Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een betaalbaar en efficiënt "zelfgemaakt" platform voor Drosophila-gedragsstudies en een bijbehorend protocol voor larvale mitochondriale respirometrie

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62669

⸱

24 september 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

In dit artikel

Samenvatting

We bieden protocollen voor iedereen met een "makercultuur"-geest om te beginnen met het bouwen van een flylab voor kwantitatieve analyse van een groot aantal gedragsparameters in Drosophila melanogaster, door veel van de benodigde apparatuur 3D-te printen. We beschrijven ook een respirometrieprotocol met hoge resolutie waarbij larven worden gebruikt om gedrags- en mitochondriale metabolismegegevens te combineren.

Samenvatting

Het nut van Drosophila als modelorganisme voor de studie van menselijke ziekten, gedragingen en basisbiologie staat buiten kijf. Hoewel praktisch, is Drosophila-onderzoek niet populair in ontwikkelingslanden, mogelijk vanwege het verkeerd geïnformeerde idee dat het opzetten van een laboratorium en het uitvoeren van relevante experimenten met zulke kleine insecten moeilijk is en dure, gespecialiseerde apparaten vereist. Hier beschrijven we hoe je een betaalbaar flylab kunt bouwen om een groot aantal gedragsparameters in D. melanogaster kwantitatief te analyseren, door veel van de benodigde apparatuur in 3D te printen. We bieden protocollen voor het bouwen van interne vialrekken, baltsarena's, apparaten voor locomotorische tests, enz., die kunnen worden gebruikt voor algemeen vliegenonderhoud en om gedragsexperimenten uit te voeren met behulp van volwassen vliegen en larven. We bieden ook protocollen voor het gebruik van meer geavanceerde systemen, zoals een oxygraaf met hoge resolutie, om het mitochondriale zuurstofverbruik in larvale monsters te meten, en om de associatie met gedragsveranderingen in de larven aan te tonen bij de xenotopische expressie van de mitochondriale alternatieve oxidase (AOX). AOX verhoogt de larvale activiteit en de mitochondriale lekademhaling en versnelt de ontwikkeling bij lage temperaturen, wat consistent is met een thermogene rol voor het enzym. We hopen dat deze protocollen onderzoekers, vooral uit ontwikkelingslanden, zullen inspireren om Drosophila te gebruiken om gemakkelijk gedrags- en mitochondriale metabolismegegevens te combineren, wat kan leiden tot informatie over genen en/of omgevingsomstandigheden die ook de menselijke fysiologie en ziektetoestanden kunnen reguleren.

Inleiding

Drosophila melanogaster werd meer dan 100 jaar geleden in de wetenschappelijke gemeenschap geïntroduceerd als een potentieel krachtig modelorganisme. Dat potentieel is stevig gevalideerd in verschillende gebieden van de biologische en biomedische wetenschappen, zoals genetica, evolutie, ontwikkelingsbiologie, neurobiologie en moleculaire en celbiologie. Als gevolg hiervan zijn zes Nobelprijzen voor Geneeskunde of Fysiologie toegekend aan tien Drosophila-onderzoekers die een substantiële bijdrage hebben geleverd aan ons begrip van erfelijkheid, mutagenese, aangeboren immuniteit, circadiane ritmes, reukzin en ontwikkeling1. Misschien nog belangrijker is dat D. melanogaster niet is opgehouden ons nieuwe modellen van menselijke biologie en ziekten te bieden, aangezien een snelle zoekopdracht op PubMed bijna 600 publicaties in de afgelopen 5 jaar onthult, met behulp van de zoekterm "drosophila-model" (2, vanaf februari 2021). In de VS, waar Drosophila een wijdverspreid modelorganisme is in de biomedische gemeenschap, werd ongeveer 2,2% van alle R01-onderzoeksprijzen die in 2015 door de NIH werden toegekend, toegewezen aan Drosophila-onderzoekers 3. In Brazilië daarentegen toonde een zoektocht naar momenteel gefinancierde projecten op de website van de Sao Paulo Research Foundation (FAPESP), de belangrijkste financieringsinstantie voor onderzoek op alle wetenschappelijke gebieden in de staat Sao Paulo, slechts 24 beurzen en beurzen met Drosophila als hoofdonderwerp van studie4. Rekening houdend met alle 13205 projecten die momenteel door FAPESP worden gefinancierd (5 vanaf februari 2021), vertegenwoordigen die 24 Drosophila-projecten een verhouding van minder dan 0.2% van het totale aantal projecten, wat bijna 12 keer lager is dan die van de NIH. Als we de gefinancierde projecten die gericht zijn op het bestuderen van Drosophila vanuit een ecologisch en/of evolutionair oogpunt verwijderen, en aannemen dat de resterende projecten dit organisme gebruiken als een model voor het begrijpen van menselijke biologische processen in gezondheid en ziekte, daalt die verhouding tot een schokkende ~0,1%.

In feite is een goed onderzoek gerechtvaardigd om de redenen te onthullen waarom het Drosophila-onderzoek in Brazilië/Sao Paulo niet zo belangrijk lijkt te zijn in het aantal gefinancierde projecten. Het kweken van Drosophila is niet duur 6,7,8 en is relatief eenvoudig, omdat er, in tegenstelling tot gewervelde dieren, geen toestemming van een bio-ethische commissie nodig is voor experimenten 9,10. In Brazilië is echter een goedkeuring vereist om met genetisch gemodificeerde vlieglijnen te werken11, wat een bureaucratische laag toevoegt die inherent is aan al het werk met genetisch gemodificeerde organismen. Dit zou geïnteresseerde onderzoekers er echter waarschijnlijk niet van weerhouden om een flylab te starten. We speculeren dat verkeerde informatie over de kracht van het model en over de verwachte hoge kosten die gepaard gaan met het opzetten van een flylab en het uitvoeren van zinvolle experimenten belangrijke factoren zijn bij deze beslissing. Zoals voor de meeste wetenschappelijke apparatuur en benodigdheden, moeten de juiste apparaten voor het uitvoeren van algemeen vliegonderhoud en gedragsanalyses vanuit Noord-Amerika, Europa en/of elders in Brazilië worden geïmporteerd, wat een duur en uiterst tijdrovend proces is12,13.

Onlangs is er een alternatief voor het importeren van gespecialiseerde apparaten ontstaan, aangezien 3D-printers betaalbaarder en toegankelijker zijn geworden voor iedereen, inclusief Drosophila-onderzoekers in ontwikkelingslanden. De 3D-printtechnologie is de afgelopen 10 jaar op grote schaal gebruikt door leden van de "makercultuur", die is gebaseerd op het idee van zelfvoorziening in plaats van uitsluitend te vertrouwen op door het bedrijf vervaardigde producten14. Een dergelijk idee is altijd aanwezig geweest in academische onderzoekslaboratoria over de hele wereld, dus het is niet verwonderlijk dat 3D-printers op veel plaatsen standaard laboratoriumapparatuur zijn geworden15,16. Sinds een aantal jaren 3D-printen we onder andere vliegenflesjesrekken, paringsarena's, klimtoestellen en andere apparaten, voor een fractie van de kosten van merkequivalenten. De lagere kosten voor het printen en assembleren van zelfgemaakte laboratoriumapparatuur worden klassiek weergegeven door de FlyPi, die voor minder dan € 100,00 kan worden gebouwd en dient als een licht- en fluorescentiemicroscoop die in staat is om geavanceerde opto- en thermogenetische stimulatie van de genetisch handelbare zebravis, Drosophila en nematoden15 te gebruiken. Hier bieden we een reeks protocollen voor iedereen die geïnteresseerd is om Drosophila-onderzoeker te worden (of in het uitbreiden van zijn/haar eigen bestaande flylab) om veel van het benodigde materiaal in 3D te printen. Door tijd te investeren en een beetje expertise te ontwikkelen, zal de lezer zelfs in staat zijn om de hier gepresenteerde protocollen te optimaliseren om apparaten te printen die beter zijn aangepast aan zijn/haar eigen onderzoeksbehoeften.

Een flylab is echter niet alleen een plek voor "goedkope" apparatuur, vooral niet als men van plan is gedragsanalyses te associëren met onderliggende metabole verschijnselen. We zijn ook geïnteresseerd in de rol van mitochondriën in de modulatie van Drosophila-gedragspatronen, aangezien deze organellen verantwoordelijk zijn voor de bulkproductie van ATP in de meeste weefsels via verschillende metabole routes waarvan de producten convergeren naar oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Het analyseren van het mitochondriale zuurstofverbruik als een manier om het mitochondriale metabolisme te begrijpen, vereist een oxygraaf, een geavanceerder apparaat dat helaas nog niet in 3D kan worden geprint. Omdat OXPHOS invloed heeft op vrijwel alle cellulaire processen, omdat het afhankelijk is van een reeks exergonische redoxreacties die in de cel plaatsvinden17,18, kan het zuurstofverbruik op basis van het oxideerbare substraat dat aan mitochondriën wordt geleverd, helpen onthullen of de werking van het organel oorzaak of gevolg is van een bepaald gedrag. Daarom bieden we hier ook een protocol voor het meten van het mitochondriale zuurstofverbruik in larvemonsters, aangezien we ons realiseren dat de overgrote meerderheid van de gepubliceerde protocollen gericht is op het analyseren van volwassen monsters. We tonen aan dat veranderingen in de mitochondriale ademhaling, geïnduceerd door de transgene expressie van de Ciona intestinalis alternative oxidase (AOX), leiden tot een verhoogde mobiliteit van larven onder koudestress. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan thermogenese, aangezien AOX een niet-protonpompend terminaal oxidase is dat de activiteit van OXPHOS-complexen III en IV (CIII en CIV) kan omzeilen, zonder bij te dragen aan het mitochondriaal membraanpotentieel (ΔΨm) en ATP-productie 19,20,21. Geen enkel insect, inclusief Drosophila, of gewerveld dier bezit van nature AOX 21,22,23, maar de expressie ervan in een groot aantal modelsystemen 24,25,26,27,28,29 is succesvol geweest om zijn therapeutisch potentieel aan te tonen voor aandoeningen van algemene mitochondriale ademhalingsstress, vooral wanneer veroorzaakt door CIII en/of CIV overladen. AOX verleent resistentie tegen toxische niveaus van antimycine A24 en cyanide24,25 en vermindert diverse fenotypes die verband houden met mitochondriale disfunctie 24,25,30,31,32. Het feit dat AOX-expressie het larvale gedrag en de mitochondriale functie verandert, rechtvaardigt meer diepgaande studies naar de rol van dit enzym in het metabolisme en de fysiologie van metazoaire cellen en weefsels33,34.

We hopen dat we met dit artikel kunnen helpen om het bewustzijn binnen de wetenschappelijke gemeenschap van ontwikkelingslanden zoals Brazilië te vergroten dat het gebruik van de uitstekende genetische toolset die D. melanogaster presenteert, in combinatie met efficiënte en betaalbare zelfgemaakte apparaten voor gedragsanalyses, relatief snelle basisonderzoeksgegevens kan genereren over interessante biologische processen met een aanzienlijke translationele impact, ondersteuning van toekomstige therapeutische studies in klinisch onderzoek. Het ontwikkelen van dergelijke gemeenschappelijke idealen zou grote voordelen opleveren voor drosophilisten, medische onderzoekers en de biologische en biomedische wetenschappen. Het belangrijkste is dat het de samenleving in het algemeen ten goede zou komen, aangezien overheidsfinanciering meer translationeel zou kunnen worden toegepast om ziekten bij de mens te begrijpen en te behandelen.

De protocollen die we hier leveren voor het 3D-printen van de apparaten voor een flylab zijn ontworpen voor gebruik met de RepRap 3D-printer, gebaseerd op het Prusa I3 doe-het-zelfmodel dat verkrijgbaar is bij35. We gebruiken het 1,75 mm witte polymelkzuur (PLA) filament (SUNLU) als grondstof voor het printen, het Tinkercad-platform36 voor modelontwerp en de Repetier-Host-software37 voor STL naar G-Code-conversie, een noodzakelijke stap om coördinaten aan de printer te verstrekken. Verdere optimalisatie van de protocollen is nodig als de lezer alternatieve apparatuur, materialen en software wil gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. 3D model ontwerp

OPMERKING: De workflow voor 3D-printen heeft drie basisstappen: (1) 3D-modellering; (2) het importeren van het model in de slicing-software; en (3) het selecteren van het juiste filament, het configureren van de printer en ten slotte het printen. Een basisprotocol voor het modelleren van een klein rekje/tray voor vliegenflesjes wordt hieronder weergegeven; Dit rek moet worden gebruikt met standaard vliegenflesjes, die een diameter van ongeveer 2,5 cm en een hoogte van 9,8 cm hebben. Voor nieuwe modelontwerpen maken de tools van de Tinkercad-software het mogelijk om eenvoudig driedimensionale structuren te hanteren, door stukken van verschillende vormen, maten en diktes te maken, afhankelijk van de eigen behoeften. Voor drosophilisten die zich voor het eerst op het gebied van 3D-printen wagen, kan het nog steeds een uitdaging zijn om de onderstaande protocollen te volgen, zelfs met al hun details, dus we raden ten zeerste aan om kennis te maken met de software voor de beste resultaten.

  1. Meld u aan bij Tinkercad online38 (Figuur 1A). Voorafgaande registratie met persoonlijke informatie is vereist om gratis toegang te krijgen tot het platform.
  2. Klik op Maak een nieuw project om een nieuw ontwerp te beginnen en hernoem het project dienovereenkomstig in de rechterbovenhoek van het venster. Druk op Enter om naar het werkvlak van het project te gaan (Afbeelding 1B).
  3. Controleer of het werkvlak de juiste afmetingen heeft van 200 mm x 200 mm door met de linkerknop van de muis op Raster bewerken in de rechterbenedenhoek te klikken (rood vierkant in afbeelding 1B). Zorg er in het pop-upvenster (Afbeelding 1C) voor dat de "Eenheden" millimeters zijn en dat de "Voorinstellingen" standaard zijn. Voer 200,00 in de velden "Breedte" en "Lengte" in en klik op Raster bijwerken om de wijzigingen op te slaan.
  4. Controleer of het Snap Grid is ingesteld op 1,0 mm (rood vierkant in afbeelding 1B). Als dit niet het geval is, klikt u op het vervolgkeuzemenu en selecteert u 1.0 mm.
  5. Selecteer onder het menu Basisvormen aan de rechterkant (blauw vierkant 2 in afbeelding 1B) een effen vak en sleep dit naar het midden van het werkvlak.
  6. Klik ergens op het vak in het werkvlak met de linkerknop van de muis om de randen en hoekpunten te zien. Klik op een hoekpunt (dat dan rood wordt) om de afmetingen van het vak weer te geven (rode vierkanten in Figuur 1D). Klik met de linkermuisknop op elke afmeting en typ 130 mm voor lengte (L), 130 mm voor breedte (B) en 40 mm voor hoogte (H). Centreer het vak opnieuw door het naar het midden van het werkvlak te slepen.
  7. Klik op de tool Liniaal in de rechterbovenhoek van het scherm (rood vierkant 1 in Figuur 1E). Klik onmiddellijk op het hoekpunt linksonder van het vak, zoals aangegeven in Figuur 1E (rood vierkant 2), om het beginpunt (x = 0, y = 0, z = 0) van een driedimensionaal Cartesiaans coördinatenstelsel in te stellen. Merk op dat de afstand tussen het geselecteerde hoekpunt en het beginpunt van de coördinaat nu wordt weergegeven (rode vierkanten in Figuur 1F), waarbij "A", "B" en "C" respectievelijk de afstand tot de x-, y- en z-as vertegenwoordigen (die in dit geval nul zou moeten zijn).
  8. Selecteer vervolgens een leeg (gat) vak in het menu Basisvormen aan de rechterkant (blauw vierkant 2 in afbeelding 1B) en sleep het naar het werkvlak. Stel de afmetingen in op 30 (L) x 30 (B) x 40 (H) mm en til het 2 mm van het werkvlak door "2,00" te typen in het tekstvak naast de groene pijlpunt in de rechterbenedenhoek van het lege vak (rood vierkant in afbeelding 1G). Plaats het lege vak in het ononderbroken vak op 2 mm afstand van het beginpunt van de x,y-coördinaat, door "2.00" te typen in de tekstvakken naast de groene pijlen in de linkerbenedenhoek van het vak (rode vierkanten in Figuur 1H; vergelijk met Figuur 1G).
  9. Terwijl het lege vak nog steeds is geselecteerd, drukt u op de CtrL+D-toetsen op het toetsenbord om de opdracht "dupliceren" uit te voeren en een nieuw leeg vak met exact dezelfde afmetingen te maken. Plaats het nieuwe lege vak in het effen vak, naast het eerste lege vak, door "34.00" te typen in het tekstvak naast de groene pijl langs de y-as, en "2.00" in de tekstvakken naast de twee resterende groene pijlen (rode vierkanten in Figuur 1I).
  10. Herhaal deze stap en pas de juiste afstanden vanaf het beginpunt van de coördinaat aan, totdat de hele ononderbroken doos is gevuld met lege dozen die 2 mm van elkaar verwijderd zijn (Figuur 1J).
  11. Selecteer alle vakjes (effen en lege) door met de linkermuisknop te klikken en naar het hele gebied te slepen. Druk op de CtrL+G-toetsen op het toetsenbord om de opdracht "groep" uit te voeren en een enkel vak te maken met 16 lege ruimtes voor vliegenflesjes (Afbeelding 1K). Dit is het definitieve ontwerp van het flessenrek.
  12. Klik op Exporteren in de rechterbovenhoek van het Tinkercad-venster. Selecteer in het weergegeven venster (Afbeelding 1L) Alles in het ontwerp naast Opnemen en . STL onder Voor 3D-afdrukken als het bestandstype. Kies een juiste naam voor het ontwerpbestand en sla het op een geschikte plaats op de computer op.

2. 3D afdrukken

OPMERKING: In dit gedeelte geven we instructies over het gebruik van het STL-bestand dat in stap 1 is gemaakt en het converteren naar het G-Code-bestand met de afdrukinstructies naar de 3D-printer. Dit is het slicing-proces, waarvoor we de Repetier-Host-software gebruiken.

  1. Download aanvullend bestand 1 en sla het op een geschikte plaats op de computer op. Dit is een .rcp-bestand met de printerconfiguraties die hieronder moeten worden gebruikt. Ga voor meer informatie over het .rcp-bestandstype naar39.
  2. Open de Repetier-Host-software, die al op de computer moet zijn geïnstalleerd, volgens de instructies van37. Druk op de CtrL+O-toetsen op het toetsenbord om het STL-bestand te openen op de computer die is gemaakt in Protocol 1.
  3. Eenmaal geopend, klikt u op het ontworpen injectieflaconrek en drukt u op de R-toets op het toetsenbord om het bewerkingsmenu aan de rechterkant van het scherm te openen (rood vierkant 1 in afbeelding 2A). Centraliseer het object op de afdruktafel door op de knop Object centreren , aangegeven met een rood vierkant 2 in afbeelding 2A, op het tabblad Objectplaatsing te klikken.
  4. Klik op het tabblad Slicer (rood vierkant 1 in afbeelding 2B) naast het tabblad Objectplaatsing en klik vervolgens op de knop Configuratie (rood vierkant 2 in afbeelding 2B) hieronder. Merk op dat er aan de linkerkant een nieuw venster wordt geopend waar de printerparameters zoals snelheid, laagdikte en houders kunnen worden gedefinieerd (zie meer details in de discussie hieronder).
  5. Klik op de knop Importeren (rood vierkant 3 in afbeelding 2E), selecteer Aanvullend bestand 1 uit de bestanden en druk op Enter. Merk op dat dit .rcp-bestand (gedownload in stap 2.1) de parameters bevat voor de automatische configuratie van de printer die we hebben geoptimaliseerd voor dit flaconrek.
  6. Om het configureren van de afdrukparameters te voltooien, selecteert u Geen voor ondersteuningstype in het menu aan de rechterkant (rood vierkant 4 in afbeelding 2E), aangezien voor het afdrukken van dit stuk geen ondersteuning nodig is om buigen of andere vervormingen te voorkomen. Kies bij Infill Density (rood vierkant 5 in figuur 2E) 20% om een solide structuur te creëren (zie meer details over deze parameters in de discussie hieronder).
  7. Klik op Slice met CuraEngine in de rechterbovenhoek van het scherm om het slicing-programma uit te voeren en de G-Code te genereren, die de informatie bevat die de printer nodig heeft om het stuk af te drukken. Houd er rekening mee dat onder het tabblad Afdrukvoorbeeld in het menu aan de rechterkant (naast het tabblad Slicer ) informatie wordt weergegeven over de tijd en hoeveelheid materiaal die nodig zijn om de afdruktaak te voltooien (rood vierkant 1 in afbeelding 2F).
  8. Klik op Opslaan voor SD Print om het G-Code-bestand op een SD-kaart op te slaan (rood vierkant 2 in afbeelding 2F). Merk op dat de G-Code de 3D-coördinaten van het ontworpen stuk bevat, in lagen gesneden, voor een goede werking van de printer.
  9. Plaats de SD-kaart in de RepRap 3D-printer en volg de informatie die op het printerscherm wordt weergegeven om afdrukken vanaf de SD-kaart te selecteren.
  10. Selecteer het G-Code-bestand van het rek voor injectieflacons. Houd er rekening mee dat de printer automatisch opwarmt en begint met het afdrukken van het ontworpen stuk, wat enkele uren kan duren. Het rek (Afbeelding 3A) moet direct na voltooiing van de afdruktaak klaar zijn voor gebruik.

3. Apparaten voor gedragsanalyse

NOTITIE: De stappen die worden beschreven in protocollen 1 en 2 kunnen worden herhaald met de juiste aanpassingen om meerdere van de benodigde laboratoriumapparatuur te printen. We realiseren ons echter dat het ontwerpen van nieuwe stukken uitdagend en tijdrovend kan zijn voor beginnende gebruikers van Tinkercad, dus in plaats van stapsgewijze protocollen te bieden voor het ontwerpen van alle modellen, stellen we verschillende ontwerpmodellen die we hebben gemaakt als STL-bestanden beschikbaar om te downloaden (zie aanvullende bestanden 2-11).

  1. Download aanvullend bestand 2 voor een model van een kleine trechter (Figuur 3B), routinematig gebruikt in flylabs om volwassen vliegen over te brengen naar nieuwe flesjes of flessen door te voorkomen dat vliegen langs de binnenwanden van deze containers omhoog kruipen om te ontsnappen.
  2. Download aanvullend bestand 3 voor een stootmat (Figuur 3C), die een ethyleen-vinylacetaatschuim kan bevatten of een dikke katoenen mat waarop glazen flesjes of flessen kunnen worden getikt wanneer men vliegen in nieuwe containers met vers gemaakt voedsel gooit.
  3. Download aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5 voor het model van een camerastandaard die we Stalker hebben genoemd (Figuur 3D).
    OPMERKING: Met het apparaat kan elke camera (professioneel, webcams, mobiele telefoons, enz.) op een basis worden geplaatst waar een petrischaaltje met larven of volwassen vliegen kan worden afgebeeld of op video kan worden opgenomen. Stalker maakt het mogelijk om het gedrag van dieren horizontaal in beeld te brengen, altijd op dezelfde afstand van het petrischaaltje, waardoor variabiliteit in de experimentele metingen wordt vermeden als de opnames bijvoorbeeld op verschillende dagen moeten worden gemaakt of als de camera tussen de opnames door voor een ander doel moet worden gebruikt. Het apparaat is handig modulair en kan eenvoudig worden gemonteerd na het printen van de basis en de bovenkant uit Supplemental File 4 en de zijkanten uit Supplemental File 5. De vierkanten van 1 cm2 aan de basis, die met een permanente markering kunnen worden gemarkeerd, helpen bij het bijhouden van de afstand die individuele dieren hebben afgelegd. Print het apparaat (in ieder geval de basis) met wit filament, zodat er voldoende contrast is tussen de achtergrond en de dieren voor de volgsoftware om elke vlieg te identificeren.
  4. Download aanvullend bestand 6 voor het afdrukbare ontwerp van het Fly Motel (Figuur 3E), dat tien balts- en paringsarena's (kamers) heeft die zo zijn georganiseerd dat video-opnamen van tien individuele paren tegelijk mogelijk zijn. Merk op dat het Fly Motel is gebaseerd op het apparaat dat in40 is gepubliceerd, waar een gedetailleerde uitleg voor het gebruik ervan in gedragsstudies wordt gevonden. Naast de 3D-geprinte onderdelen heeft het apparaat 12 schroeven (3 x 8 mm) nodig om het bovenste deel aan het onderste deel te bevestigen om het geassembleerde apparaat te stabiliseren, een acrylplaat (60 x 60 x 3 mm) en een ritssluiting. Omdat de structuur van het Fly Motel complexer is, bieden we ook een instructievideo (aanvullend bestand 7) over hoe het correct in elkaar te zetten, aangezien alle benodigde onderdelen en een schroevendraaier beschikbaar zijn.
  5. Download aanvullend bestand 8 voor het model van een T-Maze (Figuur 3F), dat wordt gebruikt voor geheugentests met behulp van volwassen vliegen. Een gedetailleerde uitleg van hoe het T-doolhof wordt gebruikt om vliegen weerzinwekkende geurstimuli te laten associëren met hun fototrope gedrag is te vinden in de oorspronkelijke publicatie41. Het apparaat maakt ook gebruik van twee doorschijnende conische buizen van 15 ml, die vaak in elk laboratorium te vinden zijn en zijn bevestigd aan de 2 cm brede ronde openingen aan weerszijden van het centrale stuk. Merk op dat voor het printen van de T-Maze een ondersteuning nodig is (zie meer details in de legenda bij Figuur 2). Selecteer "Overal" voor Ondersteuningstype (rood vierkant 4 in Afbeelding 2E) na het volgen van de stappen 2.1-2.6 hierboven.
  6. Download aanvullend bestand 9 en aanvullend bestand 10 voor het ontwerp van de afdrukbare onderdelen van onze versie van het apparaat voor snelle iteratieve negatieve geotaxis (RING)-assays (Figuur 3G), die worden gebruikt om klimtests uit te voeren met volwassen vliegen van verschillende genotypen of omgevingsomstandigheden tegelijkertijd, waarbij resultaten worden gegenereerd op een meer gestandaardiseerde en hogere doorvoermanier42. Het RING-apparaat is ook modulair en vereist naast de 3D-geprinte onderdelen andere onderdelen die gemakkelijk online of in een ijzerhandel tegen lage kosten kunnen worden gekocht: twee gerectificeerde assen van Φ8 x 300 mm, vier lineaire lagers van Φ8 mm, elastiekjes (of stukken van een touwtje), een stuk hout van 240 x 60 x 20 mm voor de basis, en acht houtschroeven (8 mm) om de geprinte onderdelen aan de houten basis te bevestigen. Download aanvullend bestand 11 voor instructies over hoe u het apparaat in elkaar moet zetten zodra alle onderdelen zijn afgedrukt of gekocht. Een gedetailleerde uitleg over het gebruik van het RING-apparaat is te vinden in de oorspronkelijke publicatie42.

4. Proef van de larvale mobiliteit

OPMERKING: We hebben dit protocol, oorspronkelijk gebaseerd op Nichols et al.42, geoptimaliseerd om de effecten van AOX-expressie op de ontwikkeling van Drosophila onder koudestress te bestuderen. De lijnen 3xtubAOX25 en w1118, die respectievelijk als voorbeelden van AOX-expressie en controlelarven werden gebruikt, werden gekweekt op standaarddieet24 bij 12 °C, volgens Saari et al.34. We raden dit protocol aan om de mobiliteit van larvale monsters van elke genetische aandoening te analyseren, gekweekt onder elke interessante omgevingsconditie.

  1. Bereid 2% agarplaten voor door de equivalente hoeveelheid agar in gedeïoniseerd water te koken, in petrischaaltjes van Φ90 x 15 mm te gieten en ze bij kamertemperatuur te laten stollen. Gebruik voor platen met een eindvolume van 20 ml per stuk 0,4 g agar.
  2. Verzamel voorzichtig zwervende L3-larven vanaf de zijkant van de kweekflesjes/kolven met behulp van een tang met ronde punt of een borstel en plaats de individuen minder dan 10 seconden in een petrischaal van Φ90 x 15 mm met gedeïoniseerd water om voedseldeeltjes die aan hun lichaam zijn gehecht af te spoelen.
  3. Breng de individuele larve over naar schalen met agarose en wacht 5 minuten tot de dieren zijn geacclimatiseerd.
  4. Plaats de schaaltjes met de individuele larve op een ruitjespapier(raster van 0,2 cm2) en tel het aantal lijnen dat het dier gedurende 1 minuut heeft doorkruist terwijl het zich op de agar beweegt. Elke gekruiste lijn vertegenwoordigt een afstand van 2 mm. Herhaal de procedure 10-15 keer met dezelfde persoon om technische replica's te verkrijgen.
  5. Herhaal stap 4.4 met ten minste 8-10 individuen uit verschillende buisjes/kolven, gekweekt op verschillende tijdstippen om biologische replicaten van dezelfde lijn te verkrijgen.
  6. Herhaal stap 4.4 en 4.5 om gegevens te verkrijgen voor de andere vlieglijn (of voor zoveel lijnen als men van plan is te analyseren).
  7. Dezelfde individuele larven die in de stappen 4.4-4.6 zijn gebruikt, kunnen worden gebruikt om aanvullende gegevens over lichaamsbeweging te verkrijgen door de agarschaaltjes met een individuele larve onder een stereomicroscoop te plaatsen en het aantal peristaltische samentrekkingen van de lichaamswand gedurende 1 minuut te tellen. Verkrijg technische en biologische replicaten voor een schatting van de gemiddelde mobiliteit tussen de geanalyseerde vlieglijnen.
  8. Pas de statistische test toe om de waarschijnlijkheid te berekenen dat de waarden van deze parameters voor larvale mobiliteit verschillend zijn van de interesselijnen. Omdat we hier gegevens van slechts twee regels vergelijken, kan een Student's t-test worden toegepast.

5. Mitochondriale respirometrie met behulp van larvale homogenaten

OPMERKING: Het volgende protocol is geoptimaliseerd om het mitochondriaal zuurstofverbruik te meten van larvale homogenaten van de AOX-expressielijn 3xtubAOX en de controlelijn w1118, gekweekt bij 12°C, maar we raden ook aan om het te gebruiken voor larvale monsters van genetische en omgevingsomstandigheden. We realiseren ons dat het uitvoeren van dergelijke experimenten niet mag worden opgenomen als een "betaalbaar" doel voor een "zelfgemaakt" flylab, in tegenstelling tot alle andere protocollen die we in dit artikel geven, aangezien er een aanzienlijke initiële investering moet worden gedaan voor een laboratorium om een oxygraaf met hoge resolutie aan te schaffen. Het protocol moet worden gebruikt met de Oxygraph-2k (O2k) en de DatLab-software van Oroboros Instruments, dus verdere optimalisatie is nodig als de lezer alternatieve apparatuur wil gebruiken.

  1. Zet de O2k aan en start de DatLab-software op de computer die is aangesloten op de oxygraaf. De magnetische staven in de analysekamers moeten automatisch beginnen te roeren. Verwijder de ethanolopslagoplossing uit de kamers.
  2. Was de kamers minstens 3 keer met 100% ethanol en 3 keer met ultrapuur water.
  3. In DatLab wordt het venster O2k Control automatisch geopend. Voer bij Bloktemperatuur [°C] 12 °C in (of de voorkeurstemperatuur in het bereik van 2-47 °C) en druk op OK.
  4. Een tweede venster, Experiment bewerken, wordt dan automatisch geopend. Voer voorbeeldnamen in de voorbeeldvelden in , afhankelijk van wat er in de kamers A en B wordt toegevoegd, en druk op Opslaan.
  5. Voeg 1800 μL van de analysebuffer (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2% BSA, pH 7,4) toe aan elke kamer en sluit ze gedeeltelijk, zodat er nog steeds zuurstofuitwisseling met de buitenlucht mogelijk is. Laat de zuurstofconcentratie en de zuurstoffluxsignalen stabiliseren en vertoon minimale fluctuaties gedurende ten minste 10 minuten. Deze stap zorgt voor de kalibratie van de apparatuur met de buitenlucht op de dag van het experiment (zie stap 6.3 en 6.4 hieronder voor meer informatie over experimentele kalibraties).
  6. Begin tijdens de luchtkalibratiestap met de monstervoorbereidingen door voorzichtig 20 zwervende larven van het juiste genotype uit de kweekbuisjes/kolven te verzamelen met behulp van een tang of een klein penseel.
  7. Spoel elke larve snel maar grondig af met gedeïoniseerd water of 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 en 2 mM KH2PO4) en breng ze over in een glashomogenisator op ijs van 1 ml, die 500 μL ijskoude isolatiebuffer bevat (250 mM sacharose, 5 mM Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
  8. Homogeniseer de hele larven met 5 slagen en giet het homogenaat in een microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs.
  9. Voeg 300 μL isolatiebuffer toe aan de glashomogenisator, macereer de resterende larvale weefsels verder met 3 slagen en giet het homogenaat opnieuw in dezelfde microcentrifugebuis op ijs.
  10. Voeg 200 μL isolatiebuffer toe aan de glashomogenisator, macereer de resterende larvale weefsels verder met 2 slagen en giet het homogenaat opnieuw in dezelfde microcentrifugebuis op ijs.
  11. Meng het uiteindelijke homogenaat (~1 ml) door de buis twee keer voorzichtig om te keren en bewaar deze op ijs totdat het tweede monster is verwerkt.
  12. Herhaal stap 5.6-5.11 om het larvale homogenaat van het andere genotype te verkrijgen.
  13. Open de oxygraafkamers A en B en breng 200 μl van elk homogenaat over naar de analysebuffer in elke kamer, die op dit punt precies 12 °C moet zijn. Sluit de kamers volledig en laat de zuurstofconcentratie en zuurstoffluxsignalen ongeveer 10 minuten stabiliseren.
  14. Start metingen van het zuurstofverbruik door aan elke kamer 5 μl van een oplossing van 2 M pyruvaat, 2 M proline (eindconcentratie in de kamers = 5 mM elk) en 7,5 μl van een oplossing van 0,4 M malaat (1,5 mM) toe te voegen. Wacht minimaal 5 minuten voor signaalstabilisatie. Merk op dat op dit punt de mitochondriën worden opgeladen met oxideerbare substraten om de triccarbonzuur (TCA) cyclusreacties te starten. Elke toename van het zuurstofverbruikssignaal kan te wijten zijn aan de functies van het ontkoppelen van eiwitten (of aan andere ontkoppelingsverschijnselen) en kan worden gebruikt om de algemene ontkoppelde ademhaling te berekenen (ook wel lekademhaling genoemd in afwezigheid van adenylaten, LN- zie representatieve resultaten voor details).
  15. Voeg aan elke kamer 4 μL van een oplossing van 0,5 M ADP (1 mM) toe en wacht ten minste 5 minuten voor signaalstabilisatie. Een significante toename van het zuurstofverbruikssignaal wordt meestal onmiddellijk waargenomen, wat overeenkomt met de oxidatieve fosforylatieve (OXPHOS) ademhaling. Het overgrote deel van deze OXPHOS-ademhaling wordt aangedreven door complex I (CI).
  16. Voeg aan elke kamer 2 μL van een oplossing van 0,05 M antimycine A (0,05 mM) toe om CIII te remmen en wacht ten minste 5 minuten voor signaalstabilisatie. Een afname van het zuurstofverbruikssignaal tot het basale niveau dat werd waargenomen vóór de toevoeging van pyruvaat, proline en malaat moet worden waargenomen voor het w1118-controlemonster . Mitochondriale ademhaling van larven die AOX tot expressie brengen, zal gedeeltelijk resistent zijn tegen antimycine-A, omdat de elektronen nu naar AOX kunnen worden geleid. Ongeveer 40% van de totale OXPHOS-ademhaling moet overblijven na CIII-remming, die allemaal uitsluitend door AOX moet worden ondersteund.
  17. Voeg aan elke kamer 4 μL van een oplossing van 0,1 M propylgallaat (0,2 mM) toe om AOX te remmen, en wacht ten minste 15 minuten voor signaalstabilisatie. Het zuurstofverbruik in de larvale monsters die AOX tot expressie brengen, zou nu moeten dalen tot het basale niveau van vóór de toevoeging van pyruvaat, proline en malaat. Deze afname bewijst dat de waargenomen antimycine-A-resistente ademhaling te wijten is aan de AOX-functie.
  18. Voeg aan elke kamer 1 μL 0,01 M rotenon (0,005 mM) toe om CI te remmen, en wacht ten minste 5 minuten voor signaalstabilisatie om het zuurstofverbruikssignaal van het monster te verkrijgen, onafhankelijk van mitochondriale ademhaling. Dit signaal is meestal net zo laag als het signaal dat werd waargenomen vóór de toevoeging van pyruvaat, proline en malaat.
  19. Sla het experiment op en sluit de DatLab-software.

6. Gegevensverwerking mitochondriale respirometrie

OPMERKING: Zuurstofverbruikswaarden worden verkregen als een gemiddelde van de zuurstoffluxsignalen in een bepaalde periode en worden uitgedrukt als pmol O2 die per seconde wordt verbruikt per mg totaal eiwit in het monster. De waarden worden eerst vergeleken met de maximale zuurstofconcentratie die op de dag van het experiment in de analysebuffer beschikbaar is, op basis van de experimentele temperatuur (luchtverzadiging genoemd) en de minimale zuurstofconcentratie, die eerder in elke kamer is bepaald door de toevoeging van Na2S2O4 aan de analysebuffer (zie 43 voor de richtlijnen van de fabrikant om nulzuurstofkalibratie te verkrijgen). De waarden worden ook genormaliseerd door de hoeveelheid totaal eiwit in de larvale homogenaten die wordt toegevoegd aan de analysebuffer van elke kamer.

  1. Bepaal de totale eiwitconcentratie van elk monster met behulp van de Bradford-methode44. Open het opgeslagen experiment opnieuw in de DatLab-software, druk op Experiment in het bovenste menu en vervolgens op Bewerken. Selecteer in het geopende venster mg in het gedeelte Eenheid en voer in het gedeelte Hoeveelheid de hoeveelheid eiwit in in de 200 μL van het monster dat in elke kamer is toegevoegd. De concentratie wordt automatisch berekend door de software, rekening houdend met het totale kamervolume van 2 ml. Druk op de knop Opslaan .
  2. Druk op Grafiek in het bovenste menu en vervolgens op Grafieken selecteren. Selecteer in het geopende venster Flux per massa voor beide grafieken (1 en 2, die respectievelijk verwijzen naar kamer A en B). Druk op Ok. De experimentele uitkomst wordt nu genormaliseerd door de eiwitconcentratie van de monsters (pmol O2/s/mg totaal eiwit).
  3. Klik in de rechterbovenhoek van elke grafiek (1 en 2) van de hoofdpagina met experimentele resultaten op O2 Concentratie. Identificeer langs de x-as een tijdsbereik voorafgaand aan de toevoeging van de monsters in de kamers, waarin de zuurstofconcentratie en fluxsignalen zeer stabiel zijn.
    1. Houd de Shift-toets op het toetsenbord van de computer ingedrukt, klik met de linkermuisknop op de oorspronkelijk geselecteerde tijd, sleep de cursor langs de tijdas om het gewenste gebied te selecteren en laat de muisknop los. Voer deze procedure uit voor elk van de grafieken afzonderlijk.
    2. Dubbelklik op de blauwe balken van de geselecteerde gebieden onderaan de grafieken en typ "lucht" om aan te geven dat dit de geselecteerde regio's zijn die worden gebruikt om de zuurstofluchtverzadiging te berekenen.
  4. Klik op Kalibratie in de bovenste menubalk en selecteer A: Zuurstof, O2 om kamer A te kalibreren. Controleer in het geopende venster of O2 Calib is geselecteerd (gele kleur).
    1. Klik voor de nulkalibratie op Kopiëren uit bestand en kies het bestand met de eerder uitgevoerde nulzuurstofkalibratie (zie 43 voor de richtlijnen van de fabrikant).
    2. Selecteer voor luchtkalibratie lucht in de kolom Markering selecteren . Klik op Kalibreren en kopieer naar klembord.
  5. Klik op Kalibratie in de bovenste menubalk, selecteer B: Zuurstof, O2 en herhaal stap 6.4 om kamer B te kalibreren.
  6. Klik in de rechterbovenhoek van elke grafiek (1 en 2) van de hoofdpagina met experimentele resultaten op O2 flux per massa. Selecteer de gewenste stabiele gebieden van het zuurstofverbruikssignaal door de Shift-toets op het toetsenbord ingedrukt te houden, met de linkermuisknop te klikken en de cursor langs de tijdas te slepen. De stabiele gebieden die zijn geselecteerd tussen toevoegingen van pyruvaat/proline/malaat en ADP vertegenwoordigen de LN; tussen ADP en antimycine A, OXPHOS; tussen antimycine A en propylgallaat (bij CIII-remming), antimycine A-resistente ademhaling; tussen propylgallaat en rotenon (bij CIII+AOX-remming), restademhaling; na rotenon (bij CI+CIII+AOX-remming), resterende niet-mitochondriale ademhaling. Dubbelklik op de rode balken van de geselecteerde gebieden onder aan de grafieken en voer de juiste labels in.
  7. Klik op Markeringen in de bovenste menubalk en vervolgens op Statistieken. Schakel op het tabblad Toon van het geopende venster alle opties uit, behalve O2 flux per massa. Selecteer op het tabblad Selecteren van hetzelfde venster kamer A om de ademhalingsgegevens voor het eerste monster te verkrijgen. Klik op Kopiëren naar klembord en plak de gegevens in een spreadsheet. Herhaal de procedure om de gegevens voor het tweede monster in kamer B te verkrijgen.
  8. Trek in een spreadsheet alle ademhalingswaarden af van de resterende niet-mitochondriale ademhaling (de gegevens na toevoeging van rotenon). Bereken gemiddelden van meerdere experimentele replicaten en plot de gegevens naar wens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Door de stappen in Protocol 1 en 2 te volgen, zou men in staat moeten zijn om een eenvoudig vliegenflesje rek te ontwerpen en het model STL-bestand door het slicing-programma te halen om coördinaten voor de 3D-printer te genereren. Figuur 3A toont een geprinte eenheid van het model naast het ontwerp. We hopen ook dat stap 1 de basisvaardigheden kan bieden om de basisvormen die beschikbaar zijn in het Tinkercad-platform te gebruiken om nuttige apparaten voor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier verstrekte 3D-printprotocollen en STL-bestanden zijn bedoeld om het opzetten van een nieuw flylab te vergemakkelijken of om het repertoire van apparaten in een bestaande Drosophila-gedragsfaciliteit te vergroten, met behulp van "zelfgemaakte" apparatuur. De 3D-printstrategie kan met name nuttig zijn in ontwikkelingslanden zoals Brazilië, waar onderzoek met Drosophila als modelorganisme voor het bestuderen van de menselijke biologie ondervertegenwoordigd lijkt te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We willen Emily A. McKinney bedanken voor de Engelse redactie van het manuscript. G.S.G. werd ondersteund door een fellowship van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, subsidienummer 141001/2019-4). M.T.O. wil graag de financiering erkennen van de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, subsidienummers 2014/02253-6 en 2017/04372-0), en de CNPq (subsidienummers 424562/2018-9 en 306974/2017-7). C.A.C.-L. Ik wil graag de interne financiële steun van de Universidade do Oeste Paulista erkennen. Het werken met genetisch gemodificeerde Drosophila-lijnen werd geautoriseerd door het Local Biosafety Committee (CIBio) van de Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, onder de protocollen 001/2014 en 006/2014, en door het National Technical Committee on Biosafety (CTNBio), onder de protocollen 36343/2017/SEI-MCTIC, 01200.706019/2016-45 en 5488/2017.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D Printer RapRepEen populaire 3D-printer op basis van de Prusa I3 DIY-modus, instructies verkrijgbaar op https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX vlieg lijnHowy Jacobs' lab, Tampere UniversityDrosophila lijn die het AOX-gen van C. intestinalis tot expressie brengt onder controle van de constitutieve α-tubulin-promotor. 5 en 6 kopieën van deze construct zijn respectievelijk aanwezig in mannetjes en vrouwtjes in homo/hemizigositeit, één op elk van de chromosomen X, 2 en 3.
Acrylic plaat60 x 60 x 3 mm
ADPSigma-AldrichA2754Adenosine 5’-difosfaat natriumzout (CAS-nummer 20398-34-9); >95%; molecuulgewicht = 427,20 g/mol; oplosbaarheid in water bij 50 mg/ml
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycine A van Streptomyces sp. (CAS-nummer 1397-94-0); molecuulgewicht ~ 548,63 g/mol; oplosbaarheid in 95% ethanol bij 50 mg/mL
AgarKasvK25-611001Voor bacteriologisch gebruik; poeder; verstevigingsmiddel (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA7030Heat shock fractie, proteasevrij, vetzuurvrij, in wezen globulinevrij (CAS-nummer 9048-46-8); pH 7; >98%; oplosbaarheid in water 40 g/ml
Degeïoniseerd water
EGTASigma-AldrichE4378Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’N’-tetraazijnzuur (CAS-nummer 67-42-5); >97%; molecuulgewicht = 380,35 g/mol
Ethanol 99,5%
Ethyleen-vinyl acetaat schuimKan worden vervangen door dikke stukken katoen
Grappapier0,2 cm2 raster
HepesSigma-AldrichH40344-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur (CAS-nummer 7365-45-9), BioPerformance gecertificeerd; >99,5% (titratie), getest voor celcultuur; molecuulgewicht = 238,30 g/mol
HomogenisatorSartoriusHandmatige glazen homogenisator (S), 1 mL; bestaat uit een cilinder van borosilicaatglas plus plunjer S; vaak gebruikt voor eenvoudige monstervoorbereiding, bijv. verpletteren van weefselmonsters.
KClAmresco0395-2Kaliumchloride (CAS-nummer 7447-40-7); >99,0%; molecuulgewicht = 74,55 g/mol
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Kaliumfosfaat monobasisch (CAS-nummer 7778-77-0); ReagentPlus; molecuulgewicht = 136,09 g/mol
Lineaire lagers (LM8UU)8 mm, elk merk
MalaatSigma-AldrichM1000L-(-)-Appelzuur (CAS-nummer 97-67-6); >95-100%; molecuulgewicht = 134,09 g/mol), oplosbaarheid in water: 100 mg/mL. Een oplossing wordt pH-gecorrigeerd tot ongeveer 7,0.
MgCl2Amresco0288-1KGMagnesiumchloride, hexahydraat (CAS-nummer 7791-18-6); 99%-102%; molecuulgewicht = 203,3 g/mol
Microcentrifugebuizen1,5 mL; Afgesteld elke 100µL, autoklaveerbaar
Na2HPO4Amresco0348-1KGNatriumfosfaat, dibasisch, heptahydraat (CAS-nummer 7782-85-6); 98-102%; molecuulgewicht = 268,07 g/mol
NaClHoneywell31434-1KGNatriumchloride (CAS-nummer 7647-14-5); >99,5%; molecuulgewicht 58,44 g/mol. Alleen voor laboratoriumgebruik.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02Serie D-G; O2k-Core: omvat O2k-hoofdunit met roestvrijstalen behuizing, O2k-assemblagekit, twee OroboPOS (polarografische zuurstofsensoren) en OroboPOS-servicekit, DatLab-software, het ISS-geïntegreerde zuigsysteem en de O2k-titratieset.
Permanente stiftBij voorkeur zwart
Petri schotel90 X 15 mm schotels; wordt vaak gebruikt voor bacteriologische kweek
PLA 3D-printfilamentQuantum3D Printinghttp://quantum3dprinting.com/Hoogwaardig polylactaanzuurfilament (PLA), sterk aanbevolen, (1,0 kg rol), elk merk
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (CAS-nummer 147-85-3); poeder; 99%; molecuulgewicht = 115,13 g/mol
PropylgallaatSigma-AldrichP3130Propylgallaat (CAS-nummer 121-79-9); poeder; >98%; molecuulgewicht = 212,2 0 g/mol; oplosbaarheid in ethanol bij 50 mg/ml
PyrovaatSigma-AldrichP2256Natriumpyrovaat (CAS-nummer 113-24-6), >99%; molecuulgewicht = 110,04 g/mol; oplosbaarheid in water bij 100 mg/mL
Gerechte schotten8 x 300 mm, elk merk
RotenonSigma-AldrichR8875Rotenon (CAS-nummer 83-79-4); >95%, molecuulgewicht 394,42 g/mol
GummibandjesKan worden vervangen door stukken touw
SchroevendraaierOm enkele van de 3D-geprinte apparaten te assembleren
Schroeven

Referenties

  1. nobelprize.org. , Available from: http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/ (2021).
  2. Drosophila Model Filter. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%22drosophilia+model%22&filter=datesearch.y_5 (2021).
  3. A Look at Trends in NIHS Model Organism Research Support. , Available from: https://nexus.od.nih.gov/all/2016/07/14/a-look-at-trends-in-nihs-model-organism-research-support/ (2021).
  4. Drosophila. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/?q=drosophila (2021).
  5. Metapesquisa. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/ (2021).
  6. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  7. Brandt, A., Vilcinskas, A. The Fruit Fly Drosophila melanogaster as a Model for Aging Research. Yellow Biotechnology I. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 135, 63-77 (2013).
  8. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613(2019).
  9. Cheluvappa, R., Scowen, P., Eri, R. Ethics of animal research in human disease remediation, its institutional teaching; and alternatives to animal experimentation. Pharmacology Research and Perspectives. 5 (4), (2017).
  10. Plan Alto.gov. , Available from: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/|11794.htm (2021).
  11. Plan Alto.gov. , Available from: https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/decreto/d5591.htm (2021).
  12. Revistapesquisa.fapesp.br. , Available from: https://revistapesquisa.fapesp.br/en/supply-side-research-constraints/ (2021).
  13. ABC.org.br. , Available from: http://www.abc.org.br/2014/05/08/em-depoimento-a-cell-dario-zamboni-fala-dos-desafios-de-produzir-boa-ciencia-no-brasil/ (2021).
  14. Nascimento, S., Pólvora, A. Maker Cultures and the Prospects for Technological Action. Science and Engineering Ethics. 24 (3), 927-946 (2018).
  15. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), (2017).
  16. Baden, T., Chagas, A. M., Gage, G., Marzullo, T., Prieto-Godino, L. L., Euler, T. Open Labware: 3-D Printing Your Own Lab Equipment. PLOS Biology. 13 (3), 1002086(2015).
  17. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  18. Hock, D. H., Robinson, D. R. L., Stroud, D. A. Blackout in the powerhouse: Clinical phenotypes associated with defects in the assembly of OXPHOS complexes and the mitoribosome. Biochemical Journal. 477 (21), 4085-4132 (2020).
  19. Juszczuk, I. M., Rychter, A. M. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polonica. 50 (4), 1257-1271 (2003).
  20. McDonald, A. E. Alternative oxidase: An inter-kingdom perspective on the function and regulation of this broadly distributed "cyanide-resistant" terminal oxidase. Functional Plant Biology. 35 (7), 535-552 (2008).
  21. McDonald, A. E., Vanlerberghe, G. C., Staples, J. F. Alternative oxidase in animals: Unique characteristics and taxonomic distribution. Journal of Experimental Biology. 212, 2627-2634 (2009).
  22. McDonald, A., Vanlerberghe, G. Branched Mitochondrial Electron Transport in the Animalia: Presence of Alternative Oxidase in Several Animal Phyla. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life. 56 (6), 333-341 (2004).
  23. McDonald, A. E., Costa, J. H., Nobre, T., De Melo, D. F., Arnholdt-Schmitt, B. Evolution of AOX genes across kingdoms and the challenge of classification. Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. , 267-272 (2015).
  24. Fernandez-Ayala, D. J. M., et al. Expression of the Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX) in Drosophila Complements Defects in Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Cell Metabolism. 9 (5), 449-460 (2009).
  25. Kemppainen, K. K., et al. Expression of alternative oxidase in Drosophila ameliorates diverse phenotypes due to cytochrome oxidase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (8), 2078-2093 (2014).
  26. Andjeiković, A., Kemppainen, K. K., Jacobs, H. T. Ligand-bound geneswitch causes developmental aberrations in drosophila that are alleviated by the alternative oxidase. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (9), 2839-2846 (2016).
  27. Hakkaart, G. A. J., Dassa, E. P. E. P., Jacobs, H. T., Rustin, P. Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration. EMBO Reports. 7 (3), 341-345 (2006).
  28. Dassa, E. P., et al. Expression of the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Molecular Medicine. 1 (1), 30-36 (2009).
  29. Szibor, M., et al. Broad AOX expression in a genetically tractable mouse model does not disturb normal physiology. DMM Disease Models and Mechanisms. 10 (2), 163-171 (2017).
  30. El-Khoury, R., Kaulio, E., Lassila, K. A., Crowther, D. C., Jacobs, H. T., Rustin, P. Expression of the alternative oxidase mitigates beta-amyloid production and toxicity in model systems. Free Radical Biology and Medicine. 96, 57-66 (2016).
  31. Mills, E. L., et al. Succinate Dehydrogenase Supports Metabolic Repurposing of Mitochondria to Drive Inflammatory Macrophages. Cell. 167 (2), 457-470 (2016).
  32. Giordano, L., et al. Alternative Oxidase Attenuates Cigarette Smoke-induced Lung Dysfunction and Tissue Damage. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60 (5), 515-522 (2019).
  33. Camargo, A. F., et al. Xenotopic expression of alternative electron transport enzymes in animal mitochondria and their impact in health and disease. Cell biology International. 42 (6), 664-669 (2018).
  34. Saari, S., et al. Alternative respiratory chain enzymes: Therapeutic potential and possible pitfalls. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 854-866 (2019).
  35. Instructables.com. , Available from: https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisted/ (2021).
  36. Tindercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/ (2021).
  37. Repetier.com. , Available from: https://www.repetier.com/ (2021).
  38. Tinkercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/login (2021).
  39. Knowledge.autodesk.com. , Available from: https://knowledge.autodesk.com/support/revit-products/learn_explore/caas/CloudHelp/cloudhelp/2016/ENU/Revit-Model/files/GUID-B89AD692-C705-458F-A638-EE7DD83D694C-htm.html (2021).
  40. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808(2017).
  41. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  42. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments JoVE. (61), e3795(2012).
  43. Oroboros. , Available from: https://www.oroboros.at/">"https://www.oroboros.at/">https://www.oroboros.at/ (2021).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  45. Tinkercad. , Available from: https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">"https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ (2021).
  46. Morton, J. D., Barnes, M. F., Zyskowski, R. F. Respiratory control ratio: A computer simulation of oxidative phosphorylation. Biochemical Education. 24 (2), 110-111 (1996).
  47. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. The Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 383-393 (1955).
  48. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. F. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  49. Github.com. , Available from: https://github.com/amchagas/Flypi">"https://github.com/amchagas/Flypi">https://github.com/amchagas/Flypi (2021).
  50. Gilestrolab.github.io. , Available from: https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">"https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">https://gilestrolab.github.io/ethoscope/ (2021).
  51. Imagej.nih.gov. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/">"https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  52. Open-Neuroscience.com. , Available from: https://open-neuroscience.com/">"https://open-neuroscience.com/">https://open-neuroscience.com/ (2021).
  53. Appropedia.org. , Available from: https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">"https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment (2021).
  54. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  55. Schou, M. F., Kristensen, T. N., Pedersen, A., Karlsson, B., Loeschcke, V., Malmendal, A. Metabolic and functional characterization of effects of developmental temperature in Drosophila melanogaster. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 312 (2), 211-222 (2017).
  56. Meeuse, B. J. D. Thermogenic Respiration in Aroids. Annual Review of Plant Physiology. , (1975).
  57. Watling, J. R., Robinson, S. A., Seymour, R. S. Contribution of the alternative pathway to respiration during thermogenesis in flowers of the sacred lotus. Plant Physiology. , (2006).
  58. Inaba, Y. I., et al. Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis. Plant Physiology. 180 (2), 743-756 (2019).
  59. Sanz, A., Stefanatos, R., McIlroy, G. Production of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain in Drosophila melanogaster. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 42 (2), 135-142 (2010).
  60. Miwa, S., St-Pierre, J., Partridge, L., Brand, M. D. Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radical Biology and Medicine. 35 (8), 938-948 (2003).
  61. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control An Introduction to OXPHOS Analysis. Bioenergetics Communications. 2, Bionergetics Communications. Innsbruck, Austria. (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Constructie van vliegenlaboratoria3D printapparatuurmitochondriale zuurstofconsumptielocomotorische assayshofmakerijarena sexpressie van alternatieve oxidasegedragsassaysonderzoek naar modelorganismen
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.