Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62642

⸱

4 mei 2021

 , 
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

In dit artikel

Samenvatting

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

Samenvatting

In vivo celcyclusprogressieanalyse wordt routinematig uitgevoerd in studies naar genen die mitose en DNA-replicatie reguleren. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is gebruikt om replicatieve / S-fase progressie te onderzoeken, terwijl antilichamen tegen fosfo-histon H3 zijn gebruikt om mitotische kernen en cellen te markeren. Een combinatie van beide labels zou de classificatie van G0/G1 (Gap-fase), S (replicatief) en M (mitotisch) mogelijk maken en dienen als een belangrijk hulpmiddel om de effecten van mitotische gen-knockdowns of nulmutanten op de progressie van de celcyclus te evalueren. De reagentia die worden gebruikt om EdU-gelabelde cellen te markeren, zijn echter niet compatibel met verschillende secundaire antilichaam-fluorescerende tags. Dit bemoeilijkt immunostaining, waarbij primaire en gelabelde secundaire antilichamen worden gebruikt om pH3-positieve mitotische cellen te markeren. Dit artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de dual-labeling van EdU en pH3 in Drosophila larvale neurale stamcellen, een systeem dat uitgebreid wordt gebruikt om mitotische factoren te bestuderen. Daarnaast is er een protocol voor beeldanalyse en kwantificering om gelabelde cellen toe te wijzen in 3 verschillende categorieën, G0/ G1, S, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fasen.

Inleiding

De celdelingscyclus bestaat uit een G1-fase (eerste gapfase), een replicatieve/S-fase, een G2-fase (tweede gapfase) en een M-fase (mitotische fase). Door deze fasen ondergaat de cel dramatische veranderingen in cellulaire transcriptie, vertaling en reorganisatie van cytoskeletmachines1,2. Als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen kunnen cellen tijdelijk ophouden te delen en rustig (G0) of differentiëren worden en permanent ophouden te delen3. Andere scenario's, zoals DNA-schade, kunnen voortijdige differentiatie of apoptoseveroorzaken 3,4. Reactie op dergelijke signalen wordt gemedieerd door controlepunten voor de celcyclus, die fungeren als een bewakingssysteem om de integriteit van essentiële cellulaire processen te waarborgen voordat de cel zich verbindt aan de volgende fase van de delingcyclus5. Daarom moeten studies naar genen die DNA-replicatie, checkpoints en mitotische machines reguleren, mogelijke celcyclusprogressiedefecten analyseren die kunnen optreden in mutante cellen of bij siRNA-knockdown van deze genen. Bovendien kunnen dergelijke analyses worden gebruikt om de algehele celgezondheid en cellulaire reacties op medicamenteuze behandeling te testen.

5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) is een thymidine-analoog dat tijdens replicatie in het DNA wordt opgenomen6. Deze methode werd uitgebreid gebruikt om cellen in de S-fase te identificeren. De cellen worden vervolgens echter onderworpen aan strenge DNA-denaturatieprocedures om detectie van BrdU mogelijk te maken door het gebruik van anti-BrdU-antilichamen6. Deze harde behandeling kan cellulaire epitopen beschadigen en verdere karakterisering van het monster door immunostaining voorkomen. EdU-opname en daaropvolgende detectie door een kopergekatalyseerde,'klikreactie' met kleine, celdoorlatende, fluorescerend gelabelde azidekleurstoffen elimineert de noodzaak van agressieve denaturatieprocedures7. Deze methode kwam daarom naar voren als een praktischer alternatief voor BrdU-integratie.

Verder is pH3 beschreven als een betrouwbare marker voor mitotische / M-fasecellen8. Histon H3 is een DNA-geassocieerd kernhitoneiwit dat rond de late G2-fase tot vroege M-fase wordt gefosforyleerd en tegen het einde van anafase8wordt gedefosforyleerd. Verschillende commerciële antilichamen kunnen worden gebruikt om pH3 te detecteren met behulp van standaard immunostainingprotocollen. Dubbele kleuring van EdU en pH3 zou daarom de detectie van cellen in zowel S-fase als M-fase mogelijk maken. Bovendien zouden cellen in de G1- en vroege G2-fase voor geen van de markers positief kleuren.

