Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naast de typische analyse van RNA-Seq om differentiële genexpressie (DGE) te meten over experimentele / biologische omstandigheden, kunnen RNA-seq-gegevens ook worden gebruikt om andere complexe regulerende mechanismen op exon-niveau te verkennen. Alternatieve splicing en polyadenylation spelen een cruciale rol in de functionele diversiteit van een gen door verschillende isovormen te genereren om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren, en het beperken van analyses tot het hele genniveau kan deze belangrijke regulerende laag missen. Hier demonstreren we gedetailleerde stapsgewijze analyses voor identificatie en visualisatie van differentiële exon- en polyadenylation-sitegebruik onder omstandigheden, met behulp van Bioconductor en andere pakketten en functies, waaronder DEXSeq, diffSplice uit het Limma-pakket en rMATS.
Inleiding
RNA-seq is in de loop der jaren op grote schaal gebruikt, meestal voor het schatten van differentiële genexpressie en genontdekking1. Bovendien kan het ook worden gebruikt om het gebruik op exonniveau te schatten als gevolg van gen dat verschillende isovormen tot expressie brengt, waardoor het bijdraagt aan een beter begrip van genregulatie op post-transcriptioneel niveau. De meerderheid van de eukaryote genen genereren verschillende isovormen door alternatieve splicing (AS) om de diversiteit van mRNA-expressie te vergroten. AS-gebeurtenissen kunnen worden onderverdeeld in verschillende patronen: het overslaan van complete exonen (SE) waarbij e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Installatie van tools en R-pakketten die bij de analyse worden gebruikt
- Conda is een populaire en flexibele pakketbeheerder die een gemakkelijke installatie van pakketten met hun afhankelijkheden op alle platforms mogelijk maakt. Gebruik 'Anaconda' (conda package manager) om 'conda' te installeren, wat kan worden gebruikt om de tools/pakketten te installeren die nodig zijn voor de analyse.
- Download 'Anaconda' volgens de systeemvereisten van https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads en installeer het door de aanwijzingen in het grafische installatieprogramma te volgen. Installeer alle vereiste pakketten met beh....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na het uitvoeren van de bovenstaande stapsgewijze workflow, worden de AS- en APA-analyse-uitvoer en representatieve resultaten in de vorm van tabellen en gegevensplots weergegeven, die als volgt worden gegenereerd.
ALS:
De belangrijkste output van de AS-analyse (aanvullende tabel 1 voor diffSplice; Tabel 2 voor DEXSeq) is een lijst van exonen die differentieel gebruik tussen omstandigheden laten zien, en een lijst van genen die significante.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie evalueerden we exon-gebaseerde en event-gebaseerde benaderingen om AS en APA te detecteren in bulk RNA-Seq en 3'-end sequencinggegevens. De exon-gebaseerde AS-benaderingen produceren zowel een lijst van differentieel tot expressie gebrachte exonen als een rangschikking op genniveau, geordend op basis van de statistische significantie van de totale differentiële splicingactiviteit op genniveau (tabellen 1-2, 4-5). Voor het diffSplice-pakket wordt het differentiële gebruik bepaald door gewog.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT16010043) en ANU Futures Scheme.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Niet relevant voor computationeel onderzoek |
Referenties
- Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation. Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).
- Wang, Y., et al. Mechanism of alternative splicing and its regulation. Biome....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
