x g gedurende 5 s).
    2. Breng 10 μL van dag 5-dag 6 blastocystkweekmedium, verdunde positieve controle en vers kweekmedium over naar nieuwe PCR-buisjes van 0,2 ml.
    3. Voeg 1 μL MT Enzyme Mix toe aan elke PCR-buis en meng grondig door te pipetteren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 2-3 s bij 200 x g.
    4. Plaats de PCR-buis(jes) uit stap 3.1.3 in een voorverwarmd NICS-monstervoorbereidingsstation en voer het lysisprogramma als volgt uit: 10 min bij 75 °C; 4 min bij 95 °C; houden bij 22 °C.
      OPMERKING: Het monstervoorbereidingsstation is vergelijkbaar met een standaard PCR-machine.
      1. Klik op het Lysis-pictogram om het installatiescherm te openen.
      2. Selecteer Tube voor Control-modus ; ingang 10 μL voor monstervolume; selecteer Aan voor Hotlid-regeling en voer 105 °C in voor de temperatuur. Selecteer Nee voor Pauzeren bij de eerste seg. Klik op OK om verder te gaan.
      3. Wacht tot Remain-tijd --:-- :-- aangeeft, wat het einde van het programma aangeeft, en klik vervolgens op Stop om het programma te beëindigen.
    5. Stop het programma nadat het proces is voltooid. Ga direct door naar de volgende stap.
  2. Pre-bibliotheek voorbereiding
    1. Ontdooi de Pre-Lib Buffer tot RT. Meng grondig door te pipetteren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 2-3 s op 200 x g.
    2. Bereid als volgt een mastermix voor prelibrary-reactie: voeg 2 μL Pre-Lib Enzyme Mix toe aan 60 μL Pre-Lib Buffer, meng de reactie grondig en centrifugeer kort.
    3. Voeg 60 μL prelibrary-reactiemengsel toe aan elk voorbehandeld mediummonster uit de vorige stap. Meng grondig door te pipetteren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 2-3 s op 200 x g.
    4. Plaats de PCR-buis(jes) uit stap 3.2.3 in het Sample Prep Station en voer het prelibrary-programma als volgt uit: 95 °C gedurende 2 min; 12 cycli van 15 °C gedurende 40 s, 22 °C gedurende 40 s, 33 °C gedurende 30 s, 65 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 40 s, 95 °C gedurende 10 s en 63 °C gedurende 10 s; en houd op 4 °C.
      1. Klik op het pictogram Pre_Lib om het installatiescherm te openen.
      2. Selecteer Tube voor Control-modus ; ingang 70 μL voor monstervolume; selecteer Aan voor Heet deksel en voer 105 °C in voor de temperatuur. Selecteer Nee voor Pauzeren bij de eerste seg. Klik op OK om verder te gaan.
      3. Wacht tot Remain-tijd --:-- :-- aangeeft, wat het einde van het programma aangeeft, en klik op Stop om het programma te beëindigen.
    5. Stop het programma wanneer het proces is voltooid. Ga direct door naar de volgende stap.
  3. Voorbereiding van de bibliotheek
    1. Ontdooi de Library Buffer tot RT. Meng grondig door te pipetteren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 2-3 s op 200 x g.
    2. Bereid als volgt een mastermix voor bibliotheekreactie: voeg 1,6 μL Library Enzyme Mix toe aan 60 μL Library Buffer, meng de reactie grondig en centrifugeer kort.
    3. Voeg 60 μL bibliotheekreactiemix en 2 μL Barcode Primer toe aan elk prelibrary-product uit stap 3.2.3. Meng de reactie grondig en centrifugeer kort.
    4. Plaats de PCR-buis(jes) uit stap 3.2.3 in de thermische cycler en voer het bibliotheekvoorbereidingsprogramma als volgt uit: 94 °C gedurende 30 s; 17 cycli van 94 °C gedurende 25 s, 62 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 45 s); en vervolgens vasthouden bij 4 °C.
      1. Klik op het pictogram Lib_Prep om het installatiescherm te openen.
      2. Selecteer Tube voor Control-modus ; ingang 130 μL voor monstervolume; selecteer Aan voor Hotlid-regeling en voer 105 °C in voor de bijbehorende temperatuur. Selecteer Nee voor Pauzeren bij de eerste seg. Klik op OK om verder te gaan.
      3. Wacht tot Remain-tijd --:-- :-- aangeeft, wat het einde van het programma aangeeft, en klik op Stop om het programma te beëindigen.
  4. Bibliotheek zuivering
    1. Haal Magbeads uit de opslag bij 2-8 °C gedurende ten minste 20 minuten vóór de zuiveringsstap. Draai en meng de Magbeads gedurende 20 s. Doseer voldoende korrels voor de zuiveringsstap in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en verwarm de korrels tot RT.
    2. Voeg 1x Magbeads toe aan elke bibliotheek. Mix door ≥10 keer op en neer te pipetteren en 5 minuten op RT te incuberen.
      OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld 100 μL Magbeads toe aan 100 μL bibliotheekmonster.
    3. Centrifugeer de buis na incubatie kort en plaats deze op een magnetische standaard.
    4. Wacht ongeveer 5 minuten tot de oplossing helder wordt. Terwijl u de buis op de magnetische standaard houdt, zuigt u de oplossing voorzichtig op en gooit u deze weg.
    5. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de tube. Incubeer gedurende 30 s bij RT en verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal dit nog een keer.
    6. Verwijder de ethanol zo volledig mogelijk. Laat de kralen ongeveer 5-10 minuten aan de lucht drogen op de magnetische standaard bij RT.
    7. Verwijder de buis van de magnetische standaard, voeg 17.5 μL elutiebuffer toe en draai de buis om de kralen opnieuw te suspenderen. Centrifugeer de buis kort en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    8. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht tot de oplossing helder wordt. Breng voorzichtig 15 μL supernatans over in een nieuw buisje.
  5. Kwantificering van de bibliotheek
    1. Kwantificeer gezuiverde bibliotheken met behulp van de fluorometer volgens de gebruikershandleiding van de qubit dsDNA HS Assay kits28. De opbrengst van de bibliotheken varieert van ~15 tot 300 ng.
  6. Bundeling van bibliotheken
    1. Gebruik 10 nanogram van elk bibliotheekmonster voor pooling.
  7. Sequencing
    1. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor sequencing (15027617 v01)29.
    2. Gezuiverde bibliotheeksequenties van 50 bp aan een enkel uiteinde op het platform leverden ongeveer 2 miljoen lezingen op voor elk monster, en een sequentiediepte van 0,03 × werd aanbevolen.
  8. Data-analyse
    1. Voer de naam en het wachtwoord van de gebruiker in op de inlogpagina
    2. Nadat u bent ingelogd op het systeem, klikt u op Analyse en er verschijnt een nieuwe pagina. Klik op Inzending maken onder het tabblad NICS-A. Kies vervolgens NGS voor het platform, selecteer corporatie, kies NICSInst voor het reagens, voer de projectinformatie in het vak onder Project-ID in, stel de analysevoorkeuren in en upload de bestanden. Zodra alle sequentiebestanden zijn geüpload, klikt u op Verzenden om de analyse te starten (Afbeelding 3A).
    3. Klik op Inzendingen bekijken om de lijst met ingediende projecten weer te geven. Zodra de analyse is voltooid, wordt de status van een project Voltooid en verschijnt er een knop Weergeven in het rapportveld. Klik op de knop Weergeven om de overzichtstabel van de NICS-analyse te bekijken (Figuur 3B).
    4. Klik op de knop Rapport exporteren om de rapporten op te slaan (Figuur 3C).
      OPMERKING: Voor elke analyse worden drie soorten bestanden geëxporteerd. Een grafisch bestand met alle copy number variation (CNV)-plots voor elk chromosoom en het hele genoom, dat wordt opgeslagen in de map "grafiek"; een spreadsheet met de voorbeeld-QC-details van deze analyserun; een documentbestand dat de door de gebruiker aangepaste NICS-rapporten bevat; en een spreadsheet met de overzichtsgegevens van deze analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie paste de voorgestelde methode toe op een patiënt. IRB-goedkeuring en geïnformeerde toestemming werden verkregen vóór de toepassing van NICS-analyse. De huidige studie verkreeg 6 blastocysten van patiënten en voerde NICS uit op alle 6 embryo's op dag 4 tot dag 5 medium. Chromosoomafwijkingen veroorzaakt door de gebalanceerde translocatie van de ouders werden gedetecteerd in vijf chromosomen met de NICS-test; daarom konden ze niet worden gebruikt voor overdracht (figuur 4A-E<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wijzigingen en probleemoplossing

Als de NICS-resultaten besmet zijn met ouderlijk genetisch materiaal, zorg er dan voor dat alle cumulus-corona radiata-cellen worden verwijderd en zorg ervoor dat ICSI wordt uitgevoerd voor bevruchting. Onjuiste mediumopslag of sjabloonvoorbereidingsprocessen worden vermeden, waardoor DNA kan worden afgebroken. De werkruimte werd grondig gezuiverd met DNase- en RNase-decontaminatiereagentia. Om besmetting door andere embryo's te voorkomen, werd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang en Sijia Lu zijn werknemers van Yikon Genomics Co., Ltd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Shiping Bo en Shujie Ma bedanken voor hun hulp bij de analyse van NGS-gegevens. Financiering: dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program (subsidienr. 2018YFC1003100).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tubeAxygenMCT-150-C, PCR-02-CDNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free TipsAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SThis can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanolSinopharm Chemical10009218This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48Yikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, SterileBD Bioscience363037This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip), SterileBD Bioscience353001This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, SterileBD Bioscience353002This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis BufferYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor culture medium pre-treatment
Cell Lysis EnzymeYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor culture medium pre-treatment
ChromGo softwareYikon GenomicsData analysis
CMPure MagbeadsYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor library purification
Cryotop open systerm KITAZATO BioPharma81110This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill waterYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitTo dissolve DNA
ES (Vitrification kit) KITAZATO BioPharmaReagent inVitrification kitThis can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mLSAGEART4007-AThis can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSIORIGIOMPH-35-35This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® SystemIlluminaSY-410-1001For library sequencing
IncubatorLabotectInkubator C16This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library bufferYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor library amplificaton
Library Enzyme MixYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor library amplificaton
Magnetic StandDynaMagTM-212321DFor library purification
MicroscopeOLYMPUS1X71This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifugeESSENSCIENELF6For separation
MT Enzyme MixYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitFor culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kitYikon GenomicsKT1000800324Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep StationYikon Genomics ME1001003Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well DishThermo Scientific144444This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur PipetteOirgio MXL3-IND-135This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettesORIGIOPP-9-1000This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib BufferYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitPre-library preparation
Pre-Lib EnzymeYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitPre-library preparation
Qubit® 3.0 FluorometerThermo ScientificQ33216For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst MediumSAGEART-1029For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage MediumSAGEART-1026This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization MediumSAGEART-1020This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPESSAGEART-1023This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute KitSAGEART-3010This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oilSAGEART-4008PThis can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPSORIGIOMXL3-IND-135This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systermKIZTAZATO81111This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit KITAZATO BioPharmaVT101This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
VortexerQilinbeierDNYS8Sample mix
VS (Vitrification kit) KITAZATO BioPharmaReagent inVitrification kitThis can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser SystemHamilton ThorneCLASS 1 laserThis can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24(2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075(2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117(2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669(2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Trefwoorden

Niet invasieve chromosoomscreeningwhole genome amplificatielibrary preparatienext generation sequencingembryocultuurmediumaneuplo dedetectie

Gerelateerde artikelen