Drosophila neurale stamcellen of neuroblasten (NBs) bieden een goed gekarakteriseerd stamcelmodel waarbij cellen zich asymmetrisch delen om één identieke zelfvernieuwende NB en een ganglionmoedercel (GMC) te produceren, die is vetgemest voor differentiatie9. Daarnaast maken verschillende genetische hulpmiddelen en NB-specifieke antilichamen dit systeem geschikt voor genetische manipulatie en live-cell imaging. Bijgevolg hebben verschillende studies NBs gebruikt om genen te bestuderen die asymmetrische delingen en bepaling van het lot van cellen reguleren9. Verschillende populaties van NB's bestaan in de centrale hersenen (CB) en de optische kwab (OL) van de larvale hersenen9; Cb-nbb's werden gebruikt voor de huidige studie. Deze derde instar larvale CB NBs zijn grote cellen die ook geschikt zijn voor het bestuderen van factoren die de mitotische spindelassemblage reguleren. Een protocol om progressiedefecten van de celcyclus te analyseren zou een essentieel hulpmiddel zijn in dergelijke studies.

Protocollen die eerder zijn gepubliceerd, gebruikten commerciële kits, zoals Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, die verschillende reactiecomponenten en azidekleurstoffen bieden die zijn getagd met een verscheidenheid aan Alexa Fluor-kleurstoffen voor EdU-opname en -detectie10. De reagentia die bij dergelijke kits worden geleverd, zijn echter niet compatibel met sommige fluorescerende tags die vaak worden gebruikt met secundaire antilichamen. Deze EdU-detectiekit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit geleverd met Alexa Fluor 647-geconjugeerde azidekleurstof) werd getest in Drosophila derde instar larvale NB's, en co-kleuring werd geprobeerd met antilichamen tegen pH3 en Miranda, een marker voor NBs. Verder werden Alexa Fluor 568- of Cy3-gelabelde secundaire antilichamen gebruikt voor de detectie van Miranda-etikettering op het plasmamembraan van NBs11. De verwachte signaalintensiteit en het kleuringspatroon (niet-gepubliceerde resultaten) werden echter niet waargenomen met deze secundaire antilichamen wanneer immunostaining werd uitgevoerd na EdU-detectie.

Voor EdU-opname vereiste het door Daul en collega's beschreven protocol voeding van de larven met Kankel-White-medium gemengd met EdU en broomfenolblauw (BPB)10. De larven voedden zich met het EdU- en BPB-spiked voedsel, dat te zien was aan de blauwe kleur bij inname in de larvale darm. Hoewel deze methode werd gebruikt voor EdU-opname in Mms19-functieverlies (Mms19P) derde instarlarven, voedden de Mms19P-larven zich blijkbaar niet omdat er nauwelijks een blauwe kleur werd gedetecteerd in de larvale darm (ongepubliceerde resultaten). De Mms19P-larven vertonen drastische ontwikkelingsmisvormingen en stoppen uiteindelijk in het derde instarstadium. Dit kan op de een of andere manier het voedingsgedrag van de derde instarlarven beïnvloeden en het EdU-voedingsprotocol ongeschikt maken voor dergelijke gevallen.

