Methodenartikel

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

DOI:

10.3791/62655

⸱

30 mei 2021

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van spectroscopische linialen om meerdere conformaties van enkele biomoleculen en hun dynamiek te volgen, heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van structurele dynamica en de bijdragen ervan aan de biologie. Terwijl de fret-gebaseerde liniaal rapporteert over inter-dye afstanden in het 3-10 nm bereik, rapporteren andere spectroscopische technieken, zoals eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering (PIFE), over de nabijheid tussen een kleurstof en een eiwitoppervlak in het kortere 0-3 nm bereik. Ongeacht de methode van keuze, haalt het gebruik ervan bij het meten van vrij verspreidende biomoleculen één voor één histogrammen van de experimentele parameter op die afzonderlijke centraal verdeelde subpopulaties van biomoleculen opleveren, waarbij elke subpopulatie ofwel een enkele conformatie vertegenwoordigt die onveranderd bleef binnen milliseconden, of meerdere conformaties die veel sneller interconverteren dan milliseconden, en dus een gemiddelde subpopulatie. In single-molecule FRET, waar de gerapporteerde parameter in histogrammen de inter-dye FRET-efficiëntie is, werd eerder gemeld dat een intrinsiek ongeordend eiwit, zoals het α-Synucleïne-monomeer in buffer, een enkele gemiddelde subpopulatie van meerdere conformaties vertoonde die snel interconverteerde. Hoewel deze eerdere bevindingen afhankelijk zijn van het 3-10 nm-bereik van de FRET-gebaseerde liniaal, probeerden we dit eiwit op de proef te stellen met behulp van PIFE met één molecuul, waarbij we de fluorescentielevensduur van site-specifieke sCy3-gelabelde α-Synucleïne-eiwitten één voor één volgen. Interessant is dat met behulp van deze spectroscopische nabijheidssensor met een korter bereik, sCy3-gelabelde α-Synuclein verschillende levenslange subpopulaties vertoont met duidelijk verschillende gemiddelde levens die interconverteren in 10-100 ms. Deze resultaten tonen aan dat hoewel α-Synuclein wereldwijd ongeordende organismen kan zijn, het toch stabiele lokale structuren bereikt. Samenvattend benadrukken we in dit werk het voordeel van het gebruik van verschillende spectroscopische nabijheidssensoren die lokale of wereldwijde structurele veranderingen één biomolecuul per keer volgen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen twee decennia zijn op fluorescentie gebaseerde methoden met één molecuul een krachtig hulpmiddel geworden voor het meten van biomoleculen1,2, waarbij wordt geprofiteerd hoe verschillende biomoleculaire parameters zich verdelen en hoe ze dynamisch interconverteren tussen verschillende subpopulaties van deze parameters met een resolutie van minder dan een milliseconde3,4,5. De parameters in deze technieken omvatten de energie-overdrachtsefficiëntie in FRET-metingen 6,7,fluorescentie-anisotropie8,9,fluorescentie-kwantumopbrengsten en levensduur10,11,als functie van verschillende fluorescentie-quenching12 of verbetering13-mechanismen. Een van deze mechanismen, beter bekend als eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering (PIFE)14 introduceert de verbetering van de kwantumopbrengst en levensduur van fluorescentie als een functie van sterische obstructie van de vrije isomerisatie van de fluorofoor in aangeslagen toestand, veroorzaakt door eiwitoppervlakken in de buurt van de kleurstof14,15,16,17,18,19 . Zowel FRET als PIFE worden beschouwd als spectroscopische linialen of nabijheidssensoren, omdat hun gemeten parameter direct is gekoppeld aan een ruimtelijke maat binnen het gelabelde biomolecuul dat wordt gemeten. Terwijl de FRET-efficiëntie gerelateerd is aan de afstand tussen een paar kleurstoffen binnen een bereik van 3-10 nm20,volgt PIFE toenames in fluorescentie kwantumopbrengsten of levensduur gerelateerd aan de afstand tussen de kleurstof en een oppervlak van een nabijgelegen eiwit in het bereik van 0-3 nm19.

Single-molecule FRET is op grote schaal gebruikt voor het verstrekken van structurele inzichten in veel verschillende eiwitsystemen, waaronder intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's)21, zoals α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kan geordende structuren vormen na binding aan verschillende biomoleculen en onder verschillende omstandigheden23,24,25,26,27,28,29,30. Wanneer echter niet gebonden, wordt het α-Syn-monomeer gekenmerkt door een hoge conformatie heterogeniteit met snel interconverterende conformaties31,32.

De conformaties van α-Syn zijn eerder bestudeerd met behulp van verschillende technieken die helpen bij het identificeren van conformatiedynamiek van dergelijke zeer heterogene en dynamische eiwitsystemen33,34,35,36,37,38,39. Interessant is dat single-molecule FRET (smFRET) metingen van α-Syn in buffer een enkele FRET-populatie rapporteerden39,40 die een uitkomst is van tijdgemiddelde van conformaties die dynamisch interconverteren op momenten veel sneller dan de typische diffusietijd van α-Syn door de confocale vlek (keer zo snel als enkele microseconden en zelfs sneller dan dat, ten opzichte van typische millisecondediffusietijden)40, 41. Het gebruik van een FRET-spectroscopische liniaal met de afstandsgevoeligheid van 3-10 nm rapporteert soms alleen over algemene structurele veranderingen in een klein eiwit zoals α-Syn. Metingen met één molecuul met behulp van spectroscopische nabijheidssensoren met kortere afstandsgevoeligheden hebben het potentieel om te rapporteren over de dynamiek van lokale structuren. Hierin voeren we single-molecule PIFE-metingen uit van α-Syn en identificeren we verschillende subpopulaties van fluorescentielevens die in kaart worden gebracht met verschillende lokale structuren met overgangen tussen hen zo langzaam als 100 ms. Dit werk vat tijd-opgeloste smPIFE-metingen samen van vrij diffuserende α-Syn-moleculen één voor één, in buffer en wanneer gebonden aan SDS-gebaseerde membranen als een spectroscopische nabijheidssensor met één molecuul op korte afstand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plasmide transformatie

  1. Bereiding van 0,5 L SOC-medium
    1. Weeg 10 g trypton, 2,5 g gistextract, 0,25 g natriumchloride (NaCl), 0,1 g kaliumchloride (KCl) af.
    2. Voeg dubbel gedestilleerd water (DDW) toe tot een totaal volume van 0,5 l.
    3. Stel in op pH 7 door natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen.
    4. Bereid bouillon aliquots van 100 ml en autoclaaf.
    5. Voeg voor gebruik 0,5 ml steriel magnesiumchloride (MgCl2) en 1,8 ml steriele glucose toe aan 100 ml SOC.
  2. Ontdooi BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellen op ijs.
  3. Meng de competente cellen voorzichtig.
  4. Bereid twee buizen van 15 ml voor. Label de ene als transformatiereactiebuis en de andere als de controlebuis.
  5. Aliquot 100 μL competente cellen in de buizen.
  6. Voeg 1 μl plasmide in een concentratie van 0,1 ng/μL toe aan de transformatiereactiebuis.
  7. Verwarm SOC medium in 42 °C waterbad voor gebruik in stap 1.8.
  8. Warmtepuls de twee buizen in een waterbad van 42 °C gedurende een duur van 45 seconden. (Kritische stap!)
  9. Voeg 900 μL verwarmd SOC-medium toe aan elke buis.
  10. Incubeer de buizen bij 37 °C gedurende een duur van 45 minuten met schudden met een snelheid van 225 tpm.
  11. Verspreid 200 μL van de cellen met het getransformeerde plasmide op één LB (Luria-Bertani)-agarplaat met 100 μg/ml ampicilline, met behulp van een steriele celstrooier.
  12. Verdeel 200 μL van de cellen met het getransformeerde plasmide over één LB-agarplaat zonder ampicilline, met behulp van een steriele spreader (positieve controle).
  13. Verspreid 200 μL van de controlecellen (zonder plasmide) op één LB-agarplaat met 100 μg/ml ampicilline, met behulp van een steriele spreader(negatieve controle).
  14. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.

2. Eiwitbereiding

  1. Recombinante α-Synucleïne expressie en zuivering
    1. Kies een enkele kolonie en kweek in 100 ml geautoclaveerd LB (Luria-Bertani) vloeibaar medium met 100 μg / ml ampicilline bij 37 ° C (starter).
    2. Bereid vier erlenmeyers van 2 l, elk met 1 l geautoclaveerd LB-medium en 100 μg/ml ampicilline (grote inenting).
    3. Meet de optische dichtheid (OD bij λ = 600 nm) van de celoplossing. Wanneer de celdichtheid van de starter een ODλ = 600nm van 0,6-0,7 bereikt, voegt u 10 ml startoplossing toe per elk 1 l LB-medium dat in de vorige stap is bereid.
    4. Kweek de bacteriemedia in een incubator shaker bij 37 °C en een snelheid van 200 rpm.
    5. Wanneer de celdichtheid een ODλ=600nm van 0,6-0,8 bereikt, induceer dan eiwitexpressie door isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 1 L groeimedium toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM.
      OPMERKING: Los 0,96 g IPTG op in 4 ml DDW en voeg 1 ml van de resulterende IPTG-oplossing toe per elke 1 l bacteriegroei.
    6. Laat de cellen gedurende 4 uur groeien en verzamel ze door centrifugeren in buizen van 50 ml met een snelheid van 5.170 x g gedurende een duur van 8 minuten.
      OPMERKING: Gooi in elke ronde het supernatant weg, bewaar de pellet en vul opnieuw dezelfde buizen met bacteriegroei.
    7. Bewaar de bacteriële pellet in diepvriesopslag (bijv. -80 °C) voor de volgende dag.
    8. Bereid de volgende dag 200 ml lysisbuffer: 40% (w / v) sucrose en buffer A, waaronder 30 mM Tris-HCl, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 2 mM dithiothreitol (DTT) bij pH 8,0.
    9. Voeg 25 ml lysisbuffer toe aan elke buis met bacteriële pellet.
    10. Suspensie van de pellet opnieuw (gebruik steriele plastic Pasteur pipetten) in de Lysis-buffer (zie 2.1.8).
    11. Bereid steriele Erlenmeyer van 250 ml met een roermagneet op ijs.
    12. Voeg 5 ml lysisbuffer toe en breng de homogene opnieuw gesuspendeerde cellen erover over.
    13. Roer de cellen gedurende een duur van 20 minuten bij 200 rpm bij kamertemperatuur.
    14. Verdeel de oplossing in buizen van 50 ml en centrifugeer bij 4 °C gedurende 30 minuten met een snelheid van 17.400 x g.
    15. Gooi het supernatant weg.
    16. Bereid steriele Erlenmeyer van 250 ml met roermagneet op ijs.
    17. Voeg 15 ml oplosbuffer (90 ml gekoelde buffer A en 37 μL MgCl2 opgelost boven de oplosbaarheidsgrens en gefilterd) toe aan elke buis. Gebruik steriele plastic Pasteur pipetten en los de pellet op.
    18. Wanneer een deel van de oplossing homogeen wordt, verplaatst u het naar een geroerde Erlenmeyer op ijs.
    19. Bepaal het oplossingsvolume in de Erlenmeyer.
    20. Voeg 10 mg streptomycinesulfaat toe per elke 1 ml oplossing (voordat u toevoegt, los streptomycinesulfaat op in 2 ml buffer A).
      OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om het DNA en de ribosomen weg te verwijderen.
    21. Roer de oplossing gedurende een duur van 10-20 minuten bij kamertemperatuur.
    22. Verdeel de oplossing in buizen van 50 ml en centrifugeer bij 4 °C en met een snelheid van 20.700 x g gedurende 30 minuten.
    23. Verzamel het supernatant en gooi de pellet weg.
    24. Bereid een steriele Erlenmeyer van 250 ml op ijs met een roerder.
    25. Filtreer het supernatant met een spuitfilter van 0,22 μm in de schone Erlenmeyer.
    26. Bepaal het volume van de oplossing en weeg 0,3 g ammoniumsulfaat per 1 ml oplossing.
    27. Voeg geleidelijk het ammoniumsulfaat toe aan de geroerde oplossing.
      OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om eiwitten neer te slaan. Wanneer het ammoniumsulfaat de eiwitten bindt, wordt de oplossing verduisterd en wazig, wat verschijnt als witte kleur.
    28. Roer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    29. Verdeel de oplossing in buizen van 50 ml en centrifugeer bij 4 °C en met een snelheid van 20.700 g gedurende 30 minuten.
    30. Gooi het supernatant voorzichtig weg en bewaar de pellet.
    31. Los de pellet op met 20 ml buffer A.
    32. Breng alle oplossingen in één buis en meet vervolgens het UV-absorptiespectrum van de oplossing.
      OPMERKING: Als het spectrum een aggregatiehandtekening vertoont (absorptie boven een golflengte van 300 nm), gaat u verder met de volgende stap. Zo niet, sla dan de volgende stap over en ga naar stap 2.1.34.
      OPMERKING: De aggregatie-index (A.I.) berekend op basis van de UV-spectra als ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Gebruik 100 kDa cutoff centriprep tubes en centrifugeer met een snelheid van 3.590 x g bij 4 °C gedurende een duur van 15 minuten. Verzamel de vloeistof die door het filter is gegaan.
    34. Dialyseer de oplossing 's nachts bij 4 °C, tegen buffer A, met behulp van dialysezakken met een afsnijding van 3,5 kDa.
    35. Voer nog een dialyseronde uit voor een duur van ten minste 4 uur.
    36. Laad het gedialyseerde monster op een MonoQ-anionenuitwisselingskolom van 1 ml. Gebruik 30 mM Tris hydrochloride (Tris-HCl) buffer bij pH 7,5 als wasbuffer en 30 mM Tris-HCl buffer pH 7,5 met 500 mM NaCl als elutiebuffer.
    37. Injecteer het monster in de kolom. Was vervolgens met 20 kolomvolumes (cv's) van 0% elutiebuffer en 100% wasbuffer om de ongebonden eiwitten te verwijderen.
    38. Wassen met 7 cv's van 30% elutiebuffer.
    39. Eluteer het α-Syn-eiwitmonster met behulp van een gradiënt die verandert van 30% tot 100% elutiebuffer voor 30 cv's, bij een stroomsnelheid van 1,5 ml / min.
      OPMERKING: α-Syn elueert bij 46-66 cv's met geleidbaarheid 20-24 mS / cm, wat verwijst naar 38-50% elutiebuffer.
    40. Verzamel de fracties van de hoofdelutiepiek. Controleer de aanwezigheid van α-Syn door monsters te nemen in 15% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE), na kleuring met Coomassie Blue of Fast SeeBand kleuroplossing. Er wordt een band van 15 kDa verwacht.
    41. Verenig de relevante fracties en dialyseer ze 's nachts, tegen buffer A, met behulp van dialysezakken met een afsnijding van 3,5 kDa bij 4 °C.
    42. Bereid aliquoten van het eiwitmonster en bewaar ze bij -20 °C.
  2. Cy3-gelabeld α-Synucleïne
    1. Verminder het thiol van het cysteïneresidu in het α-Syn A56C-mutant door DTT toe te voegen aan een eindconcentratie van 2 mM gedurende een duur van 1 uur bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder DTT door twee dialyserondes uit te voeren met behulp van 3,5 kDa cutoff dialysezakken. Voor de eerste ronde dialyseer je tegen 30 mM Tris-HCl pH 8,0 en 2 mM EDTA. Voor de tweede ronde dialyseer je tegen 50 mM HEPES pH 7,2 en 2 mM EDTA.
    3. Verminder de cysteïneresiduen door Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP) toe te voegen aan het eiwitmonster, tot een eindconcentratie van 50 μM gedurende een duur van 30 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: TCEP is een niet-sululfhydrylverlagend middel, vandaar dat het de thiolgroepen beperkt houdt zonder te reageren met de kleurstof. We voegden 0,5 μL toe uit een voorraadoplossing van 1 M TCEP.
    4. Bereken de hoeveelheden eiwit die nodig zijn voor het uiteindelijke reactievolume van 1 ml.
      OPMERKING: Hier is een voorbeeld voor de berekening die we hebben gebruikt:
      20 μM eindeiwitconcentratie × 1 ml eindvolume = 56 μM initiële eiwitconcentratie × toe te voegen V-eiwit
    5. Bereken de hoeveelheid kleurstof die nodig is voor het uiteindelijke reactievolume van 1 ml. Kleurstofetikettering van een enkele cysteïne moet worden uitgevoerd met overtollige kleurstof, bij een kleurstof: eiwit molaire verhouding van ten minste 3: 1.
      OPMERKING: Een voorbeeld voor de berekening die we hebben gebruikt:
      60 μM eindkleurstofconcentratie × 1 ml eindvolume = 370 μM initiële kleurstofconcentratie × V-kleurstof toe te voegen
    6. Bereken de hoeveelheid buffer van het dialysaat die nodig is om het totale reactievolume aan te passen aan 1 ml.
      OPMERKING: Rekenvoorbeeld: 1 ml - (V berekend vanaf stap 2.2.4 + V berekend vanaf stap 2.2.5)
    7. Bereid de reactieflacon voor met een magneet bovenop een roerder.
    8. Voeg eerst de berekende hoeveelheid van het eiwit en de buffer toe. Voeg daarna de berekende hoeveelheid van de kleurstof (sulfo-Cy3 maleimide) toe.
    9. Houd de reactie bij kamertemperatuur in het donker gedurende een duur van 3-5 uur.
    10. Beëindig de reactie door 2 mM DTT toe te voegen en ga door voor een duur van 1 uur.
    11. Voer drie dialyserondes uit tegen buffer A, met behulp van dialysezakken met een afsnijding van 3,5 kDa om overtollige vrije kleurstof uit de oplossing te verwijderen.
    12. Plaats het monster in een kolom met maatuitsluiting om de gelabelde α-Syn verder te scheiden van de vrije kleurstof.
    13. Bepaal de concentratie van zuiver gelabeld α-Syn door de absorptie van de kleurstof te meten (absorptiecoëfficiënt voor sulfo-Cy3 is 162.000 M-1cm-1bij λ=548 nm).
    14. Concentreer indien nodig de pure gelabelde α-Syn-oplossing met behulp van een vacuümconcentrator (bijv. SpeedVac). Voer vervolgens een dialyseronde uit tegen buffer A, met behulp van dialysezakken met een afsnijding van 3,5 kDa en bepaal opnieuw de concentratie van het gelabelde eiwit.
    15. Bereid aliquoten van het gelabelde eiwitmonster en bewaar ze bij -20 °C.

3. Afmetingen

  1. smPIFE experimentele setup
    OPMERKING: Gebruik de volgende op confocale basis gebaseerde setup of iets dergelijks.
    1. Gebruik een gepulseerde laserbron (in ons geval λ = 532 nm picoseconde gepulseerde laser met een pulsbreedte van ~ 100 ps FWHM), werkend met een geschikte herhalingssnelheid (20 MHz in ons geval) en gerouteerd naar de SYNC van een tijdgecorreleerde single photon counting (TCSPC) -kaart, als de bron van sulfo-Cy3 (sCy3) excitatie.
    2. Gebruik een dichroïsche spiegel met een hoge reflectiviteit bij 532 nm om excitatie en verstrooiing van fluorescentie te scheiden.
    3. Gebruik een gaatje met een diameter van 100 μm op de focus van het uitgezonden licht, nadat de gecollimeerde emissiebundel door een lens is gefocusseerd en voordat de emissiebundel opnieuw is gecollimeerd door een andere lens.
    4. Gebruik een banddoorlaatfilter (585/40 nm in ons geval) om sCy3-fluorescentie van andere lichtbronnen verder te filteren.
    5. Detecteer de fluorescentie met behulp van een detector (single-photon lawanche diode of hybride fotomultiplicator, in ons geval) gerouteerd (via een 4-op-1 router, in ons geval) naar een TCSPC-module (Becker & Hickl SPC-150, in ons geval).
      OPMERKING: In ons geval wordt gegevensverzameling uitgevoerd via de VistaVision-software (ISSTM)in het time-tagged-time-resolved (TTTR) bestandsformaat.
  2. smPIFE monstervoorbereiding
    1. Bereid 25 pM sCy3-gelabelde α-Syn in metingen buffer: 10 mM natriumacetaat, 10 mM natriumdiwaterstoffosfaat, 10 mM glycine pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM cysteamine en 1 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonzuur (TROLOX), in een laag eiwitbindende buis.
      OPMERKING: Als α-Syn wordt gemeten in aanwezigheid van SDS-blaasjes, voeg dan ook de juiste SDS-hoeveelheid toe.
    2. Spoel een 18-kamer microscopie coverslip dia met 100 μL van 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA) gedurende een duur van 1 minuut en verwijder vervolgens de BSA.
    3. Voeg 100 μL van het 25 pM sCy3-gelabelde α-Syn-monster toe aan een kamer in de dia van de afdekplaat.
    4. Voer smPIFE-meting van het monster uit met behulp van de beschreven opstelling, zoals volgt in de volgende stappen.
  3. smPIFE data acquisitie
    1. Gebruik een objectief met een hoog numeriek diafragma (in ons geval Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) en voeg een druppel ultrazuiver water toe bovenop de objectieflens.
    2. Bevestig de coverslip-dia in een podiumkamer en installeer deze bovenop de microscooptrap.
    3. Breng de objectieflens naar boven, totdat de waterdruppel bovenop de objectieflens aan de onderkant van de coverslipschuif smeert.
    4. Open de lasersluiter en breng de objectieflens naar boven, terwijl u het patroon op een CMOS-camera inspecteert en licht verzamelt dat uit het monster wordt verstrooid. Observeer het luchtige ringenpatroon: de eerste vertegenwoordigt de focus op de water-glasinterface en vervolgens de tweede vertegenwoordigt de focus op het raakvlak tussen het glas en de monsteroplossing.
    5. Verhoog de hoogte van de objectieflens met nog eens 75 μm, waardoor de laserfocus diep in de oplossing komt, om autofluorescentie van het glazen oppervlak van de coverslip te minimaliseren.
    6. Stem het laservermogen op de objectieflens af op ~100 μW.
    7. Begin met de acquisitie van gedetecteerde fotonen voor een vooraf gedefinieerde tijd (2 uur, in onze metingen).
      OPMERKING: Het grootste deel van het acquisitiesignaal moet een snelheid hebben (gemeten in tellingen per seconde, cps) die vergelijkbaar is met die verkregen bij het meten van alleen de buffer; de milliseconde-binned-gegevens zouden schaarse foton burst-gebeurtenissen moeten laten zien, waarbij de meerderheid van de bakken een gemiddelde snelheid heeft die vergelijkbaar is met de typische detectorachtergrondsnelheid (< 1.000 cps, in ons geval).

4. smPIFE burst analyse

  1. Conversie van onbewerkte gegevens
    OPMERKING: De gegevens worden meestal opgeslagen in een binair bestand met een formaat dat vooraf is gedefinieerd door het bedrijf dat de TCSPC-kaart produceert (.spc-bestanden in ons geval).
    1. Converteer het onbewerkte gegevensbestand naar het universele bestandsindeling photon-HDF542met behulp van de softwaresuite phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Roep het onbewerkte gegevensbestand aan als invoer en converteer naar een raw data .hdf5-bestand met behulp van de juiste code in de phconvert-suite (de Convert ns-ALEX Becker-Hickl-bestanden naar Photon-HDF5.ipynb Jupyter-notebook, in ons geval).
      OPMERKING: De conversie naar een .hdf5-bestand omvat: (1) het bepalen van de relevante fotonstromen in de onbewerkte gegevens (d.w.z. fotonenstromen van geregistreerde fotonen van de relevante detector-ID); (2) de relevante nanotijden van fotonen (de detectietijden van fotonen ten opzichte van de excitatie SYNC-tijd); en (3) metadata toegevoegd.
  2. Burst zoeken en selecteren met behulp van FRETbursts43
    OPMERKING: Alle foton-HDF5 raw-gegevensbestanden van de smPIFE-metingen, evenals de code die de analyse van de onbewerkte gegevens samenvat, worden opgeslagen in Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Alle onderstaande stappen worden gedetailleerd beschreven en weergegeven in de Jupyter-notebooks, ook geleverd in de Zenodo-repositorylink.
    1. Open de Jupyter Notebooks (binnen het Anaconda framework, in ons geval).
    2. Open de notebook smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb (deze is te vinden in de Zenodo link).
    3. Laad FRETbursts.
    4. Laad het foton HDF5-gegevensbestand.
    5. BG-snelheidsbeoordeling: bereken met behulp van het histogram van de inter-fotontijden de achtergrondsnelheden (BG) voor elke 30 seconden gegevensverzameling in het foton HDF5-gegevensbestand.
      OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de burst-zoekopdracht met behulp van het schuifraamalgoritme44,45,46.
    6. Verplaats een tijdvenster van m=20 opeenvolgende fotonen, één foton tegelijk.
    7. Verzamel de fotongegevens alleen als de momentane fotonsnelheid ( figure-protocol-1 ), ten minste F = 11 keer groter is dan de BG-snelheid voor die periode van de gegevensverzameling.
      OPMERKING: Een burst wordt opgebouwd uit alle opeenvolgende fotonen die zijn verzameld door het venster één foton per keer te schuiven (stap 4.2.6.) en akkoord te gaan met het fotonsnelheidscriterium (stap 4.2.7).
    8. Bereken de volgende barstkarakteristieken:
      Burstgrootte: de hoeveelheid fotonen in een burst.
      Burstduur: het tijdsverschil tussen de laatste en eerste fotondetectietijd in een burst.
      Burst-helderheid: de grootste waarde van de momentane fotonsnelheid in een burst.
      Burstscheiding: het tijdsinterval tussen opeenvolgende bursts.
      OPMERKING: De volgende punten beschrijven de verdere burst-selectieprocedure.
    9. Plot het histogram van burst-helderheidswaarden (de hoogste momentane fotonsnelheid in een burst), met de as van de gebeurtenissen in logaritmische schaal.
    10. Definieer de burst-helderheidsdrempel als de minimale burst-helderheidswaarde van waaruit het histogram een vervallend patroon vertoont.
    11. Selecteer bursts met helderheidswaarden die groter zijn dan de burst-helderheidsdrempel.
      OPMERKING: De volgende stappen beschrijven burst mean fluorescence lifetimes.
    12. Plot het histogram van fotonnnanotijden voor alle fotonen in alle geselecteerde bursts met de as van de fotontellingen in logaritmische schaal.
    13. Definieer de nanotijddrempel als de minimale nanotijdwaarde van waaruit het histogram van fotonnnanotijden een vervalpatroon vertoont.
    14. Selecteer alleen fotonen met nanotijden groter dan de nanotijddrempel.
    15. Bereken het algebraïsch gemiddelde van alle geselecteerde fotonn nanotijden.
    16. Trek de nanotijddrempel af van het algebraïsche gemiddelde van de foton nanotijd. Het resultaat is de gemiddelde fotonnnanotijd van de burst, die recht evenredig is met de gemiddelde fluorescentielevensduur.
    17. Plot het histogram van alle burst gemiddelde fluorescentielevens. Centraal verdeelde subpopulaties van fluorescentielevensduur kunnen verschijnen. Subpopulaties met gemiddelden met een lage waarde vertegenwoordigen molecuulsoorten met sCy3 die niet sterisch werd belemmerd, terwijl subpopulaties met gemiddelden met een hogere waarde molecuulsoorten vertegenwoordigen met sCy3 die meer sterisch werd belemmerd.
      OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de langzame dynamiek tussen bursts op basis van burst-recidiefanalyse47
    18. Plot het histogram van burst-scheidingstijden, met de scheidingstijdas in logaritmische schaal.
      OPMERKING: Er verschijnen twee subpopulaties van burst-scheidingstijden:
      Een belangrijke subpopulatie met scheidingstijden van seconden, die opeenvolgende uitbarstingen vertegenwoordigen die afkomstig zijn van verschillende opeenvolgend gemeten moleculen.
      Een kleine subpopulatie met scheidingstijden ~ <100 ms, die opeenvolgende uitbarstingen vertegenwoordigen die beide afkomstig zijn van hetzelfde molecuul en terugkeren door het confocale volume.
    19. Selecteer om alle paren van opeenvolgende bursts op te slaan die worden gescheiden door minder dan een maximale scheidingstijd die de subpopulatie van hetzelfde molecuul definieert (<100 ms, in ons geval).
    20. Plot een histogram of een scatterplot van de gemiddelde fluorescentielevensduur van de eerste en tweede bursts voor alle paar bursts die terugkeerden onder een bepaalde scheidingstijddrempel

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een IDP, wanneer het niet gebonden is aan een ander biomolecuul, vertoont α-Syn structurele dynamiek tussen meerdere conformaties, met overgangen op enkele microseconden40 en zelfs op honderden nanoseconden41. Wanneer α-Syn de confocale plek kruist, kan het duizenden overgangen tussen conformaties ondergaan. Inderdaad, dit was het geval toen smFRET werd gebruikt39,40. Hier voeren we smPIFE-metingen uit om de lok...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgebreide biochemische en biofysische studies werden uitgevoerd om de structurele kenmerken van α-Syn en zijn ongeordende aard te bestuderen33,34,35,36,37,38. Verschillende werken hebben al vrij diffuus smFRET gebruikt om de intramoleculaire dynamica van het α-Syn-monomeer vrij van binding te onderzoeken. Deze werken rappor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs delen geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pT-t7 plasmide coderend voor A56C α-Syn mutant werd ons cadeau gedaan door Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir en Dr. Elisha Haas. Dit artikel werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH, subsidie R01 GM130942 aan E.L. als subaward), de Israel Science Foundation (subsidie 3565/20 binnen het KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), het Milner Fund en de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (start-upfondsen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsMercC7715cutoff: 100 kDa
ammoniumsulfaatSigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
cysteamineSigma-Aldrich30070
dialysezakjes - MEGA GeBaFlex-buisGene Bio-ApplicationMEGA320
dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Fast SeeBand kleuringsoplossingGene Bio-ApplicationSB050
GlycineSigma-Aldrich50046
D-GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-Aldrich54457
HiTrap Desalting 5 mLSigma-AldrichGE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur (TROLOX)Sigma-Aldrich238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Sigma-AldrichI5502
LB-bouillonSigma-AldrichL3152
MagnesiumchlorideSigma-Aldrich63068
MonoQ-kolomSigma-Aldrich54807
eiwit LoBind buisSigma-AldrichEP00301080940.5 mL
Rinse a µ-slide 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
NatriumacetaatSigma-AldrichS2889
NatriumhydroxideSigma-AldrichS8045
Natriumfosfaatmonohydraat monobasischSigma-Aldrich71507
Steriele Cell spreaders, Drigalski-spatelsmini-plast815-004-05-001
streptomycinesulfaatSigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3 maleïmideabcamab146493
Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TryptonSigma-AldrichT7293
Gist ExtractSigma-AldrichY1625

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291(2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976(2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257(2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6(2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859(2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286(2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716(2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766(2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493(2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653(2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133(2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416(2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single molecule PIFEalfa synucle ne monomeerfluorescentielivensduurstructurele subpopulatiessite specifieke labelingburst analyseconformationele dynamiekspectroscopische proximiteitssensorintrinsiek ongeordend eiwit

Gerelateerde artikelen