Methodenartikel

Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62632

⸱

18 mei 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol waarin afzonderlijke cellen worden gecontroleerd op acute gebeurtenissen en productieve HIV-1-infectie op een nanofluïdisch apparaat. Beeldvormingsgegevens definiëren virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek. Dit is de eerste methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer om signaalkinetiek en moleculaire interacties te bestuderen.

Samenvatting

HIV-1 veroorzaakt een chronische infectie die wereldwijd meer dan 37 miljoen mensen treft. Mensen met humaan immunodeficiëntievirus (HIV) ervaren comorbiditeit gerelateerd aan chronische ontsteking ondanks antiretrovirale therapie. Deze ontstekingssignalering is echter niet volledig gekarakteriseerd. De rol van vroege ingangsgebeurtenissen bij de activering van cellulaire signaleringsgebeurtenissen en downstream genexpressie is niet vastgelegd op het niveau van één cel. Hier beschrijven de auteurs een methode die principes van live-cell fluorescentiemicroscopie toepast op een geautomatiseerd eencellig platform dat cellen kweekt en afbeelden gedurende door de gebruiker aangepaste tijdcursussen, waardoor een analyse met hoge doorvoer van dynamische cellulaire processen mogelijk is. Deze test kan eencellige levende fluorescentiemicroscopie volgen van vroege gebeurtenissen die onmiddellijk volgen op hiv-1-infectie, met name de instroom van calcium die gepaard gaat met blootstelling aan het virus en de ontwikkeling van productieve infectie met behulp van een fluorescerend reportervirus. MT-4 cellen worden geladen met een calciumgevoelige kleurstof en gekweekt in geïsoleerde pennen op een nanofluïdisch apparaat. De gekweekte cellen zijn geïnfecteerd met een HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Een fluorescentiemicroscoop boven het nanofluïdische apparaat meet de calciuminstroom gedurende een tijdsverloop van 8 minuten na acute hiv-1-blootstelling. Hiv-1 productieve infectie wordt gemeten in diezelfde cellen over een interval van 4 dagen. Beeldvormingsgegevens uit deze tijdscursussen worden geanalyseerd om virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek te definiëren. De auteurs presenteren een geïntegreerd, schaalbaar alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van een nieuw optofluidic-platform dat in staat is om eencellige sortering, cultivering, imaging en softwareautomatisering te gebruiken. Deze test kan de kinetiek van gebeurtenissen onder verschillende omstandigheden meten, waaronder celtype, agonist of antagonisteffect, terwijl een reeks parameters wordt gemeten. Dit is de eerste gevestigde methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer: deze techniek kan breed worden aangepast om cellulaire signaalkinetiek en dynamische moleculaire interacties te bestuderen.

Inleiding

Chronische ontsteking is een belangrijke oorzaak van hiv-geassocieerde vroege morbiditeiten enmortaliteit 1,2,3. Er zijn meerdere mechanismen waarbij HIV inflammatoire signalering kan activeren, en recent bewijs suggereert een rol voor de P2X-receptoren in hiv-binnenkomst die calcium-gating adenosinetrifosfaat (ATP) receptoren3,4,5,6,7,8,9,10zijn . Het P2X-subtype van purinergische receptoren (P2XR) kan belangrijke facilitators van deze ontsteking zijn. De moleculaire mechanismen van HIV-P2XR interacties zijn echter grotendeels onbekend en kunnen van invloed zijn op vroege en late HIV-1 virale levenscyclusstappen. Het definiëren van de trajecten en kinetiek die hiv-geassocieerde chronische ontstekingen veroorzaken, is van cruciaal belang voor het bevorderen van behandelingsopties voor mensen met hiv.