Na bestudering van de beschikbare literatuur en uitgebreid werken aan de standaardisatie van essentiële stappen, werd een alternatieve aanpak voorgesteld voor EdU/pH3 dual-labeling in Drosophila NBs, waarvoor geen EdU aan larven hoeft te worden gevoerd. Een eerdere studie gebruikte dubbele EdU / pH3-kleuring om de celcyclus in OS's te analyseren, maar presenteerde geen gedetailleerd protocol4. Dit vormt een onnodige hindernis voor laboratoria die deze methode proberen te implementeren. Bovendien kan het evalueren van de compatibiliteit van verschillende reagentia met de EdU-kit en het uitvoeren van verdere optimalisatie een tijdrovend proces zijn. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol dat betrekking heeft op EdU-opname in ontleed larvale hersenen en immunostaining met anti-pH3-antilichamen, gevolgd door confocale microscopie en beeldanalyse om NBs toe te wijzen aan vier verschillende categorieën: G0 / G1-fase, S-fase, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fase. De stappen die moeten worden geoptimaliseerd, worden beschreven en tips gegeven voor beeldanalyse van grote datasets. Bovendien wordt de EdU / pH3-uitlezing in wild-type NBs geanalyseerd en vergeleken met Mms19P NBs, waarvan onlangs werd gemeld dat ze een celcyclusvertraging11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van reagentia en voorraden voor click-it EdU-test

OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen en tabel 1 voor meer informatie over de kit en reagentia die bij de kit zijn geleverd.

  1. Breng de injectieflacons op kamertemperatuur voordat u de oplossingen bereidt.
  2. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM EdU (component A) door toevoeging van 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO, component C). Meng goed en bewaar bij -20 °C.
  3. Bereid een werkoplossing van Alexa Fluor 647-azide (component B) voor door 70μL DMSO (component C) toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.
  4. Bereid een 1x-oplossing van Click-iT EdU-reactiebuffer (component D) door 4 ml van deze oplossing te mengen met 36 ml gedeïoniseerd water. Bewaar de resterende oplossing bij 2-6 °C.
  5. Maak een 10x bouillon (200 mg/ml) van het Click-iT EdU bufferadditief (component F) door 2 ml gedeïoniseerd water toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.
  6. Bewaar Hoechst 33342 (component G) bij 2-6 °C. DMSO (component C) bewaren in een exsiccator bij -20 °C.
    OPMERKING: Handschoenen moeten worden gebruikt om DMSO en Hoechst te hanteren.

2. Dissectie van derde instar larvale hersenen en EdU-opname

OPMERKING: Het protocol voor hersendissecties is eerder beschreven12. Voordat u met dissecties begint, moet u ervoor zorgen dat voldoende hoeveelheden van de EdU- en PFA-oplossingen worden bereid en ontdooid zoals beschreven in 2.6 en 3.1.

  1. Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl en 2 g KH2PO4 toe te voegen aan 1 l gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 7,4 en bereid vervolgens een 1x-oplossing in gedeïoniseerd water.
  2. Voeg Schneiders dissectiemedium (SM) toe aan twee opeenvolgende depressies van een glazen (3 of 9) depressieglasvlekplaat. Voeg 1x PBS toe aan de volgende opeenvolgende depressie.
  3. Pluk met behulp van een tang zwervende derde instarlarven en plaats op een weefsel bevochtigd met PBS om vliegenvoedselresten te verwijderen. Plaats de larve in de depressie met PBS en vervolgens in de opeenvolgende depressie met SM.
  4. Verwijder met een fijne tang 3/4e van het onderlichaam van de larve.
    1. Pak voorzichtig de larvale mondhaken vast met een tang en houd de cuticula aan het andere uiteinde vast met de andere tang.
    2. Keer de kop van de larve binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen en tegelijkertijd het weefsel aan het andere uiteinde af te pellen.
  5. Observeer de larvale hersenen met bevestigde denkbeeldige schijven. Verwijder andere weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd en breng de hersenen over naar de volgende opeenvolgende depressie met SM.
  6. Ontdooi de 10 mM EdU stockoplossing. Bereid een oplossing van 100 μM door deze voorraad van 10 mM te verdunnen in SM.
  7. Voeg 100 μL van deze 100 μM EdU+SM oplossing toe in een andere depressie op de Pyrex plaat. Incubateer ~5-10 ontleedde hersenen in 100 μL 100 μM EdU+SM oplossing gedurende 2 uur bij 25 °C.
    OPMERKING: Omdat NB's eenmaal in ~ 2 uur delen, heeft dit protocol tot doel één volledige celcyclus te analyseren. Gebruik intacte hersenen alleen voor verdere stappen. Gooi hersenen weg die beschadigd zijn tijdens dissectie.

