Visualisatie van membraanrommelvorming met behulp van Scanning Electron Microscopie

Summary

Macropinocytose is een sterk geconserveerd endocytisch proces geïnitieerd door de vorming van F-actine-rijke plaatachtige membraanprojecties, ook bekend als membraanrulingen. Verhoogde snelheid van macropinocytotische opgeloste stof internalisatie is betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen. Dit protocol presenteert een methode om de vorming van membraanrommels in vitro te kwantificeren met behulp van scanning elektronenmicroscopie.

Abstract

Membraanrommel is de vorming van beweeglijke plasmamembraanuitsteeksels die een maaswerk van nieuw gepolymeriseerde actinefilamenten bevatten. Membraanrusels kunnen zich spontaan vormen of als reactie op groeifactoren, inflammatoire cytokines en phorbolesters. Sommige van de membraanuitsteeksels kunnen reorganiseren in cirkelvormige membraanrukels die aan hun distale randen samensmelten en kopjes vormen die sluiten en scheiden in het cytoplasma als grote, heterogene vacuolen die macropinosomen worden genoemd. Tijdens het proces vangen ruches extracellulaire vloeistof en opgeloste stoffen op die zich internaliseren binnen macropinosomen. Hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een veelgebruikte beeldvormingstechniek om de vorming van membraanrommels, cirkelvormige uitsteeksels en gesloten macropinocytische cups op het celoppervlak te visualiseren en te kwantificeren. Het volgende protocol beschrijft de celkweekomstandigheden, stimulatie van de membraanrommelvorming in vitro en hoe cellen te fixeren, uitdrogen en voorbereiden voor beeldvorming met behulp van SEM. Kwantificering van membraanruling, gegevensnormalisatie en stimulatoren en remmers van membraanrommelvorming worden ook beschreven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van macropinocytose in fysiologische en pathologische processen, het onderzoeken van nieuwe doelen die de vorming van membraanrommel reguleren en het identificeren van nog niet-gekarakteriseerde fysiologische stimulatoren en nieuwe farmacologische remmers van macropinocytose.

Introduction

Macropinocytose is een endocytisch proces dat verantwoordelijk is voor het internaliseren van een grote hoeveelheid extracellulaire vloeistof en de inhoud ervan via de vorming van dynamische en actine-aangedreven plasmamembraanuitsteeksels die membraanruches worden genoemd¹. Veel van deze membraanruches vormen cups die sluiten en terugsmelten naar de cel en scheiden van het plasmamembraan als grote, heterogene intracellulaire endosomen, ook bekend als macropinosomen¹. Hoewel macropinocytose wordt geïnduceerd door groeifactoren zoals macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en epidermale groeifactor (EGF) in een breed ....

Protocol

OPMERKING: Het volgende is een algemeen protocol dat wordt gebruikt om de vorming van membraanrommels in RAW 264.7-macrofagen te kwantificeren met behulp van SEM-microscopie. Optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende celtypen.

1. Cellijn en celkweek

1. Kweek RAW 264,7 macrofagen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd Foetaal Runderserum (FBS), 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO₂. Vervang groeimedia om de dag.
2. Wanneer cellen 80% confluent worden, wast u de plaat twee keer met steriel PBS.
....

Results

Hier beschrijven we de resultaten van de gepresenteerde techniek. Representatieve SEM-beelden in figuur 1 tonen de vorming van membraanrommels in RAW 264.7 macrofagen na behandeling met PMA en M-CSF. Beelden werden eerst vastgelegd met een vergroting van 3.500x voor kwantificeringsdoeleinden en vervolgens met hogere vergrotingsniveaus (8.500x tot 16.000x) om het plasmamembraan op grotere details te laten zien. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakte membraa.......

Discussion

Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. Hoewel het huidige protocol zich richt op macrofagen, hebben studies aangetoond dat membraanrommelvorming ook voorkomt op verschillende andere celtypen, waaronder dendritische cellen, fibroblasten, neuronen en kankercellen 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope