Methodenartikel

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62643

⸱

22 februari 2022

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux mogelijk is.

Samenvatting

Hartherprogrammering is een potentieel veelbelovende therapie geworden om een beschadigd hart te herstellen. Door meerdere transcriptiefactoren te introduceren, waaronder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kunnen fibroblasten worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's). Deze iCM's, wanneer ze in situ worden gegenereerd in een infarcthart, integreren elektrisch en mechanisch met het omringende myocardium, wat leidt tot een vermindering van de littekengrootte en een verbetering van de hartfunctie. Vanwege de relatief lage herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit van de iCM's blijft de karakterisering van iCM's een uitdaging. De momenteel gebruikte methoden op dit gebied, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR, richten zich voornamelijk op hartspecifieke gen- en eiwitexpressie, maar niet op de functionele rijping van iCM's. Getriggerd door actiepotentialen, leidt het openen van spanningsafhankelijke calciumkanalen in cardiomyocyten tot een snelle instroom van calcium in de cel. Daarom is het kwantificeren van de snelheid van calciuminstroom een veelbelovende methode om de cardiomyocytenfunctie te evalueren. Hier introduceert het protocol een methode om de iCM-functie te evalueren door calcium (Ca2 +) flux. Een αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam werd vastgesteld door Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (hierna Myh6-Cre genoemd) te kruisen met Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (hierna Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genoemd) muizen. Neonatale cardiale fibroblasten (NCF's) van P0-P2 neonatale muizen werden geïsoleerd en in vitro gekweekt, en een polycistronische constructie van MGT werd geïntroduceerd bij NPF's, wat leidde tot hun herprogrammering naar iCM's. Omdat alleen succesvol geherprogrammeerde iCM's de GCaMP3-reporter tot expressie brengen, kan de functionele rijping van iCM's visueel worden beoordeeld door Ca2 + flux met fluorescentiemicroscopie. Vergeleken met niet-geherprogrammeerde NKK's vertoonden NCF-iCM's een significante calciumtransiënte flux en spontane contractie, vergelijkbaar met CM's. Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van muizenstam, isolatie en selectie van neonatale muizenharten, NCF-isolatie, productie van retrovirus voor cardiale herprogrammering, iCM-inductie, de evaluatie van iCM Ca2 + flux met behulp van onze reporterlijn en gerelateerde statistische analyse en gegevenspresentatie. Verwacht wordt dat de hier beschreven methoden een waardevol platform zullen bieden om de functionele rijping van iCM's voor cardiale herprogrammeringsstudies te beoordelen.

Inleiding

Myocardinfarct (MI) is wereldwijd een ernstige ziekte. Hart- en vaatziekten (CVD's) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en zijn goed voor ongeveer 18,6 miljoen sterfgevallen in 20191,2. De totale sterfte van CVD's is de afgelopen halve eeuw afgenomen. Deze trend is echter vertraagd of zelfs gekeerd in sommige onontwikkelde landen1, wat vraagt om effectievere behandelingen van HVZ. Als een van de fatale manifestaties van HVZ is MI goed voor ongeveer de helft van alle sterfgevallen die worden toegeschreven aan HVZ in de Verenigde Staten2. Tijdens de ischemie, met de blokkering van kransslagaders en beperkte toevoer van zowel voedingsstoffen als zuurstof, lijdt het myocardium aan ernstige metabole veranderingen, schaadt het de systolische functie van cardiomyocyten (CMs) en leidt het tot CM-dood3. Talrijke benaderingen in cardiovasculair onderzoek zijn onderzocht om hartletsel te herstellen en de functie van het gewonde hart te herstellen4. Directe hartherprogrammering is naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om het beschadigde hart te herstellen en de functie ervan te herstellen5,6. Door de introductie van Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kunnen fibroblasten in vitro en in vivo worden geherprogrammeerd naar iCM's, en die iCM's kunnen het littekengebied verminderen en de hartfunctie verbeteren7,8.