3. Fixatie en immunostaining

  1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in een zuurkast.
    1. Voeg 4 g paraformaldehydepoeder toe aan 80 ml 1x PBS in een bekerglas op een magneetroerder en verwarm tot 60 °C. Om PFA op te lossen, voeg een paar druppels van 1 N NaOH toe. Controleer de pH en pas deze indien nodig aan op 7,0 met een paar druppels van 1 M HCl.
    2. Stel het volume in op 100 ml met 1x PBS. Vul de PFA-oplossing aan en bewaar tot 1 maand bij 2-6 °C. Voeg 0,3% niet-ionisch wasmiddel (zie de tabel met materialen)toe aan de PFA-oplossing voor een efficiënte fixatie van grote weefsels zoals de larvale hersenen.
  2. Breng na EdU-opname de hersenen over naar microcentrifugebuizen van 0,6 ml die 4% PFA bevatten. Incubeer bij kamertemperatuur op een nutator gedurende 15 min. Tik op de buis op de laboratoriumbank zodat de hersenen zich op de bodem van de buis nestelen.
  3. Verwijder de PFA en was 3 keer met PBS + 0,3% niet-ionisch wasmiddel (PBST) bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat elke wasbeurt minstens 10 minuten duurt op een nutator. Verwijder na de laatste wasbeurt PBST, voeg een blokkerende oplossing (PBST + 5% runderserumalbumine) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verdund anti-Miranda-antilichaam (1:250) en anti-pH3-antilichaam (1:200) in PBST (beide antilichamen in dezelfde buis). Verwijder de blokkerende buffer en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer een nacht bij 2-6 °C op een nutator.
    OPMERKING: Miranda is een membraaneiwit dat aanwezig is op CB NBs. Het dient om deze grote ronde cellen in het CB-gebied te identificeren13.
  5. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was 3 keer met PBST. Zorg ervoor dat elke wasbeurt 10 minuten duurt op een nutator bij kamertemperatuur.
  6. Bereid secundaire antilichaamoplossing voor door 1:500 verdunde Alexa Fluor 488 anti-Rabbit en Alexa Fluor 568 anti-Rat toe te voegen aan PBST. Verwijder de PBST en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan de ontlede hersenen. Incubeer een nacht bij 2-6 °C in het donker, op een nutator, en was 3 keer met PBST (stap 3.5).

4. EdU-detectie, DNA-kleuring en montage

  1. Om de EdU-detectiecocktail te bereiden, mengt u de componenten (zie tabel 2)in een buis van 1,5 ml.
  2. Verwijder na de laatste wasbeurt (stap 3.6) PBST en voeg de EdU-detectiecocktail toe aan de ontlede hersenen. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten op een nutator. Was 2 keer met PBST gedurende 10 minuten elk, in het donker.
  3. Verdun voor DNA-kleuring Hoechst 33342 (component G) 1:2.000 in PBST om een oplossing van 5 μg/ml te bereiden.
  4. Verwijder PBST na de tweede wasbeurt (stap 4.2) en voeg 500 μL 5 μg/ml Hoechst-oplossing toe aan de ontleedde hersenen. Incubeer in het donker gedurende 10 min. Verwijder Hoechst en was eenmaal met PBST gedurende 10 minuten.
  5. Tik op de buis op de laboratoriumbank en laat de hersenen tot rust komen. Haal de PBST uit de buis, maar laat slechts 50-100 μL achter.
  6. Snijd het uiteinde van een micropipettetip van 200 μL en breng de hersenen voorzichtig over op een schone glazen dia. Verwijder overtollige PBST van de dia door te deppen met filtreerpapierstroken. Pas op dat het filterpapier de hersenen niet raakt.
  7. Plaats een druppel in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium op de hersenen en oriënteer de hersenen zodanig dat het ventrale zenuwstreng naar de dia is gericht en de lobben naar boven gericht. Rangschik de hersenen in een enkel bestand, zodat het gemakkelijker is om de hersenen serieel in beeld te brengen.
  8. Plaats voorzichtig een deklap bovenop de hersenen. Plaats de glijbaan 's nachts op 2-6 °C.
    OPMERKING: Het montagemedium hardt uit bij nachtopslag, zodat het niet nodig is om de deklip af te dichten met nagellak.

