Synthese en karakterisering van multimodale faseverandering porfyrinedruppels

Samenvatting

In dit protocol worden methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van multimodale faseverandering porfyrinedruppels beschreven.

Samenvatting

Faseveranderingsdruppels zijn een klasse van ultrasone contrastmiddelen die kunnen worden omgezet in echogene microbubbels in situ met de toepassing van voldoende akoestische energie. Druppeltjes zijn kleiner en stabieler dan hun microbubbel tegenhangers. Traditionele ultrasone contrastmiddelen zijn echter niet traceerbaar buiten akoestische feedbackmetingen, wat het kwantificeren van contrastmiddel biodistributie of accumulatie ex vivo moeilijk maakt. Onderzoekers moeten mogelijk vertrouwen op fluorescerende of optisch absorberende begeleidende diagnostische deeltjes om biodistributie af te leiden. Het doel van dit protocol is om stappen te beschrijven voor het maken van multimodale porfyrinedruppels met faseverandering met behulp van een condensatiemethode. Porfyrinen zijn fluorescerende moleculen met verschillende absorptiebanden die kunnen worden geconjugeerd op lipiden en in druppels kunnen worden opgenomen om de veelzijdigheid van druppels uit te breiden, waardoor een robuustere biodistributie mogelijk wordt met behoud van akoestische eigenschappen. Zeven formuleringen met verschillende porfyrine-lipide- en baselipideninhouden werden gemaakt om microbubbel- en druppelgrootteverdelingen te onderzoeken. Karakteriseringen die geschikt zijn voor porfyrine-bevattende structuren worden ook beschreven in het protocol om hun analytische veelzijdigheid in-oplossing aan te tonen. Sizing toonde aan dat de post-gecondenseerde gemiddelde diameters 1,72 tot 2,38 keer kleiner waren dan voorloperpopulaties. Absorptiekarakterisering toonde aan dat intacte assemblages een Q-bandpiek van 700 nm hadden, terwijl verstoorde monsters een absorptiepiek hadden bij 671 nm. Fluorescentiekarakterisering toonde intacte 30% porfyrine-lipideassemblages waren fluorescerend geblust (>97%), waarbij fluorescentieherstel werd bereikt bij verstoring. Akoestische verdamping toonde aan dat porfyrinedruppels niet-echogeen waren bij lagere drukken en konden worden omgezet in echogene microbubbels met voldoende druk. Deze karakteriseringen tonen het potentieel voor porfyrinedruppels om de noodzaak van absorptie- of fluorescentiegebaseerde begeleidende diagnostische strategieën te elimineren om de biodistributie van echografiecontrastmiddelen te kwantificeren voor levering of therapeutische toepassingen in vivo of ex vivo.

Inleiding

Echografie is een niet-invasieve, niet-ioniserende vorm van medische beeldvorming die akoestische golven gebruikt. Hoewel ultrasone scanners draagbaarder zijn en realtime beelden kunnen bieden, kunnen echografiebeelden last hebben van een laag contrast, waardoor het voor sonografen moeilijk is om op betrouwbare wijze vergelijkbare echogene pathologische kenmerken te onderscheiden. Om deze beperking tegen te gaan, kunnen microbubbels in de gastheer worden geïnjecteerd om het vasculaire contrast te verbeteren. Microbubbels zijn met micron gevulde contrastmiddelen ter grootte van een micron die zeer echogeen zijn voor akoestische golven en een verbeterd vatcontrast kunnen bieden^1,2. De schelpen en gaskernen van microbubbels kunnen worden aangepast voor verschillende toepassingen, zoals beeldvorming, trombolyse, celmembraanpermeabilisatie of voorbijgaande vasculaire opening².

Een nadeel van microbubbels is hun korte oplagehalfwaardetijd. Klinisch beschikbare perflutren lipidemicrosferen hebben bijvoorbeeld slechts een halfwaardetijd van 1,3 minuten³. Voor lange beeldvormingssessies zijn meerdere injecties van microbubbels nodig. Een ander nadeel van microbubbels is hun grote diameters. Hoewel perflutren lipide microsferen ongeveer 1 tot 3 μm in diameter zijn, klein genoeg om in vasculatuur te circuleren, zijn ze te groot om te extravaseren en zich passief op te hopen in weefsels van belang, zoals tumoren⁴. Een strategie om deze beperkingen te overwinnen is om de gaskernmicrobubbels te condenseren tot kleinere, vloeibare kerndruppels^5,6. Hoewel druppels niet echogeen zijn in hun vloeibare toestand, kunnen ze worden verdampt tot microbubbels bij blootstelling aan echografie met voldoende hoge pieknegatieve druk, waardoor ze hun vermogen om contrast te bieden terugkrijgen. Hierdoor kan de druppel profiteren van de gunstigere farmacokinetiek van een kleine vloeistofkern, terwijl het vermogen om contrast te bieden behouden wanneer geïnsoneerd en zonder de chemische samenstelling te veranderen^4,7.

Decafluorbutaan is een ideale perfluorkoolstofverbinding voor faseverschuiving tussen gasvormige en vloeibare toestanden^5,6,7. Decafluorbutaan maakt condensatie van microbubbels in druppels met alleen temperatuurverlaging mogelijk, terwijl minder dichte perfluorkoolwaterstoffen extra druk vereisen⁵. Deze zachte methode minimaliseert de vernietiging van bellen tijdens condensatie^7,8,9. Omdat hun kernen vloeibaar zijn, zijn druppels niet-echogeen en onzichtbaar voor echografie. Met de toepassing van voldoende akoestische of thermische energie kunnen de vloeibare kernen echter weer verdampen in een gasvormige toestand, waardoor echogene microbubbels worden gegenereerd⁸. Deze verdamping maakt het mogelijk om te bepalen wanneer en waar microbubbels moeten worden gegenereerd.

Hoewel druppels nuttig zijn voor passieve accumulatie, in situ verdamping of verbetering van de celdoorlaatbaarheid⁴, kunnen druppels (en hun fragmenten) niet ex vivoin beeld worden gebracht of gekwantificeerd. Daarom worden kwantificeerbare begeleidende diagnostische middelen, zoals fluorescerend^4,10,11,magnetische deeltjes^12,optisch absorberende middelen^13,gebruikt als een analoog om druppelafgifte aan weefsels van belang te meten. Helfield et al. gebruikten bijvoorbeeld een co-injectie van fluorescerende nanoparels voor histologische beeldkwantificering van muisorganen, omdat druppels niet fluorescerend konden worden gedetecteerd⁴. Het nadeel van begeleidende diagnostische middelen is dat de traceerbare component onafhankelijk van de druppel kan werken, afhankelijk van het individuele farmacokinetische profiel.

Gelukkig kan de schaal van microbubbels en druppels worden aangepast. Huynh et al. demonstreerden bijvoorbeeld ultrasone contrastmiddelen met porfyrine-lipideschalen, waardoor multimodale microbubbels^{ontstonden 14}. Porfyrines zijn een klasse van organische verbindingen met een aromatische macrocylische structuur^14,15. Ze zijn optisch absorberend, fluorescerend en kunnen worden gechelateerd tot een breed scala aan metalen voor radiotherapie, beeldvorming op basis van radionucliden of op sporenmetaal gebaseerde kwantificering¹⁴. Een voorbeeld van porfyrine is pyropheophorbide (Pyro). Door Pyro op lipiden te conjugeren, pyro-lipiden in microbubbels of druppels op te nemen, kunnen ze in beeld worden gebracht en gevolgd via meerdere modaliteiten: akoestisch, fluorescerend en door absorptie¹⁴. Dit multimodale contrastmiddel kan worden gebruikt om accumulatie te volgen en te kwantificeren. Dit zou de behoefte aan begeleidende diagnostische middelen kunnen elimineren, aangezien de kwantificeerbare component nu op de schaal is geconjugeerd, waardoor een nauwkeurigere leveringskwantificering mogelijk is¹⁶.

Hierin wordt een protocol voor het maken van multimodale faseverandering porfyrinedruppels geschetst. Omdat ultrasone contrastmiddelen kunnen worden gebruikt als een platform voor medicijnafgifte aan weefsels van belang, zoals tumoren^2,4,kan het uitbreiden van hun detecteerbaarheid buiten echografie nuttig zijn voor de kwantificering van de werkzaamheid van de afgifte. Het doel van deze druppels is om traceerbare ultrasone contrastmiddelen te bieden die in staat zijn tot passieve accumulatie in vivo, in situ verdamping en akoestiek, en met het potentieel om biodistributie of accumulatie van ex vivo organen te kwantificeren zonder de afhankelijkheid van secundaire sensoren. Karakteriseringsmethoden worden ook geschetst om het potentieel van porfyrinedruppels als biodistributiesensoren te demonstreren. De effecten van Pyro-lipide belasting in de schaal (0% tot 50% door molaire verhouding) worden ook besproken.

Protocol

1. Gedehydrateerde lipidenfilms

1. Bereken de massa's van elk van de benodigde shell-componenten (zie Aanvullend bestand "Lipid Formula Sheet").
   OPMERKING: Voor dit protocol is de samenstelling van de schaal: 10 molair % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-5000] ammoniumzout (DSPE-PEG5K), x molair % pyrofeophorbide geconjugeerd 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholine (Pyro-SPC), en (90 - x) molair % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC). De hoeveelheid Pyro-SPC zal variëren over 7 shell samenstellingen (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Controleer het molecuulgewicht van DSPE-PEG5K op de voorraadfles.
   1. Schaal het protocol naar elk lipidevolume met een minimumvolume van 1 ml. Voor dit protocol werd een totaal lipidevolume van 10 ml met een totale lipideconcentratie van 1 mg per ml gebruikt voor alle formuleringen. De hulpstofoplossing is: 10% propyleenglycol, 10% glycerol en 80% fosfaatbufferzilte (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (zie stap 2.3 en "Lipid Formula Sheet").
      OPMERKING: Syntheseprotocol van pyro-lipiden wordt beschreven in het aanvullende bestand "Andere protocollen en gegevens" stappen S1 tot S1.19, die is gewijzigd op basis van het werk van Zheng et al.¹⁵.
2. Op basis van de berekende massa's (zie stap 1.1 en "Lipid Formula Sheet"), weeg elk van de niet-pyrolipiden af en breng over op een voldoende grote injectieflacon met borosilicaatglas met een schroefdop.
3. Dop de injectieflacon, label de dop en de injectieflacon en bedek de bodem en wanden van de lipidenflacon met aluminiumfolie. Deze injectieflacon wordt de "LipideFlacon" genoemd voor de rest van het protocol. Bewaar de Lipid Vial in een koele, droge, donkere ruimte.
4. Als de formulering Pyro-SPC bevat, los dan 10 mg Pyro-SPC droge film (zie "Andere protocollen en gegevens") op in 1 ml chloroform. Vortex gedurende 5 s, meet de absorptie en bereken het juiste volume om toe te voegen aan de Lipid Vial.
   LET OP:Chloroform is een gevaar voor de gezondheid, irriterend en giftig. Draag een beschermende laboratoriumjas, oogbescherming, handschoenen en vermijd het inademen van dampen.
   OPMERKING: Aangezien Pyro-SPC lichtgevoelig is, vermindert u indien mogelijk de lichten in het werkgebied bij het hanteren van Pyro-SPC. Houd Pyro-SPC verzegeld en afgedekt wanneer het niet in gebruik is.
   1. Stel deze op de ultraviolet-zichtbare spectrofotometer in om de absorptie te meten van een golflengtebereik van 800 nm tot 300 nm met stappen van 0,5 nm en meet een basislijn met 2000 μL zuivere methanol in een compatibele cuvette met een padlengte van 1 cm.
      LET OP:Methanol is een gevaar voor de gezondheid, irriterend, giftig en ontvlambaar. Draag een beschermende laboratoriumjas, oogbescherming, handschoenen en vermijd het inademen van dampen. Uit de buurt van vonken en hitte houden.
   2. Voeg 2 μL van de Pyro-SPC in chloroform toe aan 2000 μL methanol en vortex gedurende 30 s. Breng het over in een schone, compatibele cuvette van 1 cm en meet de absorptie. Pas deze verdunningsfactor aan als de absorptie piekt bij 667 nm buiten het absorptiebereik van de ultraviolet-zichtbare spectrofotometer.
      OPMERKING: Gebruik bij het overbrengen van chloroform of methanol een spuit van schoon glas of een verdringerpipet in plaats van een mechanische pipet voor een betere nauwkeurigheid.
   3. Herhaal stap 1.4.2 nog twee keer om drievoudige absorptiewaarden te krijgen.
   4. Gemiddelde van de absorptiepiekwaarden bij 667 nm en gebruik de volgende vergelijking om het volume Pyro-SPC in chloroform te berekenen dat nodig is voor de Lipid Vial^14,15:
      
      waarbij V het volume Pyro-SPC in chloroform is dat nodig is, m de vereiste massa Pyro-SPC is (zie stap 1.1 en "Lipid Formula Sheet"), M het molecuulgewicht van Pyro-SPC bij 1040,317 g·mol^-1, A de gemiddelde absorptie bij 667 nm is, d de verdunningsfactor is op basis van de methanol en Pyro-SPC in chloroformvolumes (stap 1.4.2); L is de cuvette padlengte op 1 cm, en ε is 667 nm molaire dempingscoëfficiënt van Pyro-SPC bij 45000 L·mol^-1·cm^-1.
      OPMERKING: De noemer van de vergelijking is de wet van Beer-Lambert, die de concentratie van een analyt in oplossing relateert aan de gemeten optische absorptie over een afstand.
   5. Voeg het berekende volume Pyro-SPC in chloroform uit de vorige stap toe aan de lipidenflacon met behulp van een spuit van schoon glas(figuur 1A)en dop vervolgens de injectieflacon af en dek af.
      OPMERKING: Figuur 1 toont alleen de pyro-lipideformulering van 30%.
   6. Als er nog Pyro-SPC in chloroform over is: Maak in een zuurkast de Pyro-SPC + chloroform injectieflacon uit stap 1.4 los, kantel de injectieflacon gedeeltelijk naar zijn kant en laat continu stikstofgas zo voorzichtig mogelijk in de Pyro-SPC/chloroform injectieflacon stromen. Draai de injectieflacon om de chloroform uit te drogen met behulp van de stikstofgasstroom en om de Pyro-SPC gelijkmatig op de binnenwand van de injectieflacon te coaten terwijl deze droogt. Zorg ervoor dat er geen spatten worden gemaakt en dat er niets van de oplossing uitvalt.
   7. Zodra de Pyro-SPC lipidefilm droog lijkt en op de wand van de injectieflacon is gecoat, schakelt u de stikstofgasstroom uit. Sluit de injectieflacon af, sluit de hals van de injectieflacon af met wasfolie en bewaar de injectieflacon bij -20 °C en in het donker.
5. Bereid een oplossing van 90% chloroform en 10% methanol (% v/v) en voeg 5 ml toe aan de lipidenflacon. Dop de lipidenflacon en draai voorzichtig om de inhoud te homogeniseren(figuur 1B).
   OPMERKING: Als de formulering fosfatidische zure lipiden bevat (zoals 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfaat natriumzout (DSPA)), voeg dan in plaats daarvan: 60% chloroform, 32% methanol en 8% dubbel gedeioniseerd water (% v / v / v) toe aan de Lipid Vial. Intenser wervelen kan nodig zijn om de lipide-inhoud volledig op te lossen.
6. Maak in een zuurkast de lipidenflacon los, kantel de lipidenflacon gedeeltelijk naar zijn kant en laat stikstofgas continu zo voorzichtig mogelijk in de lipidenflacon stromen. Draai de lipidenflacon om de oplossing uit te drogen met behulp van de stikstofgasstroom en bekleed de lipidenfilm gelijkmatig op de binnenwand van de lipidenflacon terwijl deze droogt. Zorg ervoor dat er geen spatten worden gemaakt en dat er niets van de oplossing uitvalt.
7. Zodra de lipiden droog lijken en gecoat op de binnenwanden van de lipideflacon(figuur 1C),schakelt u de stikstofgasstroom uit, bedekt u de bodem en wand van de lipidenflacon met aluminiumfolie en bedekt u de bovenste opening met aluminiumfolie geprikt met een paar gaten met een naald voor ontluchting(figuur 1D).
8. Label en plaats de afgedekte lipidenflacon in een vacuümsiccator en laat de lipiden verder drogen gedurende ten minste 24 uur maar niet meer dan 72 uur.
   OPMERKING: Het protocol kan later worden hervat, na 24 tot 72 uur.

2. Lipide hydratatie

1. Vul een badsoonapparaat met water en verwarm het tot 70 °C. Schakel het ultrasoonapparaat in om het water te mengen.
   LET OP:Het water en de sonicator zijn bij hoge temperaturen. Raak het water en de sonicator niet aan. Draag oogbescherming, een beschermende laboratoriumjas en beschermende handschoenen.
2. Zodra de badsoonapparaat 70 °C heeft bereikt, verwijdert u de lipidenflacon uit de vacuümsiccator. Verminder de lichten in het werkgebied indien mogelijk.
3. Bereid een hulpstofoplossing van 10% propyleenglycol, 10% glycerol, 80% PBS (% v/v/v) en voeg 10 ml ervan toe aan de lipidenflacon (zie stap 1.1.1 en "Lipid Formula Sheet").
   OPMERKING: Als u een standaard luchtverplaatsingspipet gebruikt, wees dan voorzichtig bij het hanteren van viskeuze oplosmiddelen zoals propyleenglycol en glycerol. Adem het volume langzaam op en laat het vallen en wacht tot het resterende volume de bodem van de pipetpunt bereikt. Zorg ervoor dat vloeistof zich niet vastklampt aan de buitenkant van de pipetpunt bij het overbrengen van volumes door langzaam te bewegen.
4. Dop de lipidenflacon, verwijder het aluminium deksel en draai de injectieflacon voorzichtig gedurende 15 minuten in de badsoonapparaat terwijl de ultrasoonapparaat wordt ingeschakeld om de lipiden op te lossen. Zorg ervoor dat de hals van de Lipid Vial zich boven het water bevindt. Controleer af en toe of de dop van de injectieflacon goed gesloten is.
   1. Verwijder af en toe de Lipide Injectieflacon uit het waterbad. Houd het kort tegen het licht om te controleren of de inhoud volledig is opgelost(figuur 1E).
   2. Als de inhoud van de lipideflacon niet homogeniseert, verwijdert u de lipidenflacon uit de badsoonapparaat. Zet de dop vast, draai agressiever en breng hem terug naar de badsoonapparaat.
5. Verwijder de Lipid Vial uit de badsoonapparaat en schakel de badsoonapparaat uit. Droog de buitenkant van de lipideflacon met papieren handdoeken en label de lipidenflacon opnieuw.
6. Bedek de Lipide Flacon met aluminiumfolie en koel de Lipide Flacon op kamertemperatuur in een koele, donkere, droge ruimte gedurende 10 minuten.
7. Aliquot de inhoud van de lipideflacon: ongeveer 2 ml van de lipide-oplossing in 3 ml boorosilicaatglas heldere serumflacons (7 mm binnendiameter van de mond, 13 mm buitendiameter van de mond).
   OPMERKING: Sommige protocollen kunnen 1,5 ml lipideoplossing gebruiken in de injectieflacon van 3 ml⁷.
8. Bedop de serumflacons met grijze chloorbutylrubberen stoppers in lyofilisatiestijl (7 mm binnendiameter van de mond, 13 mm buitendiameter) en zet de rubberen stop vast met afscheurbare aluminium afdichtingen (13 mm buitendiameter) en een krimp(figuur 1F).
9. Vacuüm, ontgass en zet de lipideoplossing in elk van de serumflacons^4,5,7 opnieuw onder druk(figuur 2).
   OPMERKING: Raadpleeg "Andere protocollen en gegevens" voor instructies over het monteren van de gaswisselaar en meer informatie.
   1. Sluit elke klep tussen en inclusief drukklep A en gasflesklep(figuur 2). Sluit de serumflacons aan op de spruitstuknaalden, open vervolgens de overeenkomstige manifoldkleppen, open vervolgens vacuümklep A en vacuümklep B en vacuüm bij -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) gedurende 5 minuten om atmosferische lucht te verwijderen. Zuig geen van de vloeistoffen op (zie "Andere protocollen en gegevens" stappen S3 tot en met S3.1.5).
      LET OP:De vacuümpomp kan barsten als deze verkeerd wordt gehanteerd. Gebruik de vacuümpomp niet met organische, zure of basischchemicaliën.
   2. Houd met het vacuüm nog aan een serumflacon (om te voorkomen dat deze zwaait) en tik er snel met een pen of stift op om te ontgassen. Blijf tikken totdat er geen bubbels ontstaan en er geen bubbels in de injectieflacon zitten. Laat geen vloeistof worden opgezomd. Pauzeer het tikken indien nodig. Herhaal dit voor alle aangesloten serumflacons. Sluit na het ontgassen van alle serumflacons vacuümklep A en vacuümklep B en schakel de vacuümpomp uit (zie "Andere protocollen en gegevens" Stappen S3.2 tot en met S3.2.3).
   3. Terwijl de serumflacon nog steeds op de naald is aangesloten en de vacuümpomp is uitgeschakeld, draait u de gasflesklep langzaam 1/16 tot 1/8 (ongeveer 22,5 tot 45 ° van de volledige omwenteling) tegen de klok in om gedeeltelijk te openen, vervolgens de T-handle-klep te openen en draai de luchtregelaarklep langzaam met de klok mee naar 3 psi (20,7 kPa) meter. Open vervolgens drukventiel A en drukventiel B (zie "Andere protocollen en gegevens" Stappen S3.3 tot en met S3.3.21).
      LET OP:De decafluorbutaan gasfles staat onder druk en kan exploderen bij verhitting. Blijf ver van hitte en impact. Decafluorbutaangas kan zuurstofverplaatsing en verstikking veroorzaken. Draag de juiste oogbescherming en handvat in een zuurkast. Indien verkeerd behandeld, is het mogelijk om de gasfles te stofzuigen, wat een snelle de-druk en implosie kan veroorzaken. Het openen van de gasflesklep met meer dan 1/8 draai kan de luchtregelaar beschadigen.
   4. Na 30 s druk (meter moet nog steeds 3 psi (20,7 kPa) lezen), sluit u alle manifoldkleppen met serumflacons, koppelt u de serumflacons los, omhult u de naalden en sluit u de gasflesklep.
   5. Verlicht de opgebouwde druk door een enkele manifoldklep gedeeltelijk te openen totdat de luchtregelaarmeternaald in zijn rustpositie gaat. Sluit vervolgens alles tussen en inclusief de Manifold Valves en de T-Handle.
10. Label serumflacons en bewaar ze bij 4 °C en in het donker. Zorg ervoor dat alle gaswisselaarkleppen gesloten zijn en dat de vacuümpomp daarna wordt uitgeschakeld.
    OPMERKING: Het serum moet in deze toestand tot 4 maanden stabiel zijn. Bij deze stap kan het protocol later worden hervat, na ten hoogste 4 maanden.

3. Injectieflacons met decafluorbutaan

1. Met schone, lege 3 ml borosilicaatglas heldere serumflacons (7 mm binnenmonddiameter, 13 mm buitenmonddiameter), dop ze af met grijze chloorbutylrubberen stoppers in lyofilisatiestijl (7 mm binnenmonddiameter, 13 mm buitenmonddiameter) en zet de rubberen stop vast met afgescheurde aluminium afdichtingen (13 mm buitenmonddiameter) en een krimp^{4, 7,8}.
2. Volg stap 2.9.1 om de atmosferische lucht vacuüm te maken (zie stappen S3.1 tot en met S3.1.5 voor andere protocollen en gegevens).
3. Sla het ontgassen over en volg stappen 2.9.3 tot en met 2.9.5 om de injectieflacon opnieuw onder druk te zetten (zie stappen S3.3 tot en met S3.3.21 (andere protocollen en gegevens) (zie 'Andere protocollen en gegevens').
4. Label de injectieflacons met decafluorbutaan en bewaar ze bij 4 °C en in het donker. Zorg ervoor dat alle gaswisselaarkleppen gesloten zijn en dat de vacuümpomp daarna wordt uitgeschakeld.
   OPMERKING: Serumflacons gevuld met decafluorbutaangas zijn nodig voor de druppelcondensatie. Ze moeten in deze staat maximaal 4 maanden stabiel zijn. Bij deze stap kan het protocol later worden hervat, na ten hoogste 4 maanden.

4. Druppelvorming

1. Verwijder een gehydrateerde lipide-oplossing in de serumflacon (uit stap 2.10) uit de koelkast.
2. Verwijder met behulp van een decapper de aluminiumafdichting op de serumflacon en breng 1 ml van de lipideoplossing over naar een injectieflacon met borosilicaatglas van 1,85 ml (met een fenolische schroefdop) door de lipideoplossing langs de binnenwand te laten stromen. Maak geen bubbels.
   1. Als er nog een lipideoplossing in de serumflacon zit, volg dan stap 2.9 tot 2.10 om de serumflacon te ontgassen en opnieuw onder druk te zetten voor opslag (zie "Andere protocollen en gegevens" stappen S3 tot en met S3.3.21).
3. Met de monsterflacon van 1,85 ml stroomt u voorzichtig decafluobutaangas in de kopruimte van de monsterflacon met behulp van de gaswisselaar (zie figuur 2 voor de specifieke klepnamen).
   1. Zorg ervoor dat alle kleppen op de gaswisselaar goed gesloten zijn en dat de pomp is uitgeschakeld.
      LET OP:Als het verkeerd wordt gedaan, is het mogelijk om de gasfles te stofzuigen, waardoor snelle decompressie en implosie ontstaat.
   2. Open een spruitstukklep en maak voorzichtig de bijbehorende naald los van het spruitstuk.
      LET OP:Scherp voorwerp, vermijd contact / piercing.
   3. Open drukklep A en drukklep B en draai de gasflesklep 1/16 tot 1/8 (ongeveer 22,5 tot 45 ° van volledige omwenteling) tegen de klok in om de T-handleklep gedeeltelijk te openen en vervolgens te openen.
      LET OP:Open de gasflesklep niet meer dan dit, omdat dit schade aan de luchtregelaar kan veroorzaken.
   4. Maak de injectieflacon met het monster los met de lipide-oplossing en verplaats deze zodat de manifoldnaald zich boven de vloeistof-luchtinterface in de injectieflacon bevindt. Houd de injectieflacon daar vast.
   5. Draai de luchtregelaarklep langzaam met de klok mee totdat de naald van de luchtregelaar iets uit zijn rustpositie beweegt en het perfluorkoolstofgas voorzichtig uit de spruitstuknaald stroomt. Laat het perfluorkoolstofgas gedurende 30 s voorzichtig in de headspace van de injectieflacon stromen. Maak geen bubbels. Stel indien nodig de luchtregelaarklep in.
      OPMERKING: De vloeistof-luchtinterface moet enigszins worden verstoord door de decafluorbutaangasstroom. Omdat het systeem nu open is, kan de luchtregelaar de druk niet goed aflezen.
   6. Dop na 30 s voorzichtig en snel de injectieflacon met monster zonder de injectieflacon te veel te bewegen.
   7. Sluit de gasflesklep (met de klok mee), de T-handleklep, de luchtregelaarklep (tegen de klok in), drukklep A, drukklep B en spruitstukklep.
   8. Schep de naald voorzichtig om.
   9. Label de injectieflacon van het monster en sluit de hals af met wasfolie met de klok mee(figuur 3A en 3B).
      OPMERKING: Figuren 3B tot 3F tonen alleen de 30% Pyro-lipide formulering.
4. Bewaar de injectieflacon met monster in het donker en bij 4 °C gedurende ten minste 10 minuten of maximaal 24 uur.
   OPMERKING: Bij deze stap kan het protocol later worden hervat, hoogste 24 uur.
5. Plaats ongeveer 100 g droogijs (koolstofdioxide) in een geïsoleerde container en plaats gewoon ijs in een andere geïsoleerde container. Haal voorbereide decafluorbutaan serumflacons op die worden vermeld in stap 3, twee naalden van 3,81 cm (1,5 inch), een plastic spuit van 1 ml (maak de zuiger los voor gebruik), een container van 200 ml, een metalen tang en een thermometer (-20 tot 100 °C).
   OPMERKING: Als u alleen microbubbels maakt, is er geen isopropanol, droogijs en ijs nodig.
6. Plaats de injectieflacon met het monster met de lipide-oplossing in het mechanische roerwerk en roer gedurende 45 s(figuur 3C).
7. Na het mechanisch roeren, zet de monsterflacon rechtsboven, afgeschermd van licht, en start een aftelling van 15 minuten om de injectieflacon af te koelen en de grootte te selecteren^8,17.
   1. Wanneer het aftellen van 15 minuten 10 minuten heeft bereikt (nog 5 minuten op het aftellen), vult u een container met ongeveer 200 ml isopropanol en koelt u deze af tot -20 °C met droogijs met behulp van een metalen tang.
      OPMERKING: De doeltemperatuur is -15 tot -17 °C, maar de isopropanol zal opwarmen tijdens het hanteren van de microbubbels.
      LET OP:Isopropanol is ontvlambaar. Uit de buurt van hitte en vonken houden. Droogijs kan huidbeschadiging veroorzaken. Handvat met tang. Draag handschoenen, oogbescherming en een beschermende laboratoriumjas.
8. Nadat de microbubbels gedurende 15 minuten zijn geselecteerd, zoekt u naar de door de grootte geselecteerde partitie in de monsterflacon(figuur 3D).
9. Houd de injectieflacon met de rechterflacon rechtsboven, maak de injectieflacon met het monster voorzichtig los en zuig ongeveer 0,7 ml van de onderste scheidingswand op met een 1,5 inch naald van 20 gauge bevestigd aan een plastic spuit van 1 ml. Zorg ervoor dat geen van de bovenste partities wordt teruggetrokken. Veeg niet met de spuit om de luchtzakken te verwijderen.
10. Steek een andere naald van 20 gauge in een injectieflacon met decafluorbutaanserum (houd de naald in de buurt van de bovenkant van de serumflacon) om te ontluchten en plaats vervolgens de naald /spuit met de door de grootte geselecteerde microbubbels.
11. Breng de door de grootte geselecteerde microbubbels langzaam over. Kantel de injectieflacon en richt de spuit om de vloeistof langs de binnenwand van de decafluorbutaan serumflacon te laten glijden.
12. Zodra alle door de grootte geselecteerde microbubbeloplossing is overgebracht, verwijdert u de naald met de spuit, maar houdt u de ontluchtingsnaald erin om de negatieve druk te verlichten(figuur 3E).
    1. Als u alleen microbubbels op maat maakt, stop dan hier. Houd de ontluchtingsnaald in en nabij de bovenkant. Bewaar de injectieflacon in het donker en op kamertemperatuur.
13. Voeg kleine hoeveelheden droogijs of isopropanol bij kamertemperatuur toe aan het isopropanolbad om ervoor te zorgen dat de badtemperatuur tussen -15 en -17 °C ligt.
14. Met de 20-gauge ontluchtingsnaald ingebracht in de buurt van de bovenkant van de serumflacon, plaatst u de serumflacon in het isopropanolbad, waarbij het microbubbelniveau onder het niveau van de isopropanol blijft, maar de hals van de injectieflacon erboven, en met tussenpozen wervelt u de serumflacon gedurende 2 minuten om de microbubbels te condenseren.
    OPMERKING: Deze stap is aangepast van het werk van Sheeran et al.⁶
    1. Draai de serumflacon niet continu in de isopropanol en laat de oplossing niet bevriezen. Draai ongeveer 5 s en til de serumflacon uit de isopropanol. Controleer op ijskernvorming en hervat het wervelen in isopropanol. Als er ijsvorming is, draai de serumflacon dan in de lucht totdat deze verdwijnt.
15. Verwijder na de condensatie van 2 minuten de serumflacon uit het isopropanolbad en verwijder de ontluchtingsnaald.
    OPMERKING: De microbubbels hadden moeten worden gecondenseerd tot druppeltjes, zoals aangegeven door de verandering in doorschijnendheid(figuur 3E versus figuur 3F voor de 30% pyro-lipideformulering).
16. Veeg de serumflacon af, label deze en plaats deze op gewoon ijs in een donkere, geïsoleerde container totdat deze klaar is voor gebruik. Ongeopende (intacte aluminium afdichting) druppels moeten in deze toestand stabiel zijn tot 6 uur zolang het gesmolten ijs wordt vervangen als dat nodig is.
17. Wanneer u klaar bent voor gebruik, verwijdert u de aluminium afdichting met de decapper. Bewaar druppels (zelfs open injectieflacons) op ijs en in het donker terwijl ze niet in gebruik zijn. Bewaar microbubbels in het donker en op kamertemperatuur.

5. Morfologische en optische karakterisering

1. Bereid 1% Triton door: voeg 5 ml Triton X-100 toe aan 500 ml PBS (1x, pH 7,4) en roer met een magnetische roerstaaf tot homogeen¹⁴.
   OPMERKING: Triton X-100 zeer stroperig. Als u een standaard luchtverplaatsingspipet gebruikt, wees dan voorzichtig bij het hanteren. Adem het volume langzaam op en laat het vallen en wacht tot het resterende volume de bodem van de pipet bereikt. Zorg ervoor dat vloeistof zich niet vastklampt aan de buitenkant van de pipetpunt bij het overbrengen van volumes door langzaam te bewegen.
2. Bereid druppeltjes voor (stap 4). Als microbubbels ook worden gekarakteriseerd, verzamel dan een klein volume van de door de grootte geselecteerde microbubbels voorafgaand aan condensatie (stap 4.9).
3. Verklein de microbubbels of druppels op een Coulter Counter (CC) van 0,2 tot 6 μm om grootteverdelingen en concentraties te verkrijgen(figuur 4).
   1. Vul een schone cuvette van 20 ml met 10 ml CC-elektrolyt dat is gefilterd door een polyethersulfonmembraanfilter met een poriën van 0,2 μm. Meet het op de CC met drie runs om een basislijn te krijgen.
   2. Voeg in dezelfde CC-elektrolyt 5 μL microbubbel- of druppelmonster toe en meng voorzichtig.
      OPMERKING: 2 tot 20 μL monster kan worden toegevoegd, afhankelijk van hoe geconcentreerd het monster is.
   3. Voer het monster uit op de CC (3 runs), trek de gemiddelde basislijn af en bereken de grootteverdeling en concentratie (aantal per ml).
4. Meet de druppelabsorptie met UV-Vis-spectroscopie(figuur 5).
   OPMERKING: Figuur 5 toont alleen de 30% pyro-lipideformulering.
   1. Stel op de UV-Vis-spectrofotometer de absorptiemeting in op golflengten van 800 nm tot 300 nm met stappen van 0,5 nm en schakel basislijncorrectie in.
   2. Gebruik een zuivere cuvette van 1 cm met padlengte gevuld met PBS en voer een nulmeting uit. Zorg ervoor dat het volume hoog genoeg is om het spectroscoopstraalpad te kruisen.
   3. Verdun de pyro-lipidedruppeltjes tot PBS (aanbevolen 2 μL tot 500 μL druppeltjes tot 2000 μL verdunningswaterstof) en meng door pipetteren.
      OPMERKING: DRAAI GEEN vortex anders worden de assemblages vernietigd.
   4. Breng de verdunde druppels over in een gereinigde cuvette en meet de absorptie. Wijzig indien nodig de verdunningen.
   5. Herhaal stap 5.4.1 tot en met 5.4.4, maar gebruik 1% Triton in plaats van PBS. Breng na verdunning het monster over in een afsluitbare/afgedekte injectieflacon en vortex gedurende 30 s voordat u meet.
5. Meet de fluorescentie van microbubbels of druppeltjes(figuur 6).
   OPMERKING: Figuur 6 toont alleen de 30% Pyro-lipide formulering.
   1. Stel op de fluorescentiespectrofotometer de excitatiegolflengte in op 410 nm en het emissiegolflengtebereik van 600 tot 750 nm met stappen van 1 nm.
   2. Meet de fluorescentie van het PBS-verdunningswateringswater om een basislijn te krijgen met behulp van een cuvette die compatibel is met de fluorescentiespectrofotometer.
   3. Verdun de Pyro-lipide microbubbels of druppeltjes in PBS (adviseer 0,5 μL tot 10 μL druppeltjes in 2000 μL verdunningswaterstof) en meng door pipetteren.
      OPMERKING: DRAAI GEEN vortex anders worden de assemblages vernietigd.
   4. Breng het verdunde monster over naar de gereinigde cuvette met basislijn en meet de fluorescentie. Wijzig indien nodig de verdunningen en vermijd signaalverzadiging.
   5. Herhaal stap 5.5.1 tot en met 5.5.4, maar gebruik 1% Triton in plaats van PBS. Breng na verdunning in 1% Triton het verdunde monster over naar een afsluitbare/afgedekte injectieflacon en vortex gedurende 30 s voordat u meet. Voeg voldoende volume toe om ervoor te zorgen dat bellen die door vortexing worden gegenereerd, zich boven het laserpad bevinden.
      OPMERKING: Het fluorescentiesignaal van het monster in Triton zal veel hoger zijn dan in PBS als gevolg van fluorescentie-unquenching(figuur 6).

6. Verdamping beeldvorming

1. Vul een watertank van de juiste grootte met gedeïoniseerd water en laat het 24 uur rusten om de gassen in het water in evenwicht te brengen met de atmosfeer.
2. Bereid druppeltjes voor en bewaar op ijs en in het donker tot gebruik.
3. Maak een stromingsfantoombuis van 2% agar zoals beschreven door Pellow et al.¹⁸ Dompel het fantoom onder in een tot 37 °C verwarmd waterreservoir.
4. Warm PBS op tot 37 °C en stroom door het fantoom.
5. Met een preklinisch echografiesysteem en 21 MHz lineaire arraytransducer (zie Materialentabel)lijnt u de weergave uit op het stroomfantoom, stelt u deze in op B-modus beeldvorming, stelt u de uitgangsdrukken in en legt u video's of afbeeldingen vast om basislijnen bij elke druk te verkrijgen.
6. Verdun 20 μL van de druppel tot 50 ml pbs van 37 °C en meng voorzichtig. Breng de oplossing over in een plastic spuit van 30 ml en duw de oplossing door het agarfantoom.
7. Houd dezelfde uitlijning als stap 6.5, verhoog de uitgangsdrukken totdat verdamping wordt waargenomen (heldere spikkels in het fantoom, zie figuur 7).
   OPMERKING: Figuur 7 toont het 30% Pyro-lipidedruppelmonster. Deze in de handel verkrijgbare 21 MHz lineaire array transducer is in staat om zowel beeldvormende als verdampende druppels te maken.

Resultaten

Voorgecondenseerde, door de grootte geselecteerde microbubbelmonsters(n = 3) en post-gecondenseerde druppelmonsters(n = 3) werden gedimensioneerd op een Coulter Counter (CC) met een diafragma van 10 μm. Een beperking van het diafragma van 10 μm is dat het geen deeltjes kleiner dan 200 nm kan meten, wat de gemiddelde grootte en concentratie kan vertekenen. Figuur 4 toont de maatgegevens voor elk van de pyro-lipidegehalteformuleringen. Tabel 1 toont statistieken op basis van de maatgegevens. Met behulp van een verhouding van voor- en nagecondenseerde gemiddelde diameters toonden de resultaten aan dat de 0% Pyro-lipideformulering de kleinste gemiddelde diameterverschuiving had bij 1,72 ± 0,02. De 50% Pyro-lipide formulering had de grootste gemiddelde diameter bij 2,38 ± 0,08. Het 1% Pyro-lipidedruppelmonster had de hoogste waargenomen concentratie bij (2,71 ± 0,13) × 10¹⁰ /ml, terwijl het 40% Pyro-lipidedruppelmonster de laagste waargenomen concentratie had bij (7,36 ± 0,81) × 10⁹ /ml. Dimensioneringsgegevens toonden aan dat het 10% Pyro-lipidedruppelmonster de kleinste piekdimeter had bij 261 ± 13 nm, terwijl het 50% Pyro-lipidedruppelmonster het grootste had met 390 ± 55 nm. Over het algemeen, naarmate het pyro-lipidengehalte toenam, nam de concentratie af en nam de gemiddelde diameter toe. Omdat de post-gecondenseerde monsters zijn gebaseerd op het voorloper microbubbelmonster, deed de trend zich voor voor beide soorten ultrasone contrastmiddelen. Naarmate het Pyro-lipidegehalte toenam, begon zich een microbubbelsubpopulatie (met een piekgrootte van ongeveer 2000 μm) te vormen. Deze secundaire piek was niet aanwezig in het 0% Pyro-lipide microbubbelmonster en het meest duidelijk in de 40% en 50% Pyro-lipide populaties.

Figuur 5 toont representatieve absorptiemetingen van het 30% Pyro-lipidedruppelmonster. De piek van het intacte monster in PBS was 700 nm, terwijl het verstoorde monster in Triton de piek naar 671 nm verschoof. Dit toonde aan dat de intacte assembles verschillende optische eigenschappen hebben in vergelijking met de individuele, niet-gemonteerde lipidecomponenten.

Figuur 6A toont representatieve fluorescentiemetingen van het voorgecondenseerde microbubbelmonster, terwijl figuur 6B post-gecondenseerd druppelmonster met 30% pyrolipide toont. Het intacte monster in PBS had een fluorescentiepiek bij 704 nm, terwijl de verstoorde vorm een piek had bij 674 nm. Het aftrekken van het verstoorde gebied onder de curve met het intacte gebied onder de curve en het delen van het verschil door het verstoorde gebied onder de curve geeft de blusefficiëntie, die uitkomt op respectievelijk 98,61% en 98,07% voor het 30% Pyro-lipide microbubbelmonster en druppelmonster.

Om te demonstreren dat druppels worden omgezet in microbubbels, werden verdunde druppels in beeld en verdampt in een 37 °C stromingsfantoom met een echografiesysteem. Figuur 7 toont representatieve echografiebeelden van het 30% Pyro-lipidedruppelmonster afgebeeld bij verschillende drukken. Bij lage drukken (figuur 7A )was er zeer weinig signaal, alleen achtergrondsignaal van luchtbellen die vastzaten aan de agarsynthese. Dit komt omdat druppeltjes niet-echogeen zijn en geen echografie verspreiden. Bij een iets hoog vermogen werden enkele microbubbels gegenereerd (figuur 7B) zoals blijkt uit het verschijnen van heldere spikkels. Naarmate de druk toenam, werden meer microbubbels gegenereerd(figuur 7C en 7D). Dit toonde ook aan dat de druppeltjes niet spontaan zullen verdampen bij 37 °C.

Figuur 1: Afbeeldingen van de stappen om de 30% Pyro-lipide oplossing te vormen. A) Lipidepoeder plus Pyro-SPC in chloroform. B) Oplossing voor oplossen toegevoegd. C)Lipidefilm gedroogd en gecoat op de binnenwand van de injectieflacon. D)Lipide injectieflacon gewikkeld in aluminiumfolie (buitenfolie afgeplakt voor hergebruik). E)Gehydrateerde lipide-oplossing. F) Lipide-oplossing in serum injectieflacon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De 10-manifold gaswisselaar. De kleppen waarnaar in het protocol wordt verwezen, zijn gelabeld. Zie Aanvullend bestand "Andere protocollen en gegevens" voor instructies over het monteren van de gaswisselaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: A) De lipide-oplossingen van de 7 formuleringen (0% tot 50% Pyro-SPC) in monsterflacons. Figuren B tot en met D tonen beelden van de stappen die zijn genomen om 30% Pyro-lipidedruppeltjes te maken. B)30% pyro-lipide-oplossing in een injectieflacon met monster. C) Post-agitatie. D) 15 min grootte-geselecteerd. E) Onderste partitie overgebracht naar decafluorbutaan injectieflacon. D) Postcondensatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Coulter Counter (CC) dimensioneringsgegevens van de grootte-geselecteerde microbubbel- en druppelmonsters met verschillende Pyro-lipide shell inhoud (n = 3). De ononderbroken groene lijnen vertegenwoordigen microbubbels en de gestippelde cyaanlijnen vertegenwoordigen druppels. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H)De totale waargenomen concentraties van microbubbel- en druppelmonsters uit de CC op basis van het Pyro-SPC-gehalte in de schaal. Alle foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Alle metingen werden uitgevoerd met een diafragma van 10 μm met een groottebereik van 200 nm tot 6000 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie absorptiemetingen van 300 tot 800 nm van het post-gecondenseerde 30% Pyro-lipide druppelmonster verdund in PBS en in 1% Triton. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Representatieve fluorescentie-emissie van 600 tot 750 nm geëxeteerd bij 410 nm. A) Grootte-geselecteerde, voorgecondenseerde 30% Pyro-lipide microbubbelmonster in PBS en in 1% Triton. B) Post-gecondenseerd 30% Pyro-lipidedruppelmonster in PBS en in 1% Triton. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Representatieve echografiebeelden van een 37 °C agar flow fantoom genomen met een preklinische 21 MHz lineaire array transducer in B-modus (zie Materialen tabel). De linkerkolom(figuren A, C, EenG) toont PBS-besturingselementen. De rechterkolom(figuren B, D, Fen H)toont 20 μL nagecondenseerd 30% pyro-lipidedruppelmonster verdund tot 50 ml van 37 °C PBS. Elke rij vertegenwoordigt vrije veld piek negatieve drukken, die werden geschat op basis van het werk gedaan door Sheeran et al.⁸ De gele driehoeken geven de focusdiepte aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methode	Agent	Pyro Shell %	0	1	10	20	30	40	50
CC	Bellen	Conc. [/ml]	(2.76 ± 0.28) × 10^10	(3.04 ± 0.15) × 10^10	(2.02 ± 0.11) × 10^10	(1.91 ± 0.22) × 10^10	(1.47 ± 0.05) × 10^10	(8.47 ± 0.95) × 10^9	(9.89 ± 0.15) × 10^9
CC	Bellen	Piek [nm]	329 ± 6	297 ± 15	305 ± 21	273 ± 14	310 ± 40	266 ± 33	393 ± 89
CC	Bellen	Gemiddelde [nm]	609 ± 2	603 ± 15	635 ± 6	690 ± 8	812 ± 1	935 ± 22	950 ± 55
CC	Bellen	Mediaan [nm]	450 ± 6	421 ± 6	414 ± 6	432 ± 5	490 ± 2	596 ± 37	695 ± 41
CC	Druppeltjes	Conc. [/ml]	(2.18 ± 0.07) × 10^10	(2.71 ± 0.13) × 10^10	(1.75 ± 0.18) × 10^10	(1.72 ± 0.13) × 10^10	(1.09 ± 0.01) × 10^10	(7.36 ± 0.81) × 10^9	(7.38 ± 0.28) × 10^9
CC	Druppeltjes	Piek [nm]	292 ± 0	297 ± 17	261 ± 13	280 ± 9	268 ± 17	287 ± 38	390 ± 55
CC	Druppeltjes	Gemiddelde [nm]	353 ± 5	350 ± 5	347 ± 1	347 ± 4	397 ± 1	399 ± 6	400 ± 7
CC	Druppeltjes	Mediaan [nm]	318 ± 4	318 ± 4	310 ± 1	315 ± 2	340 ± 0	367 ± 5	370 ± 9

Tabel 1: Maatgegevensstatistieken van de microbubbel- en druppelmonsters met verschillende Pyro-SPC-inhoud van Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle fouten duiden op standaarddeviatie.

Aanvullende informatie - Lipid Formula Sheet: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende informatie - Andere protocollen en gegevens: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Na het toevoegen van alle lipidecomponenten samen (stappen 1.2 en 1.4.5, figuur 1A),werd een oplossing van chloroform en methanol (en water als fosfatidische zure lipiden zoals DSPA aanwezig zijn) toegevoegd om ervoor te zorgen dat de pyro-lipide en niet-pyrolipidecomponenten volledig werden gehomogeniseerd (stap 1.5, figuur 1B). Om de vorming van lipidenblaasjes met heterogene lipidesamenstelling te voorkomen, werden de opgeloste lipiden gedroogd en als een dunne film op de binnenkant van de wand van de injectieflacon gecoat (figuur 1C). De coating (stap 1.6) maakt ook de hydratatie (stap 2.1 tot 2.4) gemakkelijker omdat het het oppervlak van de gedroogde film vergroot. Het drogen (stap 1.6, figuur 1C)en het stofzuigen (stap 1.8, figuur 1D)werden gedaan om ervoor te zorgen dat de chloroform en methanol volledig verdampt waren, omdat deze chemicaliën de vorming van microbubbels kunnen verstoren. Hoewel het protocol kan worden verkleind om lipide-oplossingsvolumes zo laag als 1 ml te maken, kunnen grotere volumes de variatie tussen injectieflacons en flacons verminderen. Hoewel dit het risico kan lopen de Pyro-SPC te degraderen terwijl deze niet in gebruik is, was de opslagconditie van de lipide-oplossing (stap 2.9 tot 2.10) bedoeld om dat risico te verminderen. De ontgassingsstap met de gaswisselaar (Stap 2.9.2, Figuur 1F en Figuur 2) dient om zoveel mogelijk zuurstof te elimineren om oxidatie te voorkomen. Het wordt niet aanbevolen lipideoplossingen die porfyrine-lipiden bevatten op te slaan terwijl atmosferische gassen nog steeds in de oplossing zijn opgelost(figuur 1E).

In stap 2.10 bevindt de lipideoplossing zich in een serumflacon met een hoofdruimte onder druk, vergelijkbaar met hoe de klinisch goedgekeurde ultrasone contrastmiddel perflutren lipidemicrosferen worden verkocht (vergelijkbaar met figuur 1F). Intern werk heeft aangetoond dat stabiele microbubbels niet konden worden gegenereerd via mechanische agitatie met de aanwezigheid van Pyro-lipiden als de dop een zacht materiaal was zoals de rubberen stop. Daarom werd de lipide-oplossing overgebracht naar een monsterflacon met een niet-rubberen fenolische dop (stappen 4.1 tot 4.4, figuur 3A en 3B). Wanneer het decafluobutaangas in de injectieflacon van het monster werd gestroomd (stappen 4.1 tot en met 4.4), moet het dichtere decafluorbutaan de atmosferische lucht in de kopruimte van de injectieflacon van het monster verplaatsen. Momenteel is het onbekend waarom Pyro-lipiden geen microbubbels kunnen vormen met rubberen stoppen. Zonder Pyro-lipiden kunnen stabiele microbubbels direct in de serumflacons worden gemaakt met rubberen stoppen^4,7. Daarom wordt aanbevolen om de gaswisselaar te gebruiken om de serumflacon te ontgassen en opnieuw onder druk te zetten en vervolgens de serumflacon zelf te roeren voor niet-pyrolipideformuleringen^4,5,6,7 (zie "Andere protocollen en gegevens"). Het voordeel van het mechanisch kunnen roeren in de serumflacon is dat de headspace onder druk kan worden gezet en dat de grootteselectie kan worden gedaan door de serumflacon ondersteboven om te keren⁸. In dit protocol werd de 0% Pyro-lipide formulering overgebracht naar een monsterflacon (stappen 4.1 tot 4.4) om consistent te zijn met de formuleringen die pyrolipiden bevatten. Bovendien resulteren langere acyl lipide ketenlengtes in stabielere druppels door betere van der Waals interacties¹⁹. De samenstelling van de lipideschaal werd gekozen op basis van wat in de handel verkrijgbaar was, 18-acylketenlengte voor alle lipidetypen. DSPE-PEG5K werd opgenomen in alle formuleringen (stap 1.1) omdat de aanwezigheid van de polyethyleenglycolketens coalescentie van structuren via afstotende sterische krachten voorkomt¹⁹. Tijdens lipidenhydratatie werd het badsonapparaat ingesteld op 70 °C (stap 2.1) zo hoog genoeg om de lipidefilm met een lengte van 18 acylketens volledig te verspreiden¹⁸. Voor langere acylketenlengtes zijn hogere temperaturen vereist.

Hogere pyro-lipidebelasting zou de concentratie van optisch absorberende en fluorescerende componenten verhogen, wat gewenst kan zijn voor bepaalde toepassingen die profiteren van een maximale porfyrinebelasting. Naarmate het pyrolipidengehalte echter toenam, nam de waarneembare druppelconcentratie af en namen de diameters toe(figuur 4 en tabel 1). Dit illustreert een afweging tussen optische fluorescentie en absorptie-eigenschappen versus druppelconcentratie en diameter. Voor onderzoekers die prioriteit moeten geven aan kleine diameters voor in vivo accumulatie door kleine lekkende vaten of als een hoge concentratie druppels moet worden geïnjecteerd, is het verhogen van de pyro-lipidebelasting mogelijk niet de moeite waard om de druppeldimeter of de druppelconcentratie te verlagen. Als hoge druppelconcentraties en/of kleine druppeldiameters van het grootste belang zijn, moeten begeleidende diagnostische middelen van vergelijkbare grootte worden overwogen in plaats van pyrolipiden. Hoewel 1% pyro-lipidedruppels niet leidden tot een afname van de concentratie of toename in grootte, kan de pyro-lipidebelasting van 1% te laag zijn om redelijkerwijs fluorescerend te kunnen worden gedetecteerd vanaf de weefselachtergrond. De flexibiliteit van porfyrinegedeelte biedt echter meerdere opties voor functionalisatie die alternatieve manieren van kwantificering zullen bieden die meer geschikt zijn voor toepassingen met een lage concentratie. Pyro-lipiden kunnen bijvoorbeeld worden gechelateerd met koper-64 voor positonemissietomografie beeldvorming en gammatelling²⁰, of met palladium voor trace-metaal kwantificering met behulp van massaspectrometrie, of met mangaan voor magnetische resonantie beeldvorming¹⁴.

Hoewel sommige experimenten slechts een klein volume van de druppeloplossing vereisen, is 1 ml lipide-oplossing nodig om de injectieflacon met het monster van 1,85 ml te vullen. Goertz et al. toonden aan dat veranderingen in hantering, headspace-druk, vloeistof-tot-gasverhouding en zelfs de vorm van de injectieflacon allemaal van invloed kunnen zijn op microbubbelpopulaties¹⁷. De temperatuur van de injectieflacon tijdens het roeren en de grootteselectie kan ook van invloed zijn op de grootteverdeling. Daarom is het voor de methoden die door de eindgebruiker zijn geoptimaliseerd, van cruciaal belang om zo consistent mogelijk te zijn bij het maken van druppels. Ongeopende druppels kunnen worden ingevroren (-20 °C) en later worden ontdooid voor toekomstig gebruik, maar dit zal van invloed zijn op de grootte van populaties.

De agitatieprocedure die een lipide-oplossing in microbubbels activeert, produceert geen morfologisch homogene populatie (stap 4.6); in plaats daarvan is het monster gevuld met microbubbels, multilamellaire blaasjes, liposomen en micellen^18,21,22. Terwijl microbubbelgroottes het micron- en nanometerbereik overspannen, liggen de andere structuren grotendeels onder 800 nm ²³. De gebruikte dimensioneringstechnieken maken geen onderscheid tussen deze verschillende structuren, en daarom moeten de nageroerde microbubbelmonsters (stap 4.6, figuur 3C)en de nagecondenseerde druppelmonsters (stap 4.14, figuur 3F) als mengsels worden aangenomen. De echo-ongevoelige assemblages (multilamellaire blaasjes, liposomen en micellen) zijn waarschijnlijk geconserveerd na condensatie en zullen niet van grootte veranderen omdat ze geen fasewisselbare kernen hebben. Aangezien de Coulter Counter geen onderscheid kan maken tussen deze verschillende supramoleculaire assemblages, moet de verschuiving in populatiegrootte na condensatie worden geïnterpreteerd met de veronderstelling dat een deel van de nanoschaalstructuren onoverwinnelijk is en bijdraagt aan de waargenomen populatie in dat groottegebied. Bovendien dragen deze structuren bij aan de spectroscopische en fluorescerende handtekeningen van deze monsters¹⁴. De fluorescentie- en absorptiehandtekeningen van micellen, liposoom / blaasjes en druppels zijn allemaal vergelijkbaar, inclusief hun mate van fluorescentie doven¹⁴. Het is dus belangrijk om te overwegen dat er een mengsel van samenstellingen is in de figuren 3C tot en met 3F, figuur 4,het pbs-verdunde monster in figuur 5en het pbs-verdunde monster in figuur 6.

Na het selecteren van de grootte en voorafgaand aan de condensatie (stap 4.9), is het mogelijk om de niet-bubbelassemblages te elimineren door het microbubbelmonster te centrifugeren om de drijvende bellen te scheiden van de niet-drijvende assemblages zoals beschreven door Feshitan et al.²¹ De mate van scheiding kan worden geregeld door de spinkracht en -duur aan te passen. Experimenten met microbubbelcondensatie van dergelijke grootte-geïsoleerde monsters onthulden echter dat het gebruik van de grotere voorlopermicrobubbelpopulaties die worden geselecteerd met behulp van grootte-isolatieprocedures grotere druppels opleverde (zie "Andere protocollen en gegevens" Stap S5 voor post-gesponnen bubbel- en druppelgrootte). Aangezien een beoogde toepassing van druppels geproduceerd met dit protocol een platform is voor passieve extravasatie en accumulatie vanwege hun kleine omvang in vergelijking met microbubbels^4,8, druppelpopulaties die zo klein mogelijk zijn, waren gewenst. Dit protocol gebruikte dus post-geagiteerde microbubbelmonsters die niet op grootte werden geïsoleerd via centrifugatie, zelfs als dat betekende dat echo-ongevoelige micellen, liposomen en blaasjes aanwezig waren in de uiteindelijke oplossing. Dit impliceert wel dat kwantificeringsprocedures voor biodistributie signaal zullen afleiden voor alle geïnjecteerde structuren en niet beperkt zijn tot alleen de druppels. Aangezien deze structuren van vergelijkbare grootte zich echter hoogstwaarschijnlijk ophopen via een passief mechanisme dat voornamelijk wordt gedicteerd door de grootte, wordt niet vermoed dat dit de belangrijkste gevolgtrekkingen zou moeten veranderen die kunnen worden gemaakt als dit platform in vivomoet worden gebruikt , hoewel al deze aspecten individueel moeten worden overwogen, afhankelijk van de context waarin het platform kan worden gebruikt. Tests met experimentele armen met en zonder echografie kunnen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het de echogevoelige druppels zijn die verantwoordelijk zijn voor eventuele veranderingen in de bioverdeling, omdat alleen de perfluorkoolstofkernassemblages in de oplossing reageren op echografie.

Na agitatie werd de injectieflacon gedurende 15 minuten uitgerust en werd een partitie waargenomen in de injectieflacon(figuur 3C versus 3D). Grootteselectie via drijfvermogen is een eenvoudige methode om de grotere structuren / bubbels uit een geactiveerde microbubbeloplossing^{te elimineren 8,17}. In dit geval werden deeltjes met een diameter van meer dan 5 μm meestal verwijderd na grootteselectie(figuur 4). De mate van grootte-selectie kan worden afgestemd door de duur van de maatselectie¹⁷te regelen. Sheeran et al. hebben aangetoond dat het niet selecteren van de grootte kan resulteren in gegenereerde microbubbels die vasculatuur^{afsluiten 8}.

Perfluorkoolwaterstoffen hebben het voordeel dat ze biologisch inert zijn⁷. Hoewel het kookpunt van decafluorbutaan -1,7 °C is, boven de lichaamstemperatuur, verdampen de druppels niet onmiddellijk bij blootstelling aan 37 °C(figuur 7B). Omdat de druppels meta-stabiel zijn bij 37 °C, is extra akoestische energie nodig om de druppels te verdampen tot microbubbels^7,9. Poprosky et al. hebben porfyrinedruppeltjes aangetoond die gecondenseerd zijn via druk²². Dit is een haalbare en zelfs essentiële methode bij het gebruik van minder dichte perfluorkoolwaterstoffen, maar hoge drukken kunnen sommige bellen in het proces vernietigen. Octafluorpropaan (C₃F₈) heeft een kookpunt van -36,7 °C, dus zowel koeling als overdruk is nodig voor druppelcondensatie. De lichtere perfluorkoolstof leidt echter tot minder stabiele druppels. Dodecafluoropentane (C₅F₁₂) kan leiden tot stabielere druppels met een kookpunt van 28 °C. Het is echter een vloeistof bij kamertemperatuur en heeft sterkere akoestische energieën nodig om te verdampen. De keuze van het bevattende gas van het ultrasone contrastmiddel moet dus rekening houden met de omstandigheden van de beoogde biologische toepassing ervan, naast de parameters van de fabricage. In dit protocol werd het isopropanolbad voor condensatie ingesteld op -15 tot -17 °C (stap 4.7.1 en stap 4.13), terwijl andere protocollen -10 °C ^5,6. Zelfs met een gemeenschappelijke decafluorbutaankern kan de condensatietemperatuur variëren, afhankelijk van de samenstelling van de hulpstof, de totale lipidenconcentratie en de samenstelling van de lipideschil. Als u andere formuleringen gebruikt, kan optimalisatie nodig zijn om een goede druppelcondensatie te garanderen zonder dat de oplossing bevriest.

Omdat de druppels kleiner en stabieler zijn dan hun microbubbelvoorloper⁷, kunnen ze beter profiteren van passieve accumulatiemechanismen om te extravaseren in bepaalde weefsels van belang, zoals de verbeterde permeabiliteit en het retentie-effect van bepaalde tumortypen^4,24. Met fluorescerende, optisch absorberende en akoestische detectiemethoden¹⁴is het mogelijk om een enkele formulering te gebruiken om de opname te kwantificeren. Bovendien kan dit platform worden gebruikt om te onderzoeken of de akoestische verdamping van druppels de geleverde agentfractie kan verbeteren boven passieve niveaus¹⁶. Om de biodistributie van het middel in weefsels en organen van belang na injectie te kwantificeren, moet een bekende hoeveelheid pyro-lipidedruppeltjes in het dier worden geïnjecteerd, kan echografie al dan niet worden toegepast afhankelijk van de controleset, moet het dier een vooraf gespecificeerd tijdstip worden opgeofferd en moeten de organen worden verwijderd en gewogen. De organen moeten worden gehomogeniseerd, gefilterd, verdund in oppervlakteactieve stof (detergent) om het weefsel te decellulariseren en gekwantificeerd met fluorescentie of UV-Vis-spectroscopie om geïnjecteerde dosispercentages per orgaanmassa te verkrijgen op basis van de Pyro-signalen. Voor stap 5.4.5 (figuur 5) en stap 5.5.5 (figuur 6) werd Triton X-100 oppervlakteactieve stof (detergent) gebruikt om de monsters te verstoren, omdat deze niet-fluorescerend is bij 410 nm en de absorptiegolflengten niet overlappen met die van Pyro.

Microbubbels werden niet gekenmerkt door UV-Vis absorptie. Omdat de laserbron van de UV-Vis-spectroscoop parallel loopt aan de detector, kunnen grote bellen licht van de detector verstrooien, waardoor ze optisch absorberender lijken¹⁴. In tegenstelling tot de UV-Vis spectrofotometer staat/moet de detector van de fluorescentiespectrofotometer loodrecht op de laserbron staan/moeten staan om te voorkomen dat de bron de detector verstoort. UV-Vis werd gebruikt om de absorptie van de intacte en verstoorde druppelmonsters te kwantificeren (stap 5.4, figuur 5). 300 tot 800 nm werd gekozen als de absorptiegolflengten omdat de twee belangrijkste absorptiebanden van pyro-lipide, de Soret-band (340 tot 500 nm) en de Q-band (640 tot 730 nm), binnen dit bereik^{vallen 14}. Bij montage in een druppel (of andere supramoleculaire structuren) is de Q-band piek van Pyro-lipide rood verschoven van 671 nm naar 700 nm(figuur 5). Wanneer deze supramoleculaire structuur wordt verstoord door een oppervlakteactieve stof zoals Triton, verschuift de piek terug naar 671 nm^14,15. Op basis van deze verschuiving is het mogelijk om te zien of de Pyro-lipiden zich in een geassembleerde toestand of in een verstoorde toestand bevinden. De verhouding van de twee pieken kan worden gebruikt om het verval van de assemblages in de loop van de tijd te schatten.

Voor de fluorescentiemetingen (stap 5.5, figuur 6)werd een excitatiegolflengte van 410 nm gekozen omdat deze overeenkomt met de soretbandpiek voor niet-gemonteerd pyrolipide^14. Een emissiegolflengtebereik van 600 tot 800 nm werd geselecteerd omdat de pieken van de intacte assemblages in PBS en verstoorde Pyro-lipiden in Triton zich binnen dit bereik bevinden. De verschuiving en toename van fluorescentie (figuur 6) tussen de intacte (704 nm in PBS) en verstoorde (674 nm in Triton) monsters vond plaats als gevolg van structuur-geïnduceerde blussing. In de geassembleerde vorm werden de Pyro-lipidemoleculen dicht op elkaar gepakt, zodat gegenereerde fotonen werden geabsorbeerd door nabijgelegen Pyro-lipidemoleculen. Dit is duidelijk te zien in de intacte versus verstoorde blusefficiëntie. Het is dus noodzakelijk om monsters te verdunnen in oppervlakteactieve stof (wasmiddel) zoals 1% Triton X-100 om het blussen te verlichten en het signaal voor biodistributiekwantificering te maximaliseren¹⁴.

Voor de eenvoud werd dezelfde lineaire array ultrasone transducer gebruikt om zowel te verdampen als in beeld te brengen (stappen 6.5 en 6.7, figuur 7). Deze ultrasone transducer (Table of Materials) was in staat om de nodige piek negatieve drukken te bereiken die nodig zijn om druppels te verdampen⁸. Het vullen van een tank met gedeïoniseerd water uit een kraan genereert gassen die in het water worden opgelost (stap 6.1). Om interferentie van de opgeloste gassen in het water met verdamping en beeldvorming te minimaliseren, werd het water gedurende 24 uur in de tank rusten om de gassen in het water in evenwicht te brengen met de atmosfeer (stap 6.1). Als alternatief kan het gedeïoniseerde water worden ontgast met een voldoende grote, afsluitbare container die is aangesloten op een voldoende krachtig vacuüm. De echografiebeelden toonden aan dat de microbubbels met succes werden gecondenseerd omdat de druppels niet waarneembaar / niet-echogeen waren bij lage druk(figuur 7B). Het was alleen bij hogere uitgangsdrukken dat de druppels verdampten tot waarneembare, echogene microbubbels(Figuur 7D,7F, 7H). Hoewel het post-gecondenseerde druppelmonster micellen en liposomen / blaasjes bevat, zijn deze assemblages niet-echogeen en kunnen alleen druppels verdampen tot echogene microbubbels. Een PBS-controle werd door het fantoom gestroomd om basisbeelden vast te stellen(figuren 7A, 7C, 7E, 7G). Naarmate de druk in de PBS toenam, werd er geen contrast gegenereerd. Dit gaf aan dat de hoge drukken van de transducer alleen in een medium op waterbasis geen spontane cavitatie konden veroorzaken, en dus kon alle andere gegenereerde contrast worden toegeschreven aan het gebruikte ultrasone contrastmiddel. Als de uitgangsdruk te hoog is, kunnen gegenereerde microbubbels worden vernietigd. Door de druk stapsgewijs te verhogen en het gegenereerde contrast te observeren, kan de optimale druk worden gevonden⁸. De circulatiehalfwaardetijd van de druppels kan op een vergelijkbare manier worden bepaald door de druppels met bepaalde tijdsintervallen te verdampen en het contrast te observeren dat in de loop van de tijd wordt gegenereerd⁷.

Samenvattend werden multimodale faseveranderingsdruppels met variërend Pyro-lipidegehalte gecreëerd met de condensatiemethode. Sizing toonde aan dat er een trade-off was tussen Pyro-lipide lading en microbubbel/ druppel concentratie. Karakteriseringen toonden aan dat er verschillen waren in intacte en verstoorde vormen in zowel absorptie als fluorescentie. Echografie toonde aan dat druppels niet-echogeen waren bij 37 °C en verdampt waren tot echogene microbubbels bij voldoende druk. Karakteriseringen toonden ook het potentieel voor Pyro-lipidedruppels om begeleidende diagnostische middelen te vervangen voor druppelbiodistributie- of accumulatietests. Toekomstig werk zal in-oplossing verdampingsdrempels, in-oplossing stabiliteit en in vivo circulatieduur bij naakte muizen onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880220	Ook bekend als "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	855775	Ook bekend als "DSPC"
Aluminum Foil	Elk merk
Aluminum Seals, Tear-Off	VWR	16171-840	Standaard Aluminium, 13 mm buitendiameter
Bath Sonicator	Elk merk		Capabel van  soniceren en verwarmen tot 70 °C,
Bio-Stor Screw Cap Vials	National Scientific	BS20NABP	Kunststof, 2 mL met rand, met O-ring
Borosilicate glass clear serum vials	VWR	16171-285	3 mL, 7 mm binnenmonddiameter, 13 mm buitenmonddiameter
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap	VWR	66011-020	1,85 mL, korte vorm, 12 mm buitendiameter, 35 mm hoogte, 8-425 dopformaat
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap	Elk merk		Groottes zijn afhankelijk van gewenste volumes
Chloroform	Elk merk
Coulter Counter Elctrolyte Diluent	Elk merk		Compatibel met Coulter Counter
Decafluorobutane (C4F10)	FluoroMed	355-25-9
Deionized Water	Elk merk
Dry Ice (Carbon Dioxide)	Elk merk
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer	Elk merk		Capabel van temperatuurcontrole
E-Z Crimper, 13 mm	Wheaton	W225302	13 mm Standaard Aluminium Seals
E-Z Decapper, 13 mm	Wheaton	W225352	13 mm Standaard Aluminium Seals
Fluorescent Spectrophotometer	Elk merk		Capabel van 400 tot 600 excitatie en 300 tot 800 nm emissiedetectie, detector loodrecht op laserbron
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette	Elk merk		Kan minimaal 2 mL bevatten, capabel van 300 tot 800 nm, alle vier de zijden zijn  optische ramen
Gas Exchanger	In-house gemaakt		Zie Aanvullende Informatie - "Andere Protocollen en Gegevens" voor montage-instructies.
Glass syringes	Elk merk		Groottes zijn afhankelijk van gewenste volumes
GLWR Custom Aperture Tube 10 um	Beckman Coulter	B42812	10 µm opening, compatibel met Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol	Elk merk
Insulated Styrofaom containers with lids	Elk merk
Isopropanol	Elk merk
Lyophilization-Style Rubber Stoppers	VWR	71000-060	7 mm binnenmonddiameter, 13 mm buitenmonddiameter, 2-poot, Chlorobutyl
Membrane Diaphram Vacuum Pump	Sartorius Stedim	16694-1-60-06	Instelbare druk
Metal Tongs	Elk merk
Methanol	Elk merk
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer	VisualSonics		21 MHz, Capabel van B-modus en niet-lineaire beeldvorming.
MultiSizer 4e	Beckman Coulter		Capabel van meting van 0,2µm tot 6 µm
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	567-0010	Polyethersulfone (PES) membraan, 0,1μm poriegrootte, 1000 mL volume. Aangezien Isoton II niet steriel is, kan Filter units meerdere keren worden gebruikt
Needles, Conventional	BD	305176	20 gauge, 1,5 inch lengte
Nitrogen Gas	Elk merk		Zorg ervoor dat er regelkleppen en buizen zijn om de stroom te leiden. Instelling is afhankelijk van merk en bron.
Parafilm	Elk merk		Geroep "wasfilm" in het protocol.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Elk merk		1X, 7,4 pH
Pipette	Elk merk		Groottes zijn afhankelijk van gewenste volumes
Pipette Tips	Elk merk		Groottes zijn afhankelijk van gewenste volumes
Plastic Syringes	Elk merk		1 mL, 3 mL, en 30 mL. Met Luer Lock verbindingen
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter	Elk merk		0,2 µm poriegrootte
Propylene Glycol	Elk merk
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine	In-house gemaakt		Ook bekend als "Pyro-SPC". Zie "Aanvullende Informatie - Andere Protocollen en Gegevens" voor synthese.
Thermometer	Elk merk		(-20 tot 100 °C)
Triton X-100	Elk merk		Ook bekend als "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)fenoxy]ethanol"
Ultrapure Water	Elk merk		Type 1 Zuiverheid
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer	Elk merk		Capabel van absorptie van 300 tot 800 nm, minimaal 0,5 nm resolutie
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length	Elk merk		Kan minimaal 2 mL bevatten, capabel van 300 tot 800 nm
Vacuum Desiccator	Elk merk
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform	VisualSonics		Pre-klinisch echografie beeldvormingssysteem
Vialmix	Bristol-Myers-Squibb		Geroep "mechanische agitator" in het protocol. Agiteerd ge