Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol waarin afzonderlijke cellen worden gecontroleerd op acute gebeurtenissen en productieve HIV-1-infectie op een nanofluïdisch apparaat. Beeldvormingsgegevens definiëren virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek. Dit is de eerste methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer om signaalkinetiek en moleculaire interacties te bestuderen.

Samenvatting

HIV-1 veroorzaakt een chronische infectie die wereldwijd meer dan 37 miljoen mensen treft. Mensen met humaan immunodeficiëntievirus (HIV) ervaren comorbiditeit gerelateerd aan chronische ontsteking ondanks antiretrovirale therapie. Deze ontstekingssignalering is echter niet volledig gekarakteriseerd. De rol van vroege ingangsgebeurtenissen bij de activering van cellulaire signaleringsgebeurtenissen en downstream genexpressie is niet vastgelegd op het niveau van één cel. Hier beschrijven de auteurs een methode die principes van live-cell fluorescentiemicroscopie toepast op een geautomatiseerd eencellig platform dat cellen kweekt en afbeelden gedurende door de gebruiker aangepaste tijdcursussen, waardoor een analyse met hoge doorvoer van dynamische cellulaire processen mogelijk is. Deze test kan eencellige levende fluorescentiemicroscopie volgen van vroege gebeurtenissen die onmiddellijk volgen op hiv-1-infectie, met name de instroom van calcium die gepaard gaat met blootstelling aan het virus en de ontwikkeling van productieve infectie met behulp van een fluorescerend reportervirus. MT-4 cellen worden geladen met een calciumgevoelige kleurstof en gekweekt in geïsoleerde pennen op een nanofluïdisch apparaat. De gekweekte cellen zijn geïnfecteerd met een HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Een fluorescentiemicroscoop boven het nanofluïdische apparaat meet de calciuminstroom gedurende een tijdsverloop van 8 minuten na acute hiv-1-blootstelling. Hiv-1 productieve infectie wordt gemeten in diezelfde cellen over een interval van 4 dagen. Beeldvormingsgegevens uit deze tijdscursussen worden geanalyseerd om virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek te definiëren. De auteurs presenteren een geïntegreerd, schaalbaar alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van een nieuw optofluidic-platform dat in staat is om eencellige sortering, cultivering, imaging en softwareautomatisering te gebruiken. Deze test kan de kinetiek van gebeurtenissen onder verschillende omstandigheden meten, waaronder celtype, agonist of antagonisteffect, terwijl een reeks parameters wordt gemeten. Dit is de eerste gevestigde methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer: deze techniek kan breed worden aangepast om cellulaire signaalkinetiek en dynamische moleculaire interacties te bestuderen.

Inleiding

Chronische ontsteking is een belangrijke oorzaak van hiv-geassocieerde vroege morbiditeiten en^{mortaliteit 1,2,3}. Er zijn meerdere mechanismen waarbij HIV inflammatoire signalering kan activeren, en recent bewijs suggereert een rol voor de P2X-receptoren in hiv-binnenkomst die calcium-gating adenosinetrifosfaat (ATP) receptoren^{3,4,5,6,7,8,9,<....}

Protocol

1. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming

1. Bereid verse Fluo-4 AM-laadoplossing: Voeg 25 μL 100x geconcentreerd reinigingsmiddel toe en voeg vervolgens 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x toe aan een buis van 1,5 ml. Vortex om te mengen.
2. Pipet 2,5 ml kweekmedia in de laadoplossing en keer om om te mengen. Beschermen tegen licht.
3. Centrifugeer 2 x 10⁶ MT-4 cellen bij 500 x g gedurende 3 min.
4. Verwijder media en resuspend de pellet in 2 ml van de voorbereide Fluo-4 AM laadoplossing. Beschermen tegen licht.
5. Pipet resuspended cellen in een 35 mm Petrischaal. Incubeer bij 37 °C gedurende 15-30 minuten en incubeer ve....

Resultaten

Figuur 1 illustreert het formaat van de chip en ruwe beeldvormingsgegevens die via de fluorescentiemicroscoop zijn verkregen. De identificatie en clustering van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen via mCherry-meting zijn weergegeven in figuur 2. Deze clusters worden geanalyseerd op calciuminfluxkinetiek in figuur 3, die vroege calciuminstroom in hiv-geïnfecteerde cellen aantoont. Figuur 4 toont e.......

Discussie

De beschreven methodologie om de relatie tussen calciuminstroom en HIV-1 productieve infectie in enkele cellen te bestuderen, kan worden aangepast om intracellulaire calciumkinetiek te bestuderen als reactie op andere agonisten of antagonisten van belang. De voorbereiding van cellen voor beeldvorming is eenvoudig, minimaal tijdsintensief en reagentia zijn verkrijgbaar in handige kits van veelgebruikte fabrikanten. Fluo-4-gebaseerde calciummeting is goed beschreven in de literatuur en HIV-1 kan gemakkelijk worden vervange.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Beacon Optofluidic System	Berkeley Lights
Fetal Bovine Serum	Gibco
FIJI	Open-source software	PMID: 22743772, 22930834
Fluo-4 Calcium Imaging Kit	Thermo Fisher	F10489
HIV-1 NLCINL4-3	Laboratory of Benjamin Chen	PMID: 28148796
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010
MT-4 cells	NIH AIDS Reagent		ARP-120
OptoSelect 3500 chip	Berkeley Lights
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS
Prism 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E
Tissue Culture Hood	Various models
T75 flasks	Corning	3073