5. Beeldvorming

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de laserscanmicroscoop en het olie-onderdompelingsobjectief dat in dit protocol wordt gebruikt.

  1. Selecteer in de acquisitiesoftware de doelstelling 63x.
  2. Doe een druppel dompelolie op de coverslip net boven de gemonteerde hersenen om het weefsel gemakkelijker door het oculair te lokaliseren.
  3. Gebruik het DAPI/Hoechst 33342-kanaal om de hersenen via het oculair te vinden en schakel vervolgens over naar de acquisitiemodus in de software.
  4. Stel 4 kanalen in om Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) en Alexa Fluor 647 (EdU) in beeld te brengen. Gebruik de kleurstofassistent, die automatisch de excitatielasers en emissiefilters voor de geselecteerde kleurstoffen instelt.
  5. Stel het gezichtsveld zo in dat het de hele hersenkwab omvat. Stel je het volledige volume van de hersenkwab voor door z-stacks te verkrijgen die 0,8 μm uit elkaar staan. Sla alle afbeeldingen van een beeldbewerkingssessie op in een *.lif-bibliotheekindeling.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de analyse van verkregen beelden en hoe cellen te sorteren in G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progressie van S naar G2/M) en M-fase met behulp van de ImageJ-software.

  1. Download Fiji (Fiji is ImageJ) vanaf de volgende URL: https://fiji.sc/. Open Fiji en sleep de LIF-bestanden naar Fiji.
    OPMERKING: Fiji is een versie van ImageJ die vooraf is geïnstalleerd met verschillende plug-ins14. Het overbrengen van .lif-bestanden naar Fiji opent de Plug-in Bio-formats, die nodig is om de .lif-bestanden te verwerken. Bio-formaten plugin is ook vereist om beeldbestanden gegenereerd van sommige andere microscoop merken, bijvoorbeeld nd2 bestanden gegenereerd met een Nikon microscoop te openen. Deze plug-in wordt vooraf geïnstalleerd met Fiji.
  2. Selecteer Gegevensbrowser op het tabblad Stapelweergave en gebruik virtuele stapel op het tabblad Geheugenbeheer in de plug-in bio-indelingen.
    OPMERKING: Lif-bestanden met z-stacks van 8-10 hersenen zijn vaak 300-400 megabytes groot. Op computers met weinig RAM kan het openen van een paar van dergelijke bestanden het beschikbare RAM-geheugen op ImageJ snel uitputten en verdere beeldverwerking voorkomen. Virtuele stack is 'read-only', heeft geen hoog RAM-geheugen nodig voor verwerking en is een ideale optie om grote datasets op Fiji te laden.
  3. Observeer de meerkanaalsafbeelding die wordt weergegeven in ImageJ. Wijzig de kleur van de kanalen in de menubalk met het gereedschap Afbeelding | kleur | kanalen. Observeer de Miranda-gelabelde NB's als grote ronde cellen in het CB-gebied.
  4. Teken een interessegebied (ROI) met behulp van de ellipstool over elke NB om te voorkomen dat de NB twee keer wordt geteld.
    1. Selecteer in de menubalk ImageJde optie | tools analyseren | ROI-manager. Markeer alle NBs in de huidige z-sectie en druk op t nadat u elke cel hebt gemarkeerd.
  5. Zodra alle NBs in de huidige z-sectie zijn gemarkeerd, wijzigt u de kanalen in pH3 en EdU en telt u handmatig het aantal EdU-positieve NBs, pH3-positieve NBs, NBs die positief kleuren voor zowel EdU als pH3, en NBs die niet kleuren voor beide markers.
  6. Zoek naar NBs in volgende z-secties, verwijder oude ROI's en voeg nieuwe ROI's toe om KB's in verschillende stacks te tellen.
  7. Maak een spreadsheet met de volgende kolommen: 1. EdU- pH3-: deze sectie vertegenwoordigt de dubbelnegatieve cellen die zich in de G0/G1-fase van de celcyclus bevinden; 2. EdU+: de cellen in deze categorie hebben EdU opgenomen en ondergaan DNA-replicatie (S-fase); 3. EdU+ pH3+: deze dubbelpositieve cellen hebben de S-fase voltooid en zijn gevorderd tot de G2- of M-fase; 4. pH3+: deze NB's ondergaan mitose.
  8. Bereken percentages van NBs aanwezig in alle bovenstaande 4 categorieën voor elke lob. Bereid een staafdiagram voor met behulp van de spreadsheetsoftware met de gepoolde gegevens voor percentages VAN KB's in elke categorie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De bi-lobed Drosophila derde instar larvale hersenen is gebruikt als een modelsysteem om fundamentele cellulaire en ontwikkelingsprocessen te bestuderen9. De focus van de huidige studie was om een protocol te presenteren voor analyse van celcyclusprogressie in EdU- en pH3-gelabelde NBs van de CB-regio(figuur 1). De CB NB's zijn onderverdeeld in type I en type II en vertonen het karakteristieke asymmetrische delingpatroon9. Elke type I ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

EdU-opname en de daaropvolgende 'klik'-reactie met celdoorlatend azide biedt praktische voordelen van deze techniek ten opzichte van de BrdU-methode die eerder werd gebruikt7. Deze reactie wordt echter gekatalyseerd door Cu(I)-ionen en verschillende kleurstoffen kunnen onstabiel zijn in de aanwezigheid van deze koperkatalysator, zoals duidelijk wordt geadviseerd door de Click-it EdU-kitfabrikant. Wanneer immunostaining-experimenten waren uitgevoerd na het uitvoeren van de EdU-detectiestap, werd de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Swiss National Science Foundation (projectsubsidie 31003A_173188; www.snf.ch) en de Universiteit van Bern (www.unibe.ch) aan BS. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
vliegstammetjes
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)Bloomington stock center#15477P-element insertie in het derde exon van Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19pGegenereerd in huiseGFP-getagged Mms19-eiwit uitgedrukt in Mms19p achtergrond
w1118Bloomington stock center#3605wild-type stam (w;+;+)
Primaire antilichamenVerdunning
Rat anti-MirandaAbcamAb1977881/250
Rabbit anti-pH3Cell Signaling97011/200
Secundaire antilichamen
Goat anti-Rat Cy3Jackson Immuno112-165-1671/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568InvitrogenA110771/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA270341/500
Reagens/Kit
Aqua Poly/Mount montagemediumPolysciences Inc18606-20
Click-it EdU incorporatiekit, Alexa Flour 647Thermo Fischer ScientificC10340
Schneider’s Drosophila-mediumThermo Fischer Scientific21720-024
Bovine serum albumine (BSA) fractie VMerck10735078001
Triton X-100Fischer Scientific9002-93-1niet-ionogene detergent
Software
Fiji (Imagej)https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)Leica microsystems
PRISMGraph pad softwareVersie 5
Microsoft ExcelMicrosoft office2016
Apparatuur
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscoop met 63x olie-immersie, 1.4 NA Plan-apochromat objectief
Materialen
Aqua Poly/Mount montagemediumwateroplosbaar, niet-fluoriserend montagemedium
Pyrex 3 of 9 depressieglas spotplaat
Whatman filterpapier

Referenties

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894(2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015(2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CelcyclusanalyseEdU labelingknockdown van mitotische genenimmunokleuringsprotocolbeeldanalyse FijineuroblastkwantificeringDNA replicatiemarkers
5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.