Speekselklieren zijn voorgesteld als een weefseldoelplaats voor gentherapie, vooral op het gebied van vaccinatie door genoverdracht. We demonstreren genafgifte in een niet-menselijk primatenmodel met behulp van retrograde parotisinfusie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Retrograde parotisklierinfusie via het kanaal van Stensen in een niet-menselijke primaat voor vectored genafgifte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Speekselklieren zijn een aantrekkelijk weefseldoel voor gentherapie met veelbelovende resultaten die al leiden tot menselijke proeven. Ze zijn inherent in staat om eiwitten in de bloedbaan af te scheiden en zijn gemakkelijk toegankelijk, waardoor ze potentieel superieure weefselplaatsen zijn voor vervangingshormoonproductie of vaccinatie door genoverdracht. Voorgestelde methoden voor genafgifte omvatten transcutane injectie en retrograde infusie via speekselkanalen. We demonstreren hoe retrograde speekselklierinfusie (RSGI) moet worden uitgevoerd bij niet-menselijke primaten. We beschrijven de belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de identificatie van de parotis papilla, een atraumatische methode voor het cannuleren en afdichten van Stensen's Duct met behulp van elementaire tandheelkundige hulpmiddelen, polyethyleenbuizen en cyanoacrylaat, en de juiste infusiesnelheid. Hoewel dit de minst traumatische methode van levering is, wordt de methode nog steeds beperkt door het volume dat kan worden afgeleverd (<0,5 ml) en het potentieel voor trauma aan het kanaal en de klier. We tonen met behulp van fluoroscopie aan dat een infundaat volledig in de klier kan worden afgeleverd en tonen verder aan door immunohistochemie de transductie van een typische vector en expressie van het afgeleverde gen.
Inleiding
Hoewel speekselklieren bekend staan om hun exocriene productie van speeksel, hebben onderzoekers al lang hun vermogen erkend om eiwitten rechtstreeks in de bloedbaan af tescheiden 1, waardoor ze een potentieel doelwit zijn voor gentherapie voor systemische toediening, zoals vervangingshormonen of antilichaamproductie. In feite bieden speekselklieren verschillende voordelen ten opzichte van andere weefseldoelen, zoals het inherente vermogen om eiwitten te produceren voor secretie (een eigenschap die spieren missen), zware inkapseling die vectordiffusie kan beperken en goed gedifferentieerd weefsel dat stabiliteit biedt voor niet-integrerende vectoren. Bovendien zijn speekselklieren in het geval van een ernstige bijwerking niet kritiek voor het leven en kunnen ze operatief worden verwijderd. Hoewel niet onmiddellijk intuïtief, zijn parotisklieren ook gemakkelijk toegankelijk vanuit de mond via hun belangrijkste uitscheidingskanaal, Stensen's Duct2.
Gezien de voordelen van speekselweefsel voor gentherapie, is er steeds meer interesse in het verkennen van dit weefseldoel. Talrijke studies zijn al uitgevoerd in knaagdier-, honden- en niet-menselijke primatenmodellen en ten minste één klinische proef bij mensen is aan de gang3,4,5. Om het nut van dit weefseldoel voor gentherapiedoeleinden verder te onderzoeken en te ontwikkelen, zullen meer niet-menselijke primatenstudies moeten worden uitgevoerd. Dit artikel beschrijft een methode voor toegang tot de parotisklieren via Stensen's Duct om een vectored gen voor transductie af te leveren in het niet-menselijke primaatmodel. Om de afgifte van het infundaat en de anatomie van het kanaal bij het binnenkomen van de klier zichtbaar aan te tonen, werd fluoroscopie met behulp van radiocontrast uitgevoerd. Om succesvolle transductie van een vector aan te tonen, werd een Adenovirus serotype 5 (Ad5) vectored egfp-gen gebruikt. Ad5 is een goed beschreven vector die speekselweefsel kan transduceren. Hoewel het te immunogeen is voor ultiem klinisch gebruik, werd voor deze demonstratiestudie een Ad5-vector gekozen om efficiënte transductie te garanderen. Het evalueren van Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) productie is een goed beschreven methode om succesvolle transcriptie en translatie van een vectored gen na transductie aan te tonen en werd hier gedaan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd op wake forest school of medicine Clarkson Campus voor dierstudies. Het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) werd geraadpleegd voor ethische overwegingen en details van de procedures werden ter beoordeling voorgelegd. Wake Forest IACUC keurde ons onderzoeksprotocol goed en alle procedures werden uitgevoerd onder het door IACUC goedgekeurde protocol #A17-147.
1. Voorbereiding van het infuusapparaat
- Knip maat 10 Polyethyleen Buis (PET10) in lengtes van 25 cm met een schaar.
- Markeer PET10 op 1 cm en 2 cm van het ene uiteinde met een zwarte stift.
- Vul 0,5 ml Ad5-EGFP-oplossing (109 virale deeltjes/ml) voor in een spuit van 1 ml (tuberculine).
- Schuif het niet-gemarkeerde uiteinde van de PET10-buis over een naald van 29-31 G die aan een spuit is bevestigd. Het is over het algemeen gemakkelijker om deze taak onder vergroting uit te voeren.
- Laat de oplossing in de PET10 trekken totdat de buis volledig vol is (zichtbare druppel aan het vrije uiteinde).
- Gebruik volledige standaard PBM's, waaronder chirurgische scrubs, jurk met lange mouwen, ondoordringbare handschoenen, chirurgisch masker, gezichtsscherm, haarkap en schoenovertrekken.
2. Het dier voorbereiden
OPMERKING: Cynomolgus makaken werden gebruikt voor de videodemonstratie. De anatomie van andere niet-menselijke en menselijke primaten lijkt erg op elkaar en het protocol moet vertaalbaar zijn naar andere soorten.
- Injecteer subcutaan 0,05 mg/kg atropine 15 minuten voorafgaand aan de procedure om speekselafscheidingen te minimaliseren en de distributie en retentie van het infusaat te optimaliseren.
- Zorg voor anesthesie met behulp van 5 ml spuiten met intramusculaire ketamine / midazolam (10-15 mg / kg ketamine en 0,01-0, 05 mg / kg midazolam). Bevestig de juiste anesthesie wanneer het verdoofde dier bewusteloos raakt en niet in staat is om op stimuli te reageren.
3. Uitvoeren van de procedure
- Gebruik orale retractors om de open mond te schrap te zetten.
- Plaats het rubberen kussen van het ene uiteinde van het retractor op het harde gehemelte achter de boventanden aan de kant van de mond tegenover de klier die zal worden toegediend. Plaats het rubberen kussen van het andere uiteinde op de onderste hond aan dezelfde kant als het bovenste oprolmechanisme. Laat de veerwerking van het retractor voorzichtig uitzetten en de mond openen.
- Identificeer de parotis papilla, de opening van Stensen's Duct, op de achterste wang, grenzend aan de bovenste2e kies. Dit kan het beste worden gevisualiseerd met behulp van tandheelkundige lussen voor vergroting.
- Verwijd de parotis papilla voorzichtig met de punt van de conische dilatator. Het is het beste om het punt van de dilatator in het midden of de opening van de papilla te plaatsen en deze vervolgens voorzichtig heen en weer te draaien. Het punt moet langzaam de papilla binnendringen en deze verwijden over ongeveer 20 - 30 s zacht roterend.
- Steek de PET10-slang in de verwijde parotispapillen. Dit kan het beste worden bereikt door het gemarkeerde uiteinde van de PET10-buis met een pincet ongeveer 0,5 cm van het distale uiteinde vast te houden en de punt van de buis voorzichtig in de verwijde papilla in te brengen.
- Breng de buis voorzichtig vooruit, wat vaak wordt vergemakkelijkt door kleine roterende bewegingen om de buis te laten glijden, gevolgd door het afstellen van het pincet 0,5 cm proximaal ten opzichte van de vorige greep. Herhaal dit totdat de 2 cm markering de parotis papilla bereikt.
- Breng cyanoacrylaat aan op de wang rond de papilla en de ingebrachte buis en wacht tot deze droog is (geen specifieke hoeveelheid geregistreerd, net genoeg om de ingang van Stensen's duct papilla af te sluiten). Dit duurt meestal minder dan een minuut en helpt de parotis papilla af te sluiten en het morsen van infusaat terug in de mondholte te verminderen.
- Duw de inhoud van de spuit langzaam gedurende 5 minuten met een snelheid van 100 μL/min. Deze langzame infusiesnelheid minimaliseert het risico op kanaalletsel als gevolg van een plotselinge toename van de intra-ductale druk.
- Laat PET10 op zijn plaats gedurende ten minste 5 minuten nadat de infusie is voltooid. Houd het kanaal afgesloten en laat het infundaat in de parotisklier blijven.
- Verwijder PET10 met zachte grip. Het cyanoacrylaat trekt los met de buis.
- Herhaal stap 3.2 tot en met 3.8 aan de andere kant.
- Laat orale retractors langzaam los nadat beide parotis zijn toegediend en beide PET10-buizen zijn verwijderd.
OPMERKING: De hele procedure voor beide zijden duurt minder dan 30 minuten.
4. Post-procedurele zorg
- Nadat de infusie is voltooid en het kanaal van Stensen is gedecannuleerd, observeert u de dieren totdat het anesthesie-effect verdwijnt (meestal tussen 20-30 minuten na de procedure).
- Bied het dier drankjes en vervolgens voedsel aan nadat ze volledig wakker zijn en hervat de routinezorg.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle procedure, transductie en transcriptie
Figuur 1 toont de parotis papilla grenzend aan de2e kies op de achterste superieure wang. De afbeelding toont ook de juiste plaatsing van de mondbeugel, een rubberen uiteinde op het harde gehemelte en het andere rubberen uiteinde op de ipsilaterale hond. Figuur 2 toont een afbeelding genomen na succesvolle cannulatie van de parotis papilla op de 2 cm markering op de PET10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een protocol van retrograde infusie in de parotisklier via het kanaal van Stensen. De beschreven methodologie biedt richtlijnen die mogelijk kunnen worden gebruikt door onderzoekers die het nut van speekselweefsel onderzoeken als een site voor gentherapie en andere toepassingen.
Er zijn meerdere kritieke stappen om het succes van de procedure te garanderen. Eerst en vooral moeten alle procedurele stappen voorzichtig worden voltooid. Krachtige versteviging van de mond kan le...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de heer Cagney Gentry bedanken voor zijn audiovisuele ondersteuning bij het filmen van de procedure. We willen ook het Hefner VA medisch centrum erkennen voor academische ondersteuning bij het nastreven van dit project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 500 µL U100-spuitpompjes met 30-gauge naalden | Becton Dickinson | 328466 | vaste naald voor minder verspilling |
| Kleefstof (bijv. Ethicon Dermabond) | Verschillende | Cyanoacrylaatkleefstof om de slang in de ductus te verzegelen en vast te houden tijdens de infusie. | |
| Atropine injectieoplossing | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0,54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insuline-spuitpompjes 30G | Walmart | N/A | Beschikbaar in 0,5 mL en 1,0 mL maten. |
| Cyanoacrylaat (medische lijm) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topisch huidkleefmiddel |
| Tandartslussen met licht | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Wordt gebruikt om de visualisatie van de papilla van de ductus van Stensen te verbeteren |
| Lacrimale dilatator voor baby's | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectieoplossing | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimale dilatator | Surgipro | SPOI-132 | Wordt gebruikt om de ductus van Stensen te dilateren. |
| Midazolam injectieoplossing | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Een paar schaar | Amazon (DDP) | N/A | Wordt gebruikt om PET10-buis te snijden |
| Polyethyleenslang (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Slang die de 30G-spuitpomp en de slang in de ductus verbindt. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Wordt gebruikt om cyanoacrylaat op de wang te verspreiden |
| Polyethyleenbuis (PET 10) maat 10 | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | polyethyleenbuis met lage dichtheid |
| Mondopener voor kleine dieren | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Wordt gebruikt om de mond van het dier open te houden. |
| Pincet | Amazon (DDP) | N/A | Wordt gebruikt om PET10-buis in de ductus van Stenson te steken |
| Zinkchloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Opgenomen in plasmide-DNA-infusaten |
Referenties
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
