Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Samenvatting

De blootstelling van levende organismen aan omgevings- en cellulaire stress veroorzaakt vaak verstoringen in eiwithomeostase en kan resulteren in eiwitaggregatie. De accumulatie van eiwitaggregaten in bacteriële cellen kan leiden tot significante veranderingen in het cellulaire fenotypische gedrag, waaronder een vermindering van groeisnelheden, stressbestendigheid en virulentie. Er bestaan verschillende experimentele procedures voor het onderzoek van deze stressor-gemedieerde fenotypen. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde test voor de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële stof. Van deze verbinding is bekend dat het reactieve zuurstofsoorten genereert en wijdverspreide eiwitaggregatie veroorzaakt.

De methode combineert een op centrifugatie gebaseerde scheiding van eiwitaggregaten en oplosbare eiwitten uit behandelde en onbehandelde cellen met daaropvolgende scheiding en visualisatie door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Coomassie-kleuring. Deze aanpak is eenvoudig, snel en maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in verschillende E. coli-stammen. De methodologie heeft een breed scala aan toepassingen, waaronder de mogelijkheid om de impact van andere proteotoxische antimicrobiële stoffen op in vivo eiwitaggregatie in een breed scala aan bacteriën te onderzoeken. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om genen te identificeren die bijdragen aan een verhoogde resistentie tegen proteotoxische stoffen. Gelbanden kunnen worden gebruikt voor de daaropvolgende identificatie van eiwitten die bijzonder gevoelig zijn voor aggregatie.

Inleiding

Bacteriën worden onvermijdelijk blootgesteld aan een groot aantal omgevingsstressen, waaronder een lage pH (bijvoorbeeld in de maag van zoogdieren)^1,2,reactieve zuurstof- en chloorsoorten (ROS / RCS) (bijvoorbeeld tijdens oxidatieve uitbarsting in fagocyten)^3,4,5,verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld in warmwaterbronnen of tijdens hitteschok)^6,7en verschillende krachtige antimicrobiële stoffen (bijv. AGXX gebruikt in dit protocol)⁸. Eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor een van deze stressoren en blootstelling kan leiden tot het ontvouwen van eiwitten die vervolgens zadenaggregatie veroorzaken. Alle organismen maken gebruik van beschermende systemen die hen in staat stellen om te gaan met eiwit misfolding⁹. Ernstige stress kan echter de eiwitkwaliteitscontrolemachines overweldigen en de secundaire en / of tertiaire structuur van eiwitten verstoren, wat uiteindelijk eiwitten inactiveert. Als gevolg hiervan kunnen eiwitaggregaten ernstige afbreuk doen aan kritieke cellulaire functies die nodig zijn voor bacteriële groei en overleving, stressbestendigheid en virulentie¹⁰. Daarom is onderzoek gericht op eiwitaggregatie en de gevolgen ervan in bacteriën een relevant onderwerp vanwege de potentiële impact op de bestrijding van infectieziekten.

Warmte-geïnduceerde eiwit ontvouwen en aggregatie zijn vaak omkeerbaar⁷. Daarentegen kunnen andere proteotoxische spanningen, zoals oxidatieve stress, onomkeerbare eiwitmodificaties veroorzaken door de oxidatie van specifieke aminozuurzijketens, wat resulteert in eiwitont-/misvouwen en uiteindelijk eiwitaggregatie⁴. Stress-geïnduceerde vorming van onoplosbare eiwitaggregaten is uitgebreid bestudeerd in de context van moleculaire chaperonnes en hun beschermende functies in gist en bacteriën^11,12,13. Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd die een verscheidenheid aan biochemische technieken gebruiken voor de isolatie en analyse van onoplosbare eiwitaggregaten^14,15,16,17. De bestaande protocollen zijn voornamelijk gebruikt om bacteriële eiwitaggregatie te bestuderen bij hitteschok en /of identificatie van moleculaire chaperones. Hoewel deze protocollen zeker een vooruitgang in het veld zijn geweest, zijn er enkele grote ongemakken in de experimentele procedures omdat ze (i) een groot bacteriekweekvolume van maximaal 10 L^14,17, (ii) gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen vereisen, waaronder het gebruik van celverstoorders, Franse pers en / of ultrasoonapparaat^14,15,17of (iii) tijdrovende herhaalde herhaalde wassen en incubatie stappen^15,16,17.

Dit artikel beschrijft een aangepast protocol dat gericht is op het aanpakken van de beperkingen van de vorige benaderingen en maakt de analyse mogelijk van de hoeveelheid eiwitaggregaten gevormd in twee verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een proteotoxische antimicrobiële oppervlaktecoating. De coating bestaat uit metaal-zilver (Ag) en ruthenium (Ru) -geconditioneerd met ascorbinezuur, en de antimicrobiële activiteit wordt bereikt door het genereren van reactieve zuurstofsoorten^8,18. Hierin is een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de bacteriecultuur na behandeling met de antimicrobiële verbinding en een vergelijking van de eiwitaggregatiestatus bij blootstelling van twee E. coli-stammen met verschillende gevoeligheidsprofielen aan toenemende concentratie van de antimicrobiële stof. De beschreven methode is goedkoop, snel en reproduceerbaar en kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in aanwezigheid van andere proteotoxische verbindingen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om de impact te analyseren die specifieke gendeleties hebben op eiwitaggregatie in een verscheidenheid aan verschillende bacteriën.

Protocol

1. Stressbehandeling van E. coli stammen MG1655 en CFT073

1. Ent 5 ml lysogeniebouillon (LB) medium met een enkele kolonie commensale E. coli stam MG1655 en uropathogene E. coli (UPEC) stam CFT073, respectievelijk, en incubeer gedurende 14-16 uur ('s nachts) bij 37 °C en 300 tpm.
   OPMERKING: Escherichia coli CFT073 is een menselijke ziekteverwekker. De behandeling van CFT073 moet worden uitgevoerd met passende bioveiligheidsmaatregelen in een bioveiligheidsniveau 2-gecertificeerd laboratorium.
2. Verdun elke stam in een kolf van 500 ml met 70 ml 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS)-glucose (MOPS-g) (tabel 1) medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,1. Incubeer bij 37 °C en 300 tpm tot het midden van de logfase is bereikt (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Breng 20 ml van elke cultuur over in drie voorgewarmde kolven van 125 ml en incubeer bij 37 °C en 300 tpm gedurende 2 minuten.
   OPMERKING: Aangezien tijdige verwerking van de monsters vereist is, moet u niet meer dan 6 culturen tegelijk verwerken.
4. Bereid een antimicrobiële samengestelde oplossing in MOPS-g medium in een concentratie van 2 mg/ml. Voeg de antimicrobiële stof toe aan elke cultuur om de aangegeven concentraties te bereiken. Voeg voor de onbehandelde regeling het vereiste volume MOPS-g medium toe.
   OPMERKING: Vortex de antimicrobiële oplossing van 2 mg/ml om een gelijkmatige verdeling van de samengestelde deeltjes mogelijk te maken en sedimentatie te voorkomen.
5. Incubeer de culturen gedurende 45 minuten bij 37 °C en 300 tpm.

Figuur 1: Escherichia coli stressbehandeling. Bacterieculturen worden gekweekt in MOPS-g en behandeld met de aangegeven concentraties van de zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële wanneer de mid-log fase wordt bereikt. Afkortingen: LB = lysogeny bouillon; Ag-Ru = zilver-ruthenium; MOPS-g = 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS)-glucose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Verzamelen van bacteriële celmonsters

1. Bepaal na 45 minuten stressbehandeling de OD₆₀₀ van elke cultuur. Oogst voor elk monster cellen gelijk aan 4 ml OD₆₀₀ = 1 op de 15 ml centrifugebuizen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 3.000 × g en 4 °C.
2. Verwijder het supernatant volledig en resuspend de celkorrels in 50 μL ijskoude lysisbuffer(tabel 1). Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs.
   OPMERKING: Deze lysisstap degradeert de peptidoglycanlaag. Gebruik altijd vers bereide lysisbuffer.
3. Breng de monsters over in microcentrifugebuizen van 1,7 ml. Invriezen bij -80 °C tot verder gebruik.

Figuur 2: Verzameling van bacteriële monsters. Celmonsters worden geoogst door centrifugering en geresuspendeerd in lysisbuffer gevolgd door opslag bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Extractie van de onoplosbare eiwitaggregaten

1. Ontdooi monsters op ijs.
   OPMERKING: De vries-dooicyclus draagt bij aan de cellysis.
2. Voeg 360 μL ijskoude buffer A(tabel 1)toe en meng voorzichtig door te pipetteren.
   OPMERKING: De osmotische shock zal ook bijdragen aan cellysis.
3. Breng het monster over in een microcentrifugebuis van 2 ml met ~200 μL glasparels van 0,5 mm. Incubeer gedurende 30 min bij 8 °C in een thermomixer met schudden bij 1.400 tpm.
   OPMERKING: Deze stap resulteert in de fysieke verstoring van de cel. Een proteaseremmer kan worden gebruikt om eiwitafbraak te minimaliseren. De storing kan worden uitgevoerd bij 4 °C. Merk op dat het gebruik van glaskralen is gemeld om aggregatie van een kleine subset van eiwitten in gist te induceren¹⁹.
4. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs zonder te schudden om de glaskralen te laten bezinken. Breng 200 μL van het cellysaat over in microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
   OPMERKING: Vermijd de overdracht van de glaskralen.
5. Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatant, dat oplosbare eiwitten bevat, en ga verder met sectie 4.
6. Resuspend de pellet in 200 μL ijskoude buffer A (tabel 1) met behulp van de pipet. Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig helemaal.
7. Voeg 200 μL ijskoude buffer B (zie tabel 1 en de tabel met materialen) toe en pipetteer de pellet voorzichtig opnieuw door pipetteren.
   OPMERKING: Het niet-ionische wasmiddel solubilizeert membraaneiwit.
8. Herhaal de centrifugatie bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig.
9. Resuspend de pellet in 200 μL koudebuffer A (tabel 1) door pipetteren. Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant volledig.
10. Resuspend de pellet in 100 μL van 1x reducerende SDS-monsterbuffer(tabel 1)en kook gedurende 5 minuten bij 95 °C in een thermomixer.
11. Bewaar het monster bij -20 °C om later verder te gaan of laad het onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding.

Figuur 3: Extractie van onoplosbare eiwitaggregaten. De extractie van eiwitaggregaten omvat een reeks stappen, waaronder celverstoring, de scheiding van eiwitaggregaten van oplosbare eiwitten, de oplosbaarheid van membraaneiwitten en wassen. Afkorting: SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Bereiding van oplosbare eiwitmonsters

1. Meng 1 volume 100% trichloorazijnzuur (TCA) met 4 volumes oplosbaar eiwitmonster uit stap 3.6.
   OPMERKING: Het hanteren van TCA vereist een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen en een goedgekeurde afvalverwijderingsprocedure.
2. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C om eiwitneerslag mogelijk te maken.
   OPMERKING: Wit neerslag zal zeer binnenkort verschijnen.
3. Centrifugeer om neer te slaan bij 21.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Was de pellet met 200 μL ijskoude aceton om celresten te verwijderen. Centrifugeer bij 21.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal deze acties in stap 4.3 in totaal drie keer.
4. Plaats de microcentrifugebuizen met open deksels in een thermomixer bij 37 °C om de resterende aceton uit de pellet te verwijderen.
   OPMERKING: Incubatie van meer dan 5 minuten kan de oplosbaarheid van de eiwitkorrel verminderen.
5. Voeg 100 μL 1x reducerende SDS-buffer(tabel 1)toe en los de pellet volledig op. Kook het monster gedurende 5 minuten bij 95 °C.
6. Bewaar het monster bij -20 °C om later verder te gaan of laad het onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding.

Figuur 4: Bereiding van oplosbare eiwitten. De bereiding van oplosbaar eiwit omvat een precipitatiestap met trichloorazijnzuur en herhaald wassen met ijskoude aceton. Afkortingen: TCA = trichloorazijnzuur; SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Scheiding en visualisatie van geëxtraheerde eiwitaggregaten met behulp van SDS-PAGE

1. Bereid een 12% SDS-polyacrylamide gel.
   1. Pipetteer voor twee scheidingsgels 5,1 ml dubbel gedestilleerd water (ddH₂O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20% (w/v) SDS, 6 ml 30% acrylamide/bisacrylamide (29:1) oplossing, 75 ml 10% w/v ammoniumperssulfaat en 10 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED) in een centrifugebuis van 15 ml en meng voorzichtig zonder luchtbellen in te brengen. Giet de gel met een pipet van 1 ml in de glasplaten, waarbij de bovenste 2 cm vrij blijft van het mengsel. Voeg 70% ethanol toe aan de bovenkant van de scheidingsgel en zorg voor een gelijkmatige interface tussen de twee lagen.
   2. Na polymerisatie van de scheidende gel, bereidt u de stapelgel door 1,535 ml ddH₂O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml van 20% (w / v) SDS, 335 ml van 30% acrylamide / bisacrylamide (29:1) oplossing, 12,5 ml van 10% w / v ammoniumpersulfaat en 2,5 ml TEMED te pipetteren. Verwijder de ethanol uit de scheidingsgels en voeg de stapelgeloplossing toe. Plaats een kam met het gewenste aantal zakken zonder luchtbellen te introduceren. Laat polymerisatie 20-30 min.
2. Laad 4 μL van elk monster en eiwitladder in afzonderlijke putten en laat de gel(en) in Tris-Glycine-loopbuffer(tabel 1)gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op 144 V lopen.
   OPMERKING: Stop de gel wanneer de broomfenolband op het punt staat uit de gel te migreren.
3. Kleur de gel(en) in een voorverwarmde Fairbanks-oplossing A (tabel 1) gedurende 30 minuten op een wip.
4. Ontkleur de gel(en) in een voorverwarmde Fairbanks-oplossing D (tabel 1) tot de gewenste achtergrond (bijv. 's nachts) op een wip.

Figuur 5: Eiwitscheiding en visualisatie. De monsters worden gescheiden door SDS-PAGE en gevisualiseerd door Coomassie kleuring. Afkorting: SDS-PAGE = natrium dodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Figuur 6: Representatieve resultaten van antimicrobieel geïnduceerde eiwitaggregatie in commensale Escherichia coli stam MG1655 en UPEC stam CFT073. E. coli stammen MG1655 en CFT073 werden gekweekt bij 37 °C en 300 rpm tot OD₆₀₀= 0,5-0,55 in MOPS-g media voordat ze werden behandeld met de aangegeven concentraties (-, 0 mg/ml; +, 1...

Discussie

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methodologie voor de analyse van eiwitaggregatievorming na behandeling van verschillende E. coli-stammen met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het protocol maakt de gelijktijdige extractie van onoplosbare en oplosbare eiwitfracties uit behandelde en onbehandelde E. coli-cellen mogelijk. In vergelijking met bestaande protocollen voor eiwitaggregatie-isolatie uit cellen^14,15,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359