Om te beoordelen of HIV-1 P2X-receptoren direct pijnigt, moeten P2XR-activering en HIV-1-infectie parallel worden gemeten. Assays van P2XR-activiteit en HIV-1-infectie zijn onafhankelijk vastgesteld: Cellulaire calciuminstroom is een indicator voor P2XR-activering en HIV-1 productieve infectie kan worden gekwantificeerd door RNA-overvloed. Fluorescentiedetectie van calciuminstroom is mogelijk met de Fluo-4 calciumgevoelige kleurstof, en HIV-1-infectie kan worden gevisualiseerd met het mCherry fluorescent reporter virus HIV-NLCI11,12,13,14,15.

Omdat deze indicatoren van P2X-activering (acute cellulaire calciuminstroom) en HIV-1-infectie (HIV-1 RNA-synthese) op verschillende tijdschalen (minuten versus dagen) voorkomen, ontbreekt er een methode met hoge doorvoer die een gepaarde analyse van P2XR-activering en HIV-1-infectie mogelijk maakt. Standaard experimentele technieken met hoge doorvoer, zoals flowcytometrie, maken de populatieanalyse mogelijk, maar kunnen de relatie tussen acute en longitudinale gebeurtenissen in afzonderlijke cellen niet beoordelen. Als alternatief is eencellige beeldvorming met standaard fluorescentiemicroscopie een lage doorvoer. Deze experimentele beperkingen bieden de behoefte aan nieuwe technieken met hoge doorvoer om associaties tussen acute en longitudinale cellulaire gebeurtenissen rechtstreeks te meten.

Een beschreven optofluidic-systeem is een nieuw platform dat in staat is tot eencellige sortering en isolatie, cultivering, beeldvorming en softwareautomatisering16,17,18,19. Dit systeem biedt een geïntegreerd alternatief met hoge doorvoer voor de beperkingen van traditionele beeldvormingsmethoden. Het Beacon-platform bestaat uit een koolstofdioxide (CO2)en temperatuurgecontroleerde incubator die cellen op een chip ondersteunt. De chip beschikt over lichtgevoelige transistors die een elektrische gradiënt genereren als reactie op gericht licht. Deze resulterende dielectroforetische kracht wordt gebruikt om individuele cellen over de nanofluïdische chip naar de gewenste gebieden te verplaatsen. Cellen worden gesorteerd in pennen op de chip, die een barrière vormen om individuele cellen fysiek te isoleren. Continue laminaire stroom van groeimedia door de chip voorkomt celmigratie uit de pennen en zorgt tegelijkertijd voor de verspreiding van kleine deeltjes van voedingsstoffen en experimentspecifieke reagentia. Een fluorescentiemicroscoop zit boven de chip. Softwareautomatisering wordt gebruikt om afbeeldingen van de chip vast te leggen op het door de gebruiker opgegeven tijdstip.

Alle celkarakterisering werd uitgevoerd met behulp van een optofluidic systeem voor eencellige selectie en manipulatie. Dit systeem bestaat uit geïntegreerde mechanische, microfluïdische en optische componenten die manipulatie, assay, cultuur en beeldvorming met één cel mogelijk maken. Cellen worden geladen en gekweekt op het wegwerp nanofluïdische apparaat bestaande uit 3.500 individuele kamers (pennen), elk in staat om subnanolitervolume vast te houden. Cellen kunnen in hokken worden geplaatst met behulp van lichtgeïnduceerde dielectroforetische "kooien" en gekweekt onder temperatuur- en CO2-gecontroleerdeomstandigheden. De microfluïdica maken perfusie van media of buffers op de chip mogelijk voor celkweek of medicamenteuze behandeling. Een bediende naald maakt de import en export van cellen uit geïncubeerde en geblindeerde putplaten mogelijk. Het chipgebied kan worden afgebeeld op 4x of 10x vergroting in brightfield- en fluorescerende kanalen (inclusief DAPI, FITC, TRed of Cy5) om cellulaire fenotypen of functionele analyse te karakteriseren. Het hele systeem is geautomatiseerd met behulp van software die kan worden gebruikt voor vooraf ontworpen workflows of aangepaste experimenten.

Relaties tussen HIV-1-infectie en P2XR zijn bestudeerd, maar een procedure met hoge doorvoer om deze interacties direct parallel te karakteriseren, is niet gemeld. Hier beschrijven de auteurs een methodologie om HIV-P2XR-interacties te bestuderen door acute calciuminstroom en daaropvolgende HIV-1 productieve infectie op ééncellig niveau te volgen. Dit creëert met name een nieuw hulpmiddel dat directe, hoge doorvoer, longitudinale meting van meerdere doelen in afzonderlijke cellen mogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming

  1. Bereid verse Fluo-4 AM-laadoplossing: Voeg 25 μL 100x geconcentreerd reinigingsmiddel toe en voeg vervolgens 2,5 μL Fluo-4 AM 1000x toe aan een buis van 1,5 ml. Vortex om te mengen.
  2. Pipet 2,5 ml kweekmedia in de laadoplossing en keer om om te mengen. Beschermen tegen licht.
  3. Centrifugeer 2 x 106 MT-4 cellen bij 500 x g gedurende 3 min.
  4. Verwijder media en resuspend de pellet in 2 ml van de voorbereide Fluo-4 AM laadoplossing. Beschermen tegen licht.
  5. Pipet resuspended cellen in een 35 mm Petrischaal. Incubeer bij 37 °C gedurende 15-30 minuten en incubeer vervolgens nog eens 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis. Centrifugeer cellen op 500 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant bestaande uit de laadoplossing.
  7. Resuspendeer de celkorrel door 1 ml van het kweekmedium in te pipetten en centrifugeer gedurende 3 minuten op 500 x g om te wassen.
  8. Resuspendeer de celkorrel door het kweekmedium in te pipetten bij een concentratie van 2 x 106 cellen/ml (minimaal 50 μL). Beschermen tegen licht.

2. Optofluidic systeemvoorbereiding, cellading, en cel penning

  1. Bereid een chip voor met de bevochtigingsoplossing, die het schrijven van cellen vergemakkelijkt.
    1. Om dit te doen, laadt u centrifugebuizen met 2 ml bevochtigingsoplossing en 50 ml DI-water op het instrument met een nieuwe optofluidische chip en voert u de Wet Chip-functie uit. Deze functie overspoelt de chip automatisch met de bevochtigingsoplossing door de systeemfluïdica, incubeert de chip op 50, °C en spoelt de chip 3 keer met water.
    2. Zodra het spoelen van water is voltooid, spoelt u de chip door met 3 cycli van 250 μL kweekmedia.
  2. Vul de celsuspensie vanaf stap 1.8 aan met 1:100 F-127 wasmiddeloplossing vóór het laden om de kans te verkleinen dat cellen aan de spaankanalen blijven plakken.
  3. Gebruik de instrumentexportnaald om cellen uit een centrifugebuis van 1,5 ml te importeren met behulp van de belastingsbewerking en small volume import voor een volume van 5 μL celverpakkingen.
  4. Pencellen met een geoptimaliseerde OEP-spanning (Optoelectronic Positioning) van 4,3 V en een kooisnelheid van 5 μm/s. Penning vindt plaats met behulp van OEP. Bereik penning met behulp van de Autopen-functie, die afzonderlijke cellen automatisch detecteert, ze omringt met een OEP-kooi en ze naar een nabijgelegen pen verplaatst. Als cellen van belang blijven na automatisch schrijven, gebruikt u de functie Handmatige pen om doelcellen (met een muisklik) en een doelpen (met een volgende muisklik) te selecteren.
  5. Zodra het pennen is voltooid (wanneer de Autopen-functie is voltooid of wanneer het gewenste aantal penned cellen is bereikt), spoelt u de chip met 3 cycli van 250 μL kweekmedia om de resterende niet-gepelde cel uit de chip te wissen.

3. Eencellige infectie en functionele beeldvorming

  1. Na het schrijven van cellen, verkrijg fluorescerende beelden van cellen in FITC, Texas Red en DAPI kanalen om de baseline Fluo-4, mCherry en autofluorescentie te meten.
  2. Giet HIV-1 in de microchip bij een concentratie van 13 ng HIV-1 NL-CI per 2 x 106 cellen door de suspensie langzaam via de exportsaald in de chip te gieten.
  3. Onmiddellijk na hiv-1 toevoeging, herhaaldelijk verkrijgen van beelden in de FITC en DAPI kanalen over een 10-min tijd cursus.
  4. Verkrijg afbeeldingen in de Texas Red- en DAPI-kanalen op 1-, 2-, 3- en 4-dagen na infectie (DPI).

4. Analyse van eencellige functionele beeldvormingsgegevens met FIJI-software

  1. Gebruik op elk moment in elk beeldvormingskanaal van belang het fiji-puntselectiegereedschap en de functie Meten om de Fluo-4-, mCherry- en autofluorescentiesignalen van elke cel te meten. Meet tegelijkertijd de achtergrondfluorescentie door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de pen en chip die elke cel bevatten te berekenen.
  2. Besturingselement voor de achtergrondfluorescentie en autofluorescentie met behulp van de functie Meten om de MFI in een regioselectie te vinden en deze waarde af te trekken van de celfluorescentiewaarde.
  3. Normaliseer de achtergrondfluorescentie van elk chipbeeld: Meet de MFI van de chip in elk veld. Trek vervolgens de MFI van de chip met de minste achtergrondfluorescentie af van alle andere chip MFI-metingen.
  4. Normaliseer de achtergrondfluorescentie van elke celbevattende pen: meet de MFI van de pen van elke cel in elk gezichtsveld. Trek deze waarde vervolgens af van de onbewerkte MFI van de cel voor elk veld.
  5. Regeling voor de celautofluorescentie: Trek de dag 0 en dag 4 DAPI MFI van elke cel af van de dag 0 en dag 4 mCherry MFI's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 illustreert het formaat van de chip en ruwe beeldvormingsgegevens die via de fluorescentiemicroscoop zijn verkregen. De identificatie en clustering van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen via mCherry-meting zijn weergegeven in figuur 2. Deze clusters worden geanalyseerd op calciuminfluxkinetiek in figuur 3, die vroege calciuminstroom in hiv-geïnfecteerde cellen aantoont. Figuur 4 toont e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methodologie om de relatie tussen calciuminstroom en HIV-1 productieve infectie in enkele cellen te bestuderen, kan worden aangepast om intracellulaire calciumkinetiek te bestuderen als reactie op andere agonisten of antagonisten van belang. De voorbereiding van cellen voor beeldvorming is eenvoudig, minimaal tijdsintensief en reagentia zijn verkrijgbaar in handige kits van veelgebruikte fabrikanten. Fluo-4-gebaseerde calciummeting is goed beschreven in de literatuur en HIV-1 kan gemakkelijk worden vervange...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

R.P.S. is een medewerker van Sema4. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor de wetenschappelijke gesprekken met Dr. Benjamin Chen. Dit werk werd gefinancierd door K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS en KB) en R21AI152833 (THS en KB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Beacon Optofluidic SystemBerkeley Lights
 Fetal Bovine SerumGibco
 FIJIOpen-source softwarePMID: 22743772, 22930834
 Fluo-4 Calcium Imaging KitThermo Fisher F10489
 HIV-1 NLCINL4-3Laboratory of Benjamin ChenPMID: 28148796
 Hyclone Pennecillin Streptomycin solutionGE Healthcare Life sciences SV30010
 MT-4 cellsNIH AIDS Reagent ARP-120
 OptoSelect 3500 chipBerkeley Lights
 Pipettor TipsDenville Scientific P3020-CPS
 Prism 9.0.0GraphPad
 RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich R8758
Serological PipettesFisher Brand 13-678-11E
Tissue Culture HoodVarious models
T75 flasksCorning3073

Referenties

  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010(2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41(2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692(2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van enkelcellenlive cell imagingfluorescentiemicroscopienanofluidisch apparaatMT 4 cellenreporterviruscellulaire signalering

Gerelateerde artikelen