Hoewel hartherprogrammering een veelbelovende strategie is voor MI-behandeling, blijven er een aantal uitdagingen. Ten eerste zijn de herprogrammeringsefficiëntie, zuiverheid en kwaliteit niet altijd zo hoog als verwacht. MGT-inducering kan slechts 8,4% (cTnT+) of 24,7% (αMHC-GFP+) van de totale CF's bereiken die in vitro naar iCM's moeten worden geherprogrammeerd7, of tot 35% in vivo8, wat de toepassing ervan beperkt. Zelfs met meer factoren geïnduceerd in het systeem, zoals Hand29 of Akt1 / PKB10, is de herprogrammeringsefficiëntie nog steeds nauwelijks bevredigend om in een klinische omgeving te worden gebruikt. Daarom zijn er meer studies nodig die gericht zijn op het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie op dit gebied. Ten tweede zijn de elektrische integriteit en contractiekenmerken van iCM's belangrijk voor de efficiënte verbetering van de hartfunctie, maar deze zijn een uitdaging om te evalueren. Momenteel zijn veelgebruikte evaluatiemethoden in het veld, waaronder flowcytometrie, immunocytochemie en qPCR van enkele belangrijke CMs-genenexpressie, allemaal gericht op de gelijkenis van iCM's en CMs, maar niet direct gerelateerd aan de functionele kenmerken van iCM's. Bovendien hebben die methoden relatief ingewikkelde procedures en zijn ze tijdrovend. Terwijl herprogrammeringsstudies meestal een screening van potentiële herprogrammeringsfactoren omvatten die de rijping van iCM's bevorderen11, vereist cardiale herprogrammering een snelle en handige methode op basis van de iCM-functie.

CMs openen de spanningsafhankelijke calciumionkanalen op het cytomembraan tijdens elke contracteringscyclus, wat leidt tot een voorbijgaande instroom van calciumion (Ca2 +) van de intercellulaire vloeistof naar het cytoplasma om deel te nemen aan de myofilamentcontractie. Zo'n Ca2+ instroom- en outfluxcyclus is de fundamentele eigenschap van myocardiale contractie en vormt de normale functie van CMs12. Een methode die Ca2+ instroom detecteert, zou dus een mogelijke manier kunnen zijn om de functie van CM's en CM-achtige cellen, waaronder iCM's, te meten. Bovendien biedt een dergelijke methode voor iCM's een andere manier om de efficiëntie van herprogrammering te evalueren.

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zijn ontwikkeld en op grote schaal gebruikt om celactiviteiten aan te geven, met name actiepotentialen. Over het algemeen bestaan GECI's uit een Ca2 + bindend domein zoals calmodulin en een fluorescerend domein zoals GFP, en GCaMP3 is er een met een hoge affiniteit en fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedomein van GCaMP3 wordt geactiveerd wanneer de lokale calciumconcentratie wordt gewijzigd13. In dit artikel wordt een muizenstam beschreven die specifiek een GCaMP3-verslaggever in Myh6+ cellen tot expressie brengt. Door MGT te introduceren in de geïsoleerde NCF's van pasgeborenen van deze stam, kan de herprogrammering worden gevolgd door fluorescentie, die met succes geherprogrammeerde iCM's zal vertonen. Zo'n muizenstam en -methode zal een waardevol platform bieden om cardiale herprogrammering te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures en praktijken met dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care & Use Committee van de Universiteit van Michigan. Alle experimentele procedures en praktijken met celkweek moeten worden uitgevoerd BSL2 Biologische Veiligheidskast onder steriele omstandigheden. Voor de procedures en praktijken met betrekking tot virussen werd de richtlijn van de juiste verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buizen gevolgd om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voorkomen.

1. Vaststelling van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (aangeduid als Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muizenstam (Figuur 1)

  1. Bereid Tg(Myh6-cre)1Jmk/J muizenstam (Jackson lab stock 009074, aangeduid als Myh6-Cre) en Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam (Jackson lab stock 014538, aangeduid als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectievelijk voor.
  2. Fok elke soort tot 8 weken oud om respectievelijk volwassen Myh6-Cre- en Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-muizen te verkrijgen.
  3. Kruiste de volwassen Myh6-Cre en de Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizen.
    OPMERKING: Stel Myh6-Cre male / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 female in of vice versa. Er is geen significant verschil tussen hun nakomelingen. Meestal zullen de vrouwelijke muizen 19-21 dagen na de kruising 8-10 pups baren.

2. Isolatie en selectie van neonatale Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenharten.

  1. Verkrijg P0-P2 pups. Zorg ervoor dat er 8-10 pups aanwezig zijn om 10 miljoen NFC's met dit protocol te isoleren.
  2. Diep verdoofd de pups door onderkoeling. Plaats de pups in een latex handschoen en dompel ze tot aan de nek onder in gemalen ijs en water (2°C - 3°C).
  3. Ontsmet de pups kort met 75% ethanol.
  4. Offer de pups door onthoofding met een steriele schaar.
  5. Maak een horizontale incisie in de buurt van het hart, knijp in het hart en isoleer het vervolgens door het te scheiden aan de wortel van de aorta met een schaar.
  6. Observeer het kloppen van het hart onder een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat de harten met Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype Ca2+ flux aangegeven door GCaMP3 met kloppend hart vertoont. De andere genotypen vertonen geen fluorescentie (figuur 2, video 1 en video 2).

3. Isolatie van neonatale cardiale fibroblasten (NFF's)

OPMERKING: Voor dit deel werd het protocol van Dr. Li Qian's Lab14 overgenomen met kleine optimalisaties indien van toepassing op deze studie.

  1. Na isolatie van de αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 harten, snijdt u ze in vier stukken die losjes met elkaar verbonden zijn. Was ze in ijskoude DPBS in een plaat van 6 cm meerdere keren grondig om de bloedcelvervuiling in de geïsoleerde cellen te beperken.
  2. Breng de harten over naar een conische buis van 15 ml.
  3. Verteer de harten met 8 ml warme 0,25% Trypsine-EDTA bij 37 °C gedurende 10 minuten.
  4. Gooi het trypsine supernatant weg en voeg 5 ml warm type-II collagenase (0,5 mg/ml) toe aan HBSS.
  5. Vortex het mengsel grondig en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Vortex na de incubatie grondig en laat het onverteerde weefsel door de zwaartekracht bezinken.
  7. Verzamel het supernatant in een conische buis van 15 ml met 5 ml koud fibroblast (FB) medium (IMDM met 20% FBS en 1% penicilline / streptomycine).
  8. Herhaal stap 3,4-3,7 voor het onverteerde weefsel 4-5 keer.
  9. Verzamel alle supernatant bij elkaar en filter het supernatant met een zeef van 40 μm.
  10. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  11. Resuspend de cellen in 10 ml magnetisch geactiveerde celsorteerbuffer (MACS-buffer; 1x PBS met 2 mM EDTA en 0,5% BSA).
  12. Bepaal het levensvatbare celnummer door trypan blauwe kleuring.
    1. Neem 10 μL cellen uit 10 ml celsuspensie in stap 3.11.
    2. Meng met 10 μL 0,4% trypan blauwe oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg het mengsel toe aan een hemocytometer en bepaal het levensvatbare celnummer. De dode cellen zijn blauw gekleurd, terwijl de levensvatbare cellen onbevlekt zijn.
  13. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
  14. Resuspend de cellen met 10 μL Thy1.2 microbeads in 90 μL gekoelde MACS-buffer voor minder dan 10 miljoen levensvatbare cellen. Voeg proportioneel meer kralen toe als er meer dan 10 miljoen levensvatbare cellen zijn. Pipetteer het mengsel goed en incubeer bij 4 °C gedurende 30-60 min.
  15. Voeg 10 ml MACS-buffer toe en meng goed.
  16. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg.
  17. Herhaal stap 3.15-3.16 eenmaal.
  18. Resuspend de cellen en kralen met 2 ml MACS-buffer.
  19. Plaats een MACS-separator in de kap. Plaats een LS-kolom in het scheidingsteken en breng de kolom in evenwicht met 3 ml MACS-buffer.
  20. Wanneer de LS-kolom in evenwicht is, voert u de cellen door de kolom.
  21. Was de LS-kolom driemaal met 2 ml MACS-buffer.
  22. Haal de kolom van de separator, eluteer deze drie keer met 2 ml MACS-buffer en verzamel vervolgens de elutie in een buis van 50 ml.
  23. Centrifugeer 5 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
  24. Resuspend de cellen met 5 ml FB-media.
  25. Bepaal het celgetal met een hemocytometer.
  26. Verdun de cellen met FB-media en zaai de cellen naar wens naar schotels of borden. Zorg ervoor dat de celzaaidichtheid ongeveer 2-2,5 x 104 cellen / cm2 is (optimaliseer de dichtheid op basis van individuele experimenten). Zorg ervoor dat de aangehechte fibroblasten op de tweede dag na het zaaien een ovale tot ronde vorm hebben (figuur 3).

4. Productie van retroviruscodering polycistronische MGT-vector voor hartherprogrammering

  1. Houd Plat-E met Plat-E kweekmedia (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1 μg/ml puromycine en 10 μg/ml blasticidin) bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Splits Plat-E op dag 1 tot een 6-well plaat met ongeveer 4-5 x 105 cellen/putdichtheid.
  3. Op dag 2 bereikt Plat-E meestal 80% confluentie. Transfecteer de cellen met de volgende procedures. Pas het volume en de hoeveelheid van elk element dat hier aanwezig is aan op basis van elke put in een 6-well plaat.
    1. Verdun 2 μg pMX-puro-MGT polycistronische retrovirusexpressie plasmide vector (Addgene 111809) tot 500 ng/μL met TE buffer.
    2. Bereid het transfectiemengsel door 10 μL Lipofectamine te mengen met 150 μL gereduceerd serummedium. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Wees voorzichtig om bubbels te vermijden bij het pipetteren.
    3. Bereid ondertussen een plasmidemengsel door het plasmide te mengen met 150 μL gereduceerd serummedium. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Wees voorzichtig om bubbels te vermijden bij het pipetteren.
    4. Meng de twee mengsels voorzichtig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De oplossing kan troebel lijken.
    5. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan de te transfecteren cellen.
    6. Incubeer de cellen bij 37 °C 's nachts.
  4. Verander op dag 3 het medium in een vers volledig celkweekmedium zonder puromycine en blasticidin.
  5. Verzamel op dag 4, 48 uur na de transfectie, het supernatant dat retrovirus bevat en bewaar het in 4 °C.
  6. Verzamel op dag 5, 72 uur na de transfectie, het supernatant dat retrovirus bevat.
  7. Filtreer zowel het 48 h als 72 h supernatant met een filter van 0,45 μm, sla 's nachts neer bij 4 °C door 1/5 volume 40% Poly (ethyleenglycol) (PEG) oplossing toe te voegen om een eindconcentratie van 8% PEG te maken.
  8. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 30 minuten om het virus neer te slaan.
    OPMERKING: PEG8000-virus vormt kleine witte neerslag.
  9. Resuspend het virus met iCM-medium dat naar wens 8 μg/ml polybreen bevat. Gebruik het retrovirus onmiddellijk.

5. NNF's herprogrammeren naar iCM's met MGT-codering van retrovirusinfectie

  1. Groei of passeer NCF's vóór virusinfectie.
    OPMERKING: Meestal kan NCF twee keer worden gepasseerd.
  2. Op dag 0, zaad NCF tot de dichtheid rond 1-2 x 104 cellen / cm2 in FB medium.
  3. Vervang op dag 1 het kweekmedium door een virusbevattend medium voor elke put zoals gewenst. Gebruik het virus van één put Plat-E in een 6-putplaat om twee putten in een 24-putplaat te infecteren. Titer het virus om de optimale virusconcentratie te bepalen.
    OPMERKING: Virussen die andere herprogrammeringsfactoren van belang bevatten, kunnen samen met MGT retrovirus worden geïntroduceerd.
  4. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
  5. Vervang op dag 2, 24 uur na de virusinfectie, het virusbevattende medium door een regulier iCM-medium.
  6. Om de GCaMP3-expressie te controleren, plaatst u deze onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Observeer onder 10x bij het GFP-kanaal de milde basale GCaMP3-fluorescentie van een deel van de cellen al op dag 5.
  7. Vervang het medium om de 2-3 dagen tijdens de herprogrammering. Voer indien nodig een positieve selectie uit voor mgt-retrovirus geïnfecteerde cellen door gedurende 3 dagen 2 μg / ml puromycine aan het kweekmedium toe te voegen en het op 1 μg / ml te houden.
    OPMERKING: Introduceer interessante chemicaliën (bijv. IGF-1, MM589, A83-01 en PTC-209, aangeduid als IMAP zoals we eerder meldden15) samen met gemiddelde verandering.
  8. Vervang na 14 dagen infectie het medium door B27-medium om iCM-rijping verder te induceren.

6. Evaluatie van de functionele rijping en herprogrammeringsefficiëntie van iCM door Ca2+ flux

OPMERKING: Voeg indien nodig 1 μM isoproterenol toe aan de te evalueren cellen vóór de beoordeling.

  1. Beoordeel de Ca2+ flux met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij kamertemperatuur.
  2. Observeer in het GFP-kanaal de GCaMP3 + -cellen onder het 10x-objectief. Zorg ervoor dat het spontane celklopperij in het heldere veldkanaal laat zien.
  3. Selecteer willekeurig drie velden onder de 20x en noteer de Ca2+ flux van de iCM's gedurende 3 minuten voor elk veld.
    OPMERKING: Hier werd de Ca2+ flux gesynchroniseerd met spontane celslagen (Figuur 4, Figuur 5, en Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8).
  4. Kwantificeer de cellen handmatig met Ca2+ flux.

7. Statistische analyse en presentatie van gegevens

  1. Analyseer de verschillen tussen groepen one-way analysis of variance (ANOVA) en voer de Student-Newman-Keuls meerdere vergelijkingstests uit.
    OPMERKING: De resultaten worden als gemiddelde ± S.E met p < 0,05 als statistisch significant beschouwd. Elk experiment werd minstens drie keer uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimentele workflow voor het genereren van Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muizenstam en de genstructuur van de transgene muizen is weergegeven in figuur 1. Terwijl de muizenstam is vastgesteld, werden de harten van de pups geïsoleerd en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om het genotype te bevestigen. Harten met correct genotype tonen Ca2+ flux gesynchroniseerd met kloppen, gevisualiseerd als GCaMP3 fluorescentie, terwijl er geen fluorescentie w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het evalueren van de iCM-functie is noodzakelijk voor het cardiale herprogrammeringsveld. In dit manuscript beschrijft het protocol een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J muizenstam die is vastgesteld, hoe de NPF's geïsoleerd uit de neonatale muizen in deze stam te gebruiken voor de herprogrammering naar iCM's, en de evaluatie van de iCM-functie door Ca2+ flux. Dit is een de novo methode om de functionele rijping van iCM's te evalueren.

Versch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We waarderen de inspanningen van Leo Gnatovskiy bij het redigeren van de Engelse tekst van dit manuscript. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten (1R01HL109054) subsidie aan Dr. Wang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-70C
50mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-49A
6 Well Cell Culture PlatesAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04–0014
All-in-One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X800EInvertede fluorescentiemicroscoop
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderThermo Fisher ScientificBP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
Counting ChamberThermo Fisher Scientific02-671-51BHemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamineThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, calcium, magnesiumThermo Fisher Scientific14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermo Fisher Scientific14025092
IMDM mediaThermo Fisher Scientific12440053
IX73 Inverted MicroscopeOlympusIX73P2FInvertede fluorescentiemicroscoop
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11-668-019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Medium 199, Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS Separator and Starting KitsMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell LineCell BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poly(ethylene glycol)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Polybrene Infection / Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143–5MG
Puromycin DihydrochlorideThermo Fisher ScientificA1113803
Recombinant Human IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093
ST 16 Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75-004-381
Sterile Cell StrainersThermo Fisher Scientific22-363-54740 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture DishesThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Trypan Blue solutionMillipore SigmaT8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
Vortex MixerThermo Fisher Scientific02215365

Referenties

  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036(2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426(2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505(2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ge nduceerde cardiomyocytenneonatale cardiace fibroblastenfunctionele rijpingfluorescentiemicroscopiecardiace differentiatieretrovirale transductiehartisolatie

Gerelateerde artikelen