Gepresenteerd is een computationele tool die eenvoudige en directe automatische meting van oriëntaties van neuronale dendritische takken van 2D-fluorescentiebeelden mogelijk maakt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Automatische identificatie van dendritische takken en hun oriëntatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De structuur van neuronale dendritische bomen speelt een sleutelrol bij de integratie van synaptische inputs in neuronen. Daarom is karakterisering van de morfologie van dendrieten essentieel voor een beter begrip van de neuronale functie. De complexiteit van dendritische bomen, zowel geïsoleerd als vooral wanneer ze zich binnen neuronale netwerken bevinden, is echter niet volledig begrepen. We ontwikkelden een nieuwe computationele tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), waarmee automatisch de oriëntatie van dendritische takken kan worden gemeten op basis van fluorescentiebeelden van 2D-neuronale culturen. SOA, geschreven in Python, gebruikt segmentatie om dendritische takken te onderscheiden van de achtergrond van de afbeelding en verzamelt een database over de ruimtelijke richting van elke tak. De database wordt vervolgens gebruikt om morfologische parameters te berekenen, zoals de directionele verdeling van dendritische takken in een netwerk en de prevalentie van parallelle dendritische takgroei. De verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om structurele veranderingen in dendrieten te detecteren als reactie op neuronale activiteit en op biologische en farmacologische stimuli.
Inleiding
Dendritische morfogenese is een centraal onderwerp in de neurowetenschappen, omdat de structuur van de dendritische boom de computationele eigenschappen van synaptische integratie in neuronen beïnvloedt1,2,3. Bovendien zijn morfologische afwijkingen en modificaties in dendritische takