Method Article

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Versterkers zijn bindingsplatforms voor een breed scala aan transcriptiefactoren die specifieke expressiepatronen van weefsel- en celtypespecifieke genen aansturen. Meerdere middelen om niet-coderend DNA en verschillende chromatinetoestanden te beoordelen, zijn nuttig gebleken bij het voorspellen van de aanwezigheid van enhancersequenties in het genoom, maar het valideren van de activiteit van deze sequenties en het vinden van de organen en ontwikkelingsstadia waarin ze actief zijn, is een arbeidsintensief proces. Recente ontwikkelingen in adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren hebben de wijdverspreide levering van transgenen aan muizenweefsels mogelijk gemaakt, waardoor in vivo versterkertests mogelijk zijn zonder dat een transgeen dier nodig is. Dit protocol laat zien hoe een reporterconstructie die EGFP uitdrukt onder controle van een minimale promotor, die op zichzelf geen significante expressie aandrijft, kan worden gebruikt om de activiteitspatronen van kandidaat-versterkersequenties in het muizenbrein te bestuderen. Een AAV-verpakte reporterconstructie wordt afgeleverd bij de hersenen van de muis en gedurende 1-4 weken geïncubeerd, waarna het dier wordt geofferd en hersensecties onder een microscoop worden waargenomen. EGFP verschijnt in cellen waarin de geteste versterker voldoende is om genexpressie te initiëren, waarbij de locatie en het ontwikkelingsstadium waarin de versterker actief is in de hersenen wordt bepaald. Standaard kloonmethoden, goedkope AAV-verpakkingen en uitbreidende AAV-serotypen en -methoden voor in vivo levering en standaard beeldvormingsuitlezing maken dit een toegankelijke benadering voor de studie van hoe genexpressie in de hersenen wordt gereguleerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Versterkers zijn genomische cis-regulerende elementen die dienen als transcriptiefactorbindingsplaatsen en de expressie van een doelgen op een spatiotemporaal specifieke manier kunnen stimuleren 1,2. Ze zijn differentieel actief in verschillende celtypen, weefsels en ontwikkelingsstadia en kunnen substraten zijn van ziekterisicogerelateerde genomische variatie 3,4. De noodzaak om de dynamiek van de enhancer-functie te begrijpen is dus van cruciaal belang voor vooruitgang in zowel translationele als fundamentele wetenschappelijke toepassingen binnen genomica. In silico kunnen voorspellingen van enhancer-activiteit dienen als uitstekende bronnen voor het genereren van hypothesen als voor enhancer-capaciteit 5,6. Een dergelijke voorspelde enhancer-activiteit kan aanvullende validatie en ondervraging vereisen voor een volledig begrip van de functionele activiteit. Enhancer reporter assays zijn waardevol gebleken voor dit doel in verschillende systemen, van cellen tot dieren 7,8,9. Om deze studies uit te breiden in een flexibele en kosteneffectieve voorbijgaande in vivo context, beschrijft dit protocol het gebruik van in vivo AAV-gebaseerde methoden om vermeende enhancersequenties te testen op hun vermogen om de expressie van een ectopisch reportergen in het postnatale muizenbrein te stimuleren. Deze familie van methoden heeft nut voor het ondervragen van enkele kandidaatsequenties of parallelle bibliotheekscreening en is relevant voor fundamenteel en translationeel onderzoek.

Deze methode combineert in een enkel plasmide een vermeende versterker kandidaat-DNA-sequentie met een reporter-gen (hier EGFP), onder de controle van een minimale promotor die alleen geen significante expressie stimuleert. Het plasmide wordt verpakt in recombinant AAV (rAAV) en geïnjecteerd in een diermodel. Hoewel de toepassing hier op de hersenen is, maken verschillende rAAV-serotypen infectie in verschillende weefseltypen mogelijk, zodat deze aanpak kan worden uitgebreid naar andere systemen10. Na verloop van tijd kunnen de hersenen worden verzameld en getest op de expressie van het reporter-gen. Sterke expressie, vergeleken met controles, geeft aan dat de geteste kandidaatsequentie in staat was om de expressie van het gen te "verbeteren" (figuur 1). Dit eenvoudige ontwerp biedt een eenvoudige en duidelijke aanpak om een reeks te testen op versterkeractiviteit in vivo in de hersenen.

Naast het testen op het vermogen van een versterker van een sequentie, kan deze methode worden gecombineerd met technieken om de activiteit van het celtype versterker te bepalen. In sequentiegebaseerde benaderingen voor het bepalen van differentiële versterkeractiviteit, kan het sorteren van cellen op celtypespecifieke markers voorafgaand aan DNA- en RNA-sequencing onderzoekers in staat stellen om te bepalen of verschillende celtypen differentiële versterkeractiviteit vertonen, zoals werd beschreven in Gisselbrecht et al.11. In op beeldvorming gebaseerde benaderingen maakt co-labeling van afbeeldingen met celtypespecifieke markers het mogelijk om te onderzoeken of cellen met enhancer-gedreven fluorescentie ook celtypemarkers van belang weergeven 12,13,14,15,16. Enhancer reporter assays maken directe testen van risico-geassocieerde allelische variatie in versterkers mogelijk op effecten op het vermogen van enhancers. De overgrote meerderheid van de risicoloci die in genoombrede associatiestudies (GWAS) zijn geïdentificeerd, ligt in niet-coderende regio's van het genoom17. Functionele annotatiestudies van deze risicoloci geven aan dat een groot deel waarschijnlijk fungeert als versterkers 18,19,20. MPRA-implementatie in vivo kan het testen van deze risico-geassocieerde varianten voor versterkeractiviteit in de hersenen mogelijk maken12,21. Tot slot kan levering en afhaling op verschillende tijdstippen inzicht bieden in de ontwikkelingsfasen waarin een versterker actief is.

Enhancer-reporter plasmide ontwerpen zijn divers en kunnen worden aangepast aan experimentele doelen. Er zijn verschillende opties voor minimale promotors die zijn gebruikt in versterkeronderzoek, zoals de humane β-globine minimale promotor22 en de muis Hsp68 minimal promoter23. Van deze promotors is bekend dat ze lage expressieniveaus stimuleren, tenzij ze worden gekoppeld aan een enhancer-element om ze te activeren. Constitutieve promotorelementen daarentegen stimuleren een sterke expressie van het transgen, nuttig voor positieve controle of om te testen op enhancer-functie tegen een achtergrond van robuuste expressie. Veel voorkomende keuzes voor constitutieve promotors zijn CAG, een hybride promotor afgeleid van de kip β-actine promotor en de cytomegalovirus onmiddellijk-vroege versterker24, of humaan EF1α25. Aangezien van versterkers bekend is dat ze bidirectioneel werken26, zijn de oriëntatie en locatie van de versterker ten opzichte van de minimale promotor flexibel (figuur 2A). Traditionele enhancer-reporter assays plaatsen de enhancer stroomopwaarts van de promotor en omvatten in bibliotheekleveringen een barcodesequentie stroomafwaarts van het reporter-gen om sequencing reads te associëren met de geteste enhancer27. Versterkers kunnen echter ook in het open leesframe van het reporter-gen worden geplaatst en dienen als hun eigen barcodesequentie, zoals wordt gedaan in STARR-seq28. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van het STARR-seq-testontwerp, waarbij de kandidaat-enhancersequentie in de 3 'UTR van het reporter-gen wordt geplaatst. Hoewel de STARR-seq-oriëntatie het voordeel biedt van meer gestroomlijnd klonen, is het minder goed begrepen dan de conventionele benadering en kan het variabele RNA-stabiliteit tussen constructen induceren. De beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan de STARR-seq of conventionele oriëntatie met kleine wijzigingen in het kloonproces die elders zijn beschreven27,29.

Verschillende methoden voor AAV-levering kunnen worden gebruikt om deze techniek verder aan te passen aan experimentele doelen (figuur 2B). Directe intracraniale injecties, verder beschreven in dit protocol, leveren een hoge concentratie virus rechtstreeks aan de hersenen30. Dit geeft een hoge transductie-efficiëntie gecentreerd op de injectieplaats, waardoor dit een uitstekende techniek is voor experimenten die de dichtheid van getransduceerde cellen over een weefselgebied willen maximaliseren. Stereotactische injectie kan helpen bij het standaardiseren van de injectieplaats bij dieren voor reproduceerbare gelokaliseerde transductie. Intracraniale injecties zijn het eenvoudigst bij vroege postnatale dieren. Als alternatieve techniek kunnen systemische injecties transgenen afleveren met behulp van AAV's met serotypen die de bloed-hersenbarrière kunnen passeren31. Staartaderinjecties laten het virus door het lichaam circuleren, waardoor gegeneraliseerde afgifte over veel weefsels mogelijk wordt10. Retro-orbitale injecties zijn een andere systemische injectietechniek die het virus achter het oog afgeeft in de retro-orbitale sinus32. Dit biedt een directere route voor de AAV van het veneuze systeem naar de hersenen, wat resulteert in een hogere concentratie van getransduceerde cellen in de hersenen dan injecties in meer perifere bloedvaten33.

Een ander flexibel aspect van deze techniek is de methode van uitlezing. In grote lijnen kunnen opties worden beschreven als reporter-based of sequencing-based (figuur 2C). Het opnemen van een fluorescerende reporter zoals GFP in het open leesframe van het construct resulteert in de expressie van het fluorescerende eiwit in alle getransduceerde cellen waar de kandidaat-versterker expressie aandreef. Etiketterings- en beeldvormingstechnieken zoals immunohistochemie maken signaalversterking mogelijk. Sequencing-gebaseerde uitleestechnieken omvatten het identificeren van sequenties van het geleverde construct in RNA verzameld uit het weefsel. Door de hoeveelheid viraal DNA te kwantificeren die aanvankelijk werd afgeleverd, kan de vergelijking van uitgedrukt RNA versus afgeleverd DNA worden gebruikt om de mate te bepalen waarin een geteste versterkersequentie in staat was om verhoogde expressie van het transgen te stimuleren, bijvoorbeeld in de context van een massaal parallelle reporter assay (MPRA). MPRA's bieden een krachtige uitbreiding van deze technieken om tot duizenden kandidaat-versterkers tegelijkertijd op activiteit te testen en zijn uitgebreid beschreven in genomics-onderzoek 12,27,34,35,36. Screening met een hogere doorvoer wordt bereikt door het uitvoeren van kloon-, verpakkings-, leverings- en sequencingstappen voor kandidaat-versterkers in batch in plaats van individueel.

De selectie van kandidatenversterkers biedt een andere mogelijkheid voor flexibiliteit (figuur 2D). Deze test kan bijvoorbeeld worden gebruikt om versterkers van een specifiek gen te identificeren, om de functie van niet-coderende DNA-regio's van belang vast te stellen, of om specifieke celtypen of ontwikkelingsstadia te bepalen waarin een versterker actief is - die allemaal doelen dienen, zowel in de basiswetenschap als in ziekteonderzoek. Over het algemeen wordt de selectie van kandidaat-versterkers aangedreven door in silico-voorspellingen van versterkeractiviteit. Gewoonlijk omvatten in silico-voorspellingen ChIP-seq voor histonmodificaties die wijzen op waarschijnlijke versterkers, zoals H3K27ac37 en chromatine accessibility mapping38. Ten slotte is een groeiend onderzoeksgebied de functiegebaseerde screening van synthetisch ontworpen enhancer-elementen, waardoor studies mogelijk worden gemaakt van hoe enhancer-sequentie functie39 stuurt en het ontwerp van enhancers met specifieke eigenschappen40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is goedgekeurd door de UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #22339) en de UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Dit protocol is getest op C57BL/6J muizen van beide geslachten op postnatale dag 0-1.

1. Kloon de enhancer kandidaat-sequentie in het AAV-vectorplasmide.

OPMERKING: De representatieve protocollen worden gegeven, maar de kloonstrategie heeft een hoge mate van flexibiliteit.

  1. Selecteer of ontwerp een reporterconstructie. Hier wordt de enhancer-kandidaat ingebracht in het 3'-onvertaalde gebied (UTR) van het EGFP-reportergen, dat tot expressie wordt gebracht onder controle van de minimale Hsp68-promotor.
    OPMERKING: Veel MPRA-plasmideconstructies die geschikt zijn voor deze test zijn gedeponeerd bij Addgene41 en zijn beschikbaar voor onderzoeksgebruik.
  2. Ontwerp PCR-primers om een reeks interessanten te versterken. Voeg aan het 5'-uiteinde van de primers de juiste homologiearm toe voor Gibson-klonen (~ 35 bp overeenkomend met reeks 5 ' stroomopwaarts van de inbrenglocatie, bovenste streng voor de voorwaartse primer en onderste streng voor de omgekeerde primer).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de basisprimersequentie ~ 18-24 bp lang en ~ 50% -60% GC-gehalte is met een smelttemperatuur van ongeveer 57-59 °C.
  3. Voer PCR uit van een DNA-monster met behulp van de ontworpen primers.
    1. Monteer het PCR-reactiemengsel in PCR-buizen van 0,2 ml zoals beschreven in tabel 1.
    2. Plaats de PCR-reactiemix(en) op een thermische cycler en cyclus volgens het in tabel 1 vermelde programma.
    3. Bevestig het succes van PCR door 5 μL PCR-product uit te voeren op een 0,7% -1% agarose-gel bij 100 V gedurende 30-60 minuten. Controleer op het fragment van de voorspelde lengte.
    4. Opschonen van het PCR-product met behulp van een commerciële enzymatische reactieopruimingskolomkit. Het laatste eluaat is de klooninzet.
  4. Voer restrictievergisting uit om de AAV-vector op de unieke kloonlocatie te lineariseren om de enhancer in de vector in te voegen.
    1. De kloonlocatie in de 3'-UTR van de enhancer reporter-constructie die hier wordt gebruikt, wordt begrensd door unieke PacI- en AscI-beperkingssites. Voer een digest uit om het plasmide op deze locatie te lineariseren volgens de volgende parameters (stappen 1.4.2-1.4.4).
    2. Verteren 1-10 μg vector-DNA met PacI en AscI, afhankelijk van hoeveel kloonreacties nodig zijn. Bereid de reacties voor met behulp van de meegeleverde buffer volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 uur om het vector-DNA te verteren. (Bij het verteren van meer dan 5 μg in een reactie van 50 μL kan een langere incubatie nodig zijn.)
    4. Inactiveer na 1-2 uur incubatie het enzym door gedurende 20 minuten bij 65 °C te broeden.
    5. Scheid de restrictie verteer fragmenten door gel-elektroforese met behulp van een 0,7% -1% agarose-gel, loop op 100 V gedurende 30-60 minuten.
    6. Snijd de band voor de gelineariseerde vector en zuiver met behulp van een commerciële gelextractiekit.
  5. Voer Gibson-kloonreacties uit en transformeer
    1. Bepaal de concentratie van de gezuiverde vector en het kloonelement met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: DNA absorbeert licht bij 260 nm, terwijl verontreinigingen licht absorberen bij 230 nm en 280 nm. Hoge verhoudingen (>1,8) van 260/230 en 260/280 duiden op sterk gezuiverd DNA.
    2. Verzamel Gibson kloonreacties in 0,2 ml PCR-buizen: 5 μL 2x Gibson master mix, 0,02-0,5 pmol DNA-fragmenten in een verhouding van 3:1 insert tot vector (optimale DNA-concentratie voor de reactie moet empirisch worden bepaald) en Nuclease-vrij water (breng het volume op tot 10 μL).
    3. Incubeer Gibson reacties bij 50 °C gedurende 20 minuten in een thermische cycler.
  6. Transform recombinatie deficiënt (recA-) competente Escherichia coli (E. coli).
    1. Zet een waterbad op 42 °C en ontdooi de in de handel verkrijgbare competente cellen op ijs.
      OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd voorafgaand aan stap 1.4 en de cellen kunnen ontdooien tijdens het voorbereiden en incuberen van de Gibson-reactie.
    2. Aliquot 30-50 μL cellen in 2,0 ml microcentrifugebuizen. Voeg 2 μL Gibson reactie toe aan een aliquot en label de tube met de identiteit van de Gibson. Incubeer de cellen op ijs gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Gebruik 5-10 ng onverteerde lege vector als een positieve controle en water als een negatieve controle.
    3. Schok de cellen in het waterbad van 42 °C gedurende 30-45 s, breng de buizen onmiddellijk terug naar ijs en laat ze gedurende 5 minuten herstellen.
    4. Voeg op ijs 400-950 μL van de in de handel verkrijgbare herstelmedia toe.
      OPMERKING: De herstelmedia die in deze experimenten worden gebruikt, bevatten 2% plantaardig pepton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 en 20 mM glucose.
    5. Herstel op ijs, herstel de cellen volledig door te broeden bij 37 °C met zachte agitatie van 250 RPM gedurende 30-60 min.
    6. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder 400 μL van het supernatant, waardoor ~ 50 μL bacteriën op plaat blijven.
    7. Plaat op selectieve media en incubeer bij 37 °C 's nachts.
      OPMERKING: De selectieve media die in deze experimenten worden gebruikt, bevatten 1,0% trypton, 0,5% gistextract, 1,0% natriumchloride, 1-2% agar, 96-97% water en carbenicilline in een concentratie van 100 μg / ml. Gebruik altijd recombinatiedeficiënte bacteriestammen voor het klonen van virale plasmiden omdat de virale omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) overeenkomende sequenties hebben en homologe recombinatie kunnen ondergaan. RecA-bacteriestammen ondergaan echter nog steeds lage niveaus van recombinatie. Het hier gebruikte reporterplasmide is een zelfcomplementariërende AAV, waarbij de volgorde van een van de ITR's is gewijzigd en niet meer perfect overeenkomt met de andere ITR. Het kweken van de bacteriën bij 30 °C wordt ook aanbevolen om de snelheid van homologe recombinatie verder te vertragen.
  7. Controleer klonen en herstel plasmiden.
    1. Bereid een PCR-mastermix voor met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers (tabel met materialen) die gloeien naar de vector en de insertlocatie flankeren. Aliquot 10 μL volumes in 0,2 ml PCR stripbuizen.
    2. Bereid in 14 ml buizen met ronde bodem 5 ml aliquots van antibioticaselectieve LB-bouillon, één voor elke kolonie die wordt getest via PCR en negatieve controle.
    3. Gebruik een steriele tandenstoker of pipetpunt om een individuele kolonie te kiezen en schraap de kolonie ruwweg naar beneden in de bodem van een PCR-buis.
    4. Wanneer de kolonie is gedissocieerd in de PCR-mastermix, laat u de tandenstoker of punt in een van de LB-aliquots vallen en labelt u de 14 ml-buis met de Gibson-reactie en het PCR-buisnummer.
    5. Plaats de pcr-reacties van de kolonie op een thermische cycler en cyclus met het programma beschreven in tabel 2.
    6. Incubeer de vloeistofculturen van 5 ml die zijn ingeënt met tandenstokers of pipetpunten in een schudincubator op 37 °C en 180 RPM.
    7. Voer de kolonie PCR-reacties uit op een 0,7% -1% agarose-gel bij 100 V gedurende 30-60 minuten en visualiseer de banden in een gel doc-beeldvormingssysteem.
    8. Gooi de culturen van 5 ml weg die niet de voorspelde PCR-band weergeven.
    9. Voor elke succesvol geïntegreerde kloon, laat de 5 ml culturen 's nachts groeien en voer vervolgens een plasmide minivoorbereiding uit van 4,5 ml met behulp van een commerciële kit. Reserveer 0,5 ml van de vloeibare cultuur en bewaar bij -80 °C als glycerolbouillon.
    10. Controleer of de transgenen in de plasmiden vrij zijn van ongewenste mutaties met behulp van Sanger-sequencing42.
    11. Nadat is bevestigd dat de reporterconstructie met succes is gekloond, gebruikt u de opgeslagen glycerolvoorraad om een startercultuur van 5 ml in te enten en te groeien gedurende 8-16 uur in een schudincubator bij 30 ° C en 180 RPM.
    12. Zodra de bouillon troebel is, verdunt u de startercultuur 1.000x in 250-300 ml verse selectieve LB-bouillon en incubeert u minstens een nacht in een schudincubator bij 30 °C en 180 RPM. Zuiver vervolgens het plasmide met behulp van een commerciële plasmide maxi-kit.
      OPMERKING: Bacteriën groeien langzamer bij 30 °C in vergelijking met 37 °C, maar dit is de beste temperatuur om de snelheid van spontane recombinatie bij het kweken van grote culturen te vertragen.
    13. Voer een XmaI-samenvatting uit om te testen op recombinatie van de ITR's met behulp van stappen 1.4.2-1.4.5, waarbij XmaI wordt vervangen in plaats van PacI en AscI. Visualiseer de banden op een gel doc imaging systeem.
      OPMERKING: Een rAAV-plasmide met beide ITR's aanwezig zal twee banden op een gel opleveren na deze digest: één de lengte van het rAAV-genoom en de andere de lengte van de rest van de plasmide-ruggengraat. Als er slechts één band is, hebben de ITR's homologe recombinatie ondergaan en kan het rAAV-plasmide geen virale deeltjes verpakken. De hier beschreven rAAV plasmide-backbone is zo ontworpen dat XmaI-sites alleen in de ITR's voorkomen. Als de enhancer candidate insert ook XmaI-sites bevat, werkt u de voorspelde bandresultaten en analyse dienovereenkomstig bij.

2. Verkrijg verpakte rAAV.

  1. Gebruik verpakte rAAV (professioneel of intern) voor de experimenten in deze studie.
    LET OP: Er zijn veel opties voor het verpakken van een rAAV. Een rAAV kan professioneel worden verpakt bij een bedrijf of een universitaire kernfaciliteit. De rAAV kan ook intern worden verpakt met behulp van verschillende technieken die variëren in complexiteit en behoefte aan gespecialiseerde apparatuur43,44. De primaire zorg is het verkrijgen van een vector van hoge kwaliteit en dat de infectieuze titer met een hoge mate van zekerheid is bepaald. Zowel professioneel verpakte als in-house verpakte rAAVs werden gebruikt voor verschillende experimenten die in deze studie werden beschreven.

3. Injecteer rAAV-verpakt plasmide in neonatale muizen.

  1. Bereid het rAAV-mengsel voor op levering.
    1. Als het de bedoeling is om de expressiepatronen tussen verschillende enhancer reporter-virussen te vergelijken, egaliseer dan de titers van alle virussen die moeten worden vergeleken door ze allemaal te verdunnen om overeen te komen met het minst geconcentreerde virus.
    2. Meng een verhouding van 2:1 of 3:1 van enhancer reporter virus en constitutief tot expressie gebracht controle reporter virus en voeg een kleine hoeveelheid (0,06% eindconcentratie) Fast Green kleurstof toe.
      OPMERKING: Fast Green is een kleurstof die veel wordt gebruikt bij injecties van proefdieren, inclusief met AAV, om de injectieplaats tijdens en onmiddellijk na de procedure te visualiseren 45,46,47,48. Hoewel dit een belangrijke stap in de kwaliteitsborging is, is het mogelijk dat de toevoeging van kleurstof de transductie kan verstoren. Het heroverwegen van het gebruik van injectiekleurstof kan in bepaalde gevallen belangrijk zijn voor protocoloptimalisatie. Het constitutief gedreven controlevirus is absoluut cruciaal voor het vergelijken van onafhankelijke injecties. Virusinjecties variëren in locatie en mate van transductie van dier tot dier. De constitutieve controle zal het mogelijk maken om mislukte injecties uit te sluiten van analyse en een standaard te bieden voor normalisatie van variatie in virusafgifte.
    3. Breek de punt van een steriele getrokken glazen pipet gemaakt van een μL-gegradueerde capillaire buis door deze voorzichtig door een delicaat doekje te prikken dat is gesteriliseerd door het in 70% ethanol te weken en volledig te laten drogen. Steek vervolgens de getrokken glazen pipet in de aspiratorassemblage bestaande uit een apparaat voor het uitoefenen van druk verbonden met 15-inch lange rubberen buizen die eindigen met een rubberen pakking voor het vasthouden van een micro-capillaire pipet.
      OPMERKING: Het "apparaat voor het uitoefenen van druk" kan een spuit of een mondstuk zijn. Als een spuit moet worden gebruikt, moet een tweede persoon druk uitoefenen door de spuit, terwijl de experimentator de pipet in de ene hand en het dier in de andere hand manipuleert. Bij gebruik van een mondstuk, waardoor de experimentator de positie van het dier en de pipet en de druk op de spuit nauwkeurig kan controleren, is extra zorg vereist om virusbesmetting te voorkomen.
    4. Oefen negatieve druk uit door de aspiratorassemblage om een klein volume (~ 0,2-0,5 μL) minerale olie in de glazen pipet te trekken.
      OPMERKING: Deze stap is erg belangrijk om een barrière te bieden om te voorkomen dat vernevelde virale deeltjes de aspiratorassemblage besmetten.
    5. Zet de voorbereide aspiratorassemblage opzij en bewaar het virus op ijs totdat het klaar is om te injecteren.
  2. Cryo-anesthetine de neonatale muizen in een droge plastic schaal gedeeltelijk ondergedompeld in ijs tot het stoppen van de pedaalonttrekkingsreflex (~ 5 min). Zorg ervoor dat de muizen niet in direct contact staan met het ijs.
  3. Gebruik negatieve druk door de aspiratorassemblage om het virusmengsel in de getrokken glazen pipet te trekken totdat de meniscus het vinkje van 2 μL passeert.
  4. Verwijder de muis uit de koude kamer en plaats hem op de bank. Lokaliseer de bilaterale injectieplaatsen halverwege tussen lambda en bregma en halverwege tussen de sagittale hechting en elk oog. Ontsmet beide gebieden met een alcoholdoekje.
  5. Gebruik de getrokken glazen pipet om de schedel van de neonatale muizen te doorboren en oefen voorzichtig positieve druk uit door de aspiratorassemblage als de naald de hersenen binnendringt. Let op de meniscus van het virusmengsel. De weerstand tegen de uitgeoefende druk zal afnemen wanneer de punt van de pipet de laterale ventrikel bereikt. Doseer 1 μL van het virus, trek de pipet op en herhaal dit voor de andere laterale ventrikel.
  6. Plaats de muis op een verwarmingskussen of een verwarmingskamer om te herstellen. Eenmaal wakker en actief, breng het dier terug naar zijn thuiskooi.

4. Verzamel weefsel en voer immunohistochemie uit.

  1. Na voldoende tijd na virustransductie, verdoof de muizen en offer door transcardiële perfusie.
    OPMERKING: Veel experimenten, inclusief de representatieve resultaten die hier worden weergegeven, laten een periode van 4 weken of langer toe voordat het virus transduceert. Zelfcomplementerende AAV's kunnen echter al na 7 dagen12 een sterke expressie vertonen. De gewenste incubatietijd moet mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van specifieke experimentele technieken en doelen.
    1. Bereid een peristaltische pomp met intraveneuze infusieslang en een naald van 25 G.
    2. Bereid 1x PBS en 4% paraformaldehyde (PFA) en leg ze op ijs.
    3. Plaats het inlaatuiteinde van de slang in de ijskoude 1x PBS. Stel het debiet in (2,5 ml / min voor P7-muizen, 3,5 ml / min voor P28-muizen) en laat de pomp draaien totdat de buffer helemaal door de slang is getrokken en is ontdaan van bubbels. Zet de naald opzij tot hij klaar is voor perfusie.
    4. Pipetteer in een zuurkast een klein volume isofluraan op een papieren handdoek op de bodem van een druppelpotkamer. Plaats de eerder geïnjecteerde muis op een rooster boven het keukenpapier en zorg ervoor dat deze niet in direct contact komt met het isofluraan. Sluit de kamer af om de muis te verdoven. Wacht ~ 5 minuten en open dan de kamer en controleer op een pedaalonttrekkingsreflex. Ga verder zodra het dier bewusteloos is.
      OPMERKING: Gedurende de perfusie moet de muis op isofluraan worden gehouden met een neuskegel om te voorkomen dat het weer bij bewustzijn komt.
    5. Gebruik een chirurgische schaar om de buik en borst van de muis te openen, verwijder de ribbenkast en stel het hart bloot.
    6. Gebruik een irismicroschaar om een kleine incisie te maken in het rechteratrium van de muis, steek de infuusnaald in de linker ventrikel en activeer de peristaltische pomp.
    7. Perfuseer het dier met ijskoude 1x PBS totdat het bloed dat uit de incisie in het rechter atrium spoelt helder is. Het opruimen van het bloedweefsel is erg belangrijk omdat rode bloedcellen autofluorescentie hebben en bloedvaten het vermogen om reporter-expresserende cellen in beeld te brengen kunnen verminderen.
    8. Pauzeer de peristaltische pomp en verplaats de inlaatbuis van de PBS naar de 4% PFA. Activeer de pomp opnieuw en perfuseer 1 ml / g lichaamsgewicht, ~ 25 ml voor een volwassen muis.
      OPMERKING: Fixatietremoren moeten waarneembaar zijn en het lichaam van de muis moet verstijven.
  2. Ontleed en post-fixeer de hersenen.
    1. Verwijder het hoofd van de muis met een chirurgische schaar.
    2. Begin met behulp van een kleine chirurgische schaar bij de basis van de schedel en maak een incisie langs de middellijn van het hoofd en trek de huid en het onderliggende weefsel terug om de schedel bloot te leggen.
    3. Knip met behulp van een irisschaar zorgvuldig de achterkant van de schedel af, beginnend bij het foramen magnum en doorgaand naar en langs de sagittale hechting totdat de olfactorische bollen zijn gepasseerd.
    4. Steek de schaar in de schedel over de olfactorische bollen en maak twee horizontale sneden in de schedel. Maak een vergelijkbaar paar horizontale sneden in het achterhoofdsbeen. De horizontale en middellijnsneden creëren een paar deurachtige flappen in de bovenkant van de schedel.
    5. Pel de flappen van de schedel af om de hersenen volledig bloot te leggen. Gebruik een pincet om de olfactorische bollen van de schedel te snijden en de hersenzenuwen te snijden, waardoor de hersenen van de schedel worden bevrijd.
    6. Laat de hersenen in een conische buis van 15 ml vallen met 3-5 ml 4% PFA bij PBS. Post-fix 6 uur tot overnachting. Fixeer het weefsel niet te veel.
  3. Bereid de hersenen voor op cryosectie.
    1. Breng de vaste hersenen over naar een nieuwe conische buis van 15 ml met 12-14 ml sucrose in PBS voor uitdroging. Incubeer bij 4 °C totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken (2-3 dagen).
    2. Dompel de vaste en gedehydrateerde hersenen onder in een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding in een 15 mm x 15 mm x 5 mm cryomold. Voeg OCT toe totdat de hersenen volledig bedekt zijn.
    3. Plaats cryomold op een blok droogijs en vries het monster in een vast blok OCT (~ 5 min).
      OPMERKING: OCT-blokken kunnen maanden tot jaren bij -80 °C worden bewaard.
    4. Label de cryomold met de monsternaam en de oriëntatie van de hersenen.
  4. Verkrijg coronale secties met behulp van een cryostaatmicrotoom.
    1. Markeer de oriëntatie van de hersenen op het OCT-blok met potlood en verwijder het blok uit de cryomold in de cryostaat.
    2. Plaats het OCT-blok zo dat de hersenen georiënteerd zijn met de olfactorische bollen naar het blad van de cryostaat en hecht het blok aan de objecthouder van de cryostaat met wat verse OCT.
    3. Eenmaal bevroren op zijn plaats, begint u met het snijden van 50 μm secties door het blok volgens de stappen 4.4.4-4.4.6.
    4. Gebruik de antirolplaat niet. Secties krullen in strakke rollen terwijl ze worden gesneden en verzamelen zich bovenop het blok of vallen eronder in een verzamelbak.
    5. Let op de vorm van het blok in de eerste paar sneden die worden gemaakt. Maak verticale sneden door het blok en produceer een gelijkmatig gezicht wanneer u begint te snijden. Pas de hoek indien nodig aan met behulp van de monsterverstellingsarmen.
    6. Wanneer de olfactorische bollen zichtbaar zijn, let dan goed op de vorm van de secties. Als de ene groter lijkt dan de andere, bevinden de sneden zich in een hoek ten opzichte van de hersenen en is het noodzakelijk om de oriëntatie van de hersenen tegen het mes recht te trekken met behulp van de monsteraanpassingsarmen.
      OPMERKING: Als u recht snijdt, moet de cortex tegelijkertijd boven elke olfactorische bol verschijnen.
    7. Zodra de olfactorische bol is doorsneden en rostral hersenweefsel zichtbaar is, vermindert u de snijdikte tot 30-35 μm en begint u de zwevende secties te verzamelen. Volg de stappen 4.4.8-4.4.13 voor het doorsnijden van de hersenen.
    8. Borstel alle voorgaande secties van het blok en de objecthouder af zodat ze in de verzamellade vallen. Borstel ze naar één kant van de lade en houd ze gescheiden. Als de stapel te groot is, maak dan de lade leeg.
    9. Doseer 1 ml PBS in elke put van een 24 putplaat. Label 1 rij voor elk brein.
    10. Knip 6 coronale secties. Haal de secties op met een koud pincet en rangschik ze op het cryostaatstadium. Herhaal deze stap 2 of 3 keer en houd de groepen van 6 secties gescheiden.
    11. Maak een penseel van maat 000 nat met PBS en dep overtollige vloeistof weg op een pluisvrije tissue of papieren handdoek. Gebruik het penseel om voorzichtig elke sectie op te pakken, één voor één, en plaats deze in de juiste putten van de 24 putplaat.
    12. Plaats een van de 6 secties uit de groep plakjes in elk van de 6 putten in een rij van de 24 putplaat. Dit zorgt ervoor dat elke put representatieve secties bevat die het doorsneden gebied van de hersenen overspannen.
    13. Ga door met sectieren in groepen van 6 totdat het caudale uiteinde van de hersenschors is doorsneden.
    14. Voor opslag, sluit de 24 putplaat af met parafilm en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: Secties zijn stabiel gedurende 1-2 maanden bij 4 °C. Een PBS-oplossing met 0,1% natriumazide kan worden gebruikt om de bacteriegroei te remmen en de houdbaarheid van de secties te verlengen. Als de secties echter langer dan 2 maanden moeten worden bewaard, moeten ze in een cryoprotectieve oplossing worden geplaatst en bij -20 °C worden ingevroren voor het beste resultaat.
  5. Voer immunohistochemie uit voor amplificatie van het reporter-gensignaal.
    OPMERKING: Alle stappen behalve het ophalen van antigeen moeten worden uitgevoerd met behulp van zachte tot matige agitatie (~ 100 RPM) op een orbitale shaker. Om de native fluorescentie van de controlemelder (mRuby3) te behouden, moeten alle stappen zoveel mogelijk tegen licht worden beschermd.
    1. Bereid de nodige buffers voor zoals beschreven in tabel 3.
    2. Bereid een nieuwe 24-putplaat voor met één rij voor elk brein dat wordt gekleurd. Voeg in de eerste kolom van putten 1 ml PBS toe aan elke put.
    3. Breng met een penseel van maat 000 voorzichtig 1 put van secties uit de oorspronkelijke collectieput over naar de verse PBS in de nieuwe 24 putplaat voor een snelle spoeling om resterende OCT-verbinding te verwijderen.
    4. Voeg 1 ml ARB toe aan de volgende put in de 24 putplaat en breng secties over naar deze put. Incubeer in een oven bij 60 °C gedurende 1 uur.
    5. Laat de plaat 20 min afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
    6. Voeg 1 ml PB toe aan de volgende put en breng de secties over naar deze put. Incubeer bij RT gedurende 20 min.
    7. Voeg 500 μL BB toe aan de volgende put en breng de secties over naar deze put. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
    8. Voeg 2 ml WB toe aan de BB en pipetteer vervolgens ~ 2 ml oplossing en gooi weg, waarbij een verdunde BB-oplossing in de put achterblijft. Herhaal dit totdat de secties duidelijk zichtbaar zijn.
    9. Verdun het primaire antilichaam (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) in BB. Voeg 350-500 μL primaire antilichaamoplossing toe aan de volgende put en breng de secties over naar deze put. Sluit de plaat af met parafilm en incubeer een nacht bij 4 °C.
    10. Verdun BB met WB zoals eerder gedaan totdat de secties duidelijk zichtbaar zijn.
    11. Voeg 1 ml WB toe aan de volgende put en breng de secties over naar deze put. Incubeer bij RT gedurende 20 min.
    12. Verwijder ~800-900 μL buffer en gooi weg. Voeg 1 ml verse WB toe en incubeer 20 min. Vervang nog 4 keer 1 ml WB voor een totaal van 5 wasbeurten, elk 20 minuten.
    13. Verdun het secundaire antilichaam (Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 geconjugeerd, 1:500) in BB. Voeg 350-500 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan een nieuwe put. Incubeer bij RT gedurende 45 min tot 1 uur.
      OPMERKING: Dit is de zevende put, dus als kleuringssecties van meer dan 2 hersenen worden gebruikt, is er op dit moment een nieuwe plaat nodig.
    14. Verdun BB met WB zoals voorheen en breng de secties over naar een nieuwe put gevuld met 1 ml WB. Was de secties zoals eerder gedaan gedurende 20 minuten 3 keer.
    15. Bereid een werkoplossing van DAPI in PBS (eindconcentratie 0,04-0,8 μg/ml). Bescherm de oplossing tegen licht.
    16. Voeg 1 ml DAPI-oplossing toe aan de volgende put en breng de secties over naar deze put. Incubeer bij RT gedurende ~5 min.
    17. Breng de secties terug naar WB en monteer voorzichtig op microscoopglaasjes met een penseel van maat 000. Laat de dia's aan de lucht drogen.
    18. Breng coverslips aan met een geschikt montagemedium. Laat dia's 's nachts in het donker uitharden bij RT.

5. Beeld en analyseer hersenweefselsecties voor versterkeractiviteit.

  1. Gebruik een objectieflens met een lage vergroting (5x) om fluorescentiebeelden op te nemen die het hersengedeelte omspannen.
  2. Lokaliseer de injectieplaats en evalueer de mate van de virustransductie op basis van de dichtheid en intensiteit van rode fluorescerende cellen. Zorg ervoor dat u dieren vergelijkt die op dezelfde manier zijn overgeheveld.
  3. Neem indien gewenst gedetailleerde fluorescerende beelden op met een lens met een hogere vergrotingshoek (≥25x).
    OPMERKING: Zorg er altijd voor dat u dezelfde instellingen gebruikt voor acquisitieparameters zoals excitatielichtintensiteit, filters en belichtingstijd tussen monsters die moeten worden vergeleken.
  4. Verwerk de beelden met behulp van beeldanalysesoftware.
    OPMERKING: Verwerking kan worden uitgevoerd in elk softwarepakket voor beeldanalyse. De volgende stappen zijn suggesties om te bepalen of een reeks fungeert als een enhancer in de context van de reporterconstructie (een ja of nee-vraag) met behulp van de open-source FIJI-distributie van ImageJ. Meer diepgaande fotometrie kan geschikt zijn bij het vergelijken van de mate van activiteit tussen enhancer-varianten. Afbeeldingen van verschillende monsters moeten altijd consistent worden verwerkt om te worden vergeleken.
    1. Pas filters toe om ruis te verminderen. Selecteer in Fiji de optie Despeckle onder het menu Proces > Ruis .
      OPMERKING: Dit is een 3 x 3 mediaan filter.
    2. Trek achtergrondfluorescentie af volgens stappen 5.4.3-5.4.6.
    3. Scheid de kanalen van een meerkanaalsafbeelding. Selecteer in Fiji de optie Kanalen splitsen onder het menu Afbeelding > Kleur .
    4. Gebruik het gereedschap rechthoek of cirkelselectie om een kleine vorm te tekenen in een gebied van de afbeelding dat geen fluorescerende cellen heeft en meet de gemiddelde pixelintensiteit van de achtergrond met analyse > meten. Herhaal dit om meerdere gebieden te bemonsteren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat Gemiddelde grijswaarde is geselecteerd in het menu Analyseren > Metingen instellen .
    5. Gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde van 5-8 achtergrondgebieden en laat het decimale punt vallen. Trek deze waarde af van elke pixel in de afbeelding met Process > Math > Subtract.
      OPMERKING: Als u afrondt op het dichtstbijzijnde gehele getal, kan de achtergrond worden overschat om af te trekken. Het is conservatiever om simpelweg de komma te laten vallen. 6,4 zou bijvoorbeeld naar beneden worden afgerond op 6, maar 6,5 moet ook naar beneden worden afgerond op 6 om het risico te vermijden dat 0,5 eenheden echt signaal van elke pixel worden afgetrokken.
    6. Voeg desgewenst de kanalen weer samen tot een meerkanaalsafbeelding. Gebruik in Fiji Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen.
    7. Voeg overlappende afbeeldingen samen. Gebruik in Fiji Plug-ins > Stitching > Grid / Collection stitching.
    8. Pas de helderheid en het contrast aan. Gebruik in Fiji Afbeelding > helderheid/contrast aanpassen >.
      OPMERKING: Gebruik altijd dezelfde minimum- en maximumwaarden voor elke afbeelding die moet worden vergeleken.
    9. Tel het aantal groene fluorescerende cellen volgens de stappen 5.4.10-5.4.12. Dit zijn de cellen waarin de kandidaat-versterkersequentie in staat was om reporterexpressie te stimuleren.
    10. Begin met het verbergen van het groene kanaal en gebruik het vrije vormselectiegereedschap om een vorm rond het gebied van de hersenen te tekenen die rode fluorescentie uitdrukt. Met behulp van de functie Meten in Fiji meet u het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de gemiddelde grijswaarde van het rode kanaal in deze zone.
    11. Tel met het gereedschap voor het selecteren van meerdere punten het aantal groene cellen in deze zone.
    12. Normaliseer het aantal groene cellen door de geïntegreerde dichtheid van het rode kanaal. De helderheid van het lokale rode kanaal is een proxy-maat voor de omvang van de blootstelling aan virussen, waardoor de verbeteringsactiviteit tussen verschillende getransduceerde dieren kan worden vergeleken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze methoden werd een 915 bp-sequentie in het psychiatrische risico-geassocieerde derde intron van het gen CACNA1C 19,49,50 getest op versterkeractiviteit in de postnatale muizenhersenen. Deze sequentie werd ontdekt in een MPRA van 345 kandidaat-enhancersequenties gericht op psychiatrische en neurologische risico-SNP's12 en karakteriseringsexperimenten worden hier beschreven als e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een op rAAV gebaseerde methode voor de inzet van enhancer-gedreven transgenen in het postnatale muizenbrein. In dit gegeneraliseerde protocol worden een kandidaat-versterker, een minimale promotor, een reporter-gen en een optionele barcodesequentie gekloond in een AAV-plasmide-ruggengraat. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd met een enkele kandidaat-enhancersequentie of met veel sequenties parallel. Het plasmide wordt verpakt in een rAAV en afgeleverd bij de postnatale muizenhersenen. Na ee...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sequencing werd uitgevoerd in de UC Davis DNA Technologies Core. We bedanken het lab van Lin Tian bij UC Davis voor de training over rAAV-verpakkingen en het genereus schenken van AAV-helper en rep / cap-plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH/NIGMS R35GM119831.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Citraat BufferSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: Custom ontworpenVoorwaartse primer voor het verifiëren van klonen na transformatie. Deze primers zijn specifiek voor het gebruikte vector en zijn ontworpen voor de specifieke vector die in onze experimenten werd gebruikt.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: Custom ontworpenOmgekeerde primer voor het verifiëren van klonen na transformatie. Deze primers zijn specifiek voor het gebruikte vector en zijn ontworpen voor de specifieke vector die in onze experimenten werd gebruikt.
AgaroseVWRVWRVN605-500G
Aspiratorbuis assemblagesSigma-AldrichA5177-5EAvoor mondgedreven toediening van rAAV
Bacteriologische petrischalenThermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillineSigma-AldrichC1389-5G
Chicken IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Confocale microscoopZeissLSM900De afbeeldingen zijn gemaakt op het LSM800-model, maar Zeiss heeft de LSM900-model onlangs gelanceerd om LSM800 te vervangen.
Conische centrifugebuizen 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldenThermo Fisher ScientificNC9806558Deze mallen zijn geschikt voor P28 muisbrein. Andere maten kunnen geschikter zijn voor grotere of kleinere weefsels.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Dissectie schaar, 4.5"VWR82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge buizen 2.0 mLThermo Fisher Scientific22431048
Falcon rondbodembuizen 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Fast Green kleurstofGraingerF0099-1G
Set fijne detailverf kwastenArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Glas capillaire buizenDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Commerciële plasmide maxi prep kit
HyClone HyPure moleculaire biologie kwaliteit waterVWRSH30538.03
IV vlinder infuus set met 12" slang en 25G naaldThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Lintvrije doek
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB agar premix voor selectieve media
McPherson Vannas iris schaarIntegra LifeSciences360-215
MineralolieSigma Life Science69794-500ML
NEB Stable Competent E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Gel en PCR Clean-UpTakara740609.5Kit voor enzymatische reactie opruiming en gel extractie
OCT mediumVWR25608-930
Orbitaal shakerCole Parmer60-100
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
PCR stripbuizen 0.2 mLVWR490003-692
Peristaltische pompGilsonF155005
Fosfaat gebufferd zout (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF549L
Poeder melkSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106
rCutSmart BufferNEBB6004SBuffer voor restrictie digest met PacI, AscI en XmaI
Beperkingsenzym: AscINEBR0558L
Beperkingsenzym: PacINEBR0547L
Beperkingsenzym: XmaINEBR0180L
SOC uitgroei mediumNEBB0920SHerstel medium na transformatie
Sucrose (RNase/DNase vrij)Millipore Sigma033522.5KG
TAE bufferApex20-194
OverdrachtsslangGilsonF1179941Voor peristaltiek pomp
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemThermo Fisher ScientificA1460Plasmid mini prep kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020(2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479(2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956(2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014(2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384(2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279(2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877(2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56(2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56(2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270(2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628(2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298(2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061(2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380(2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243(2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888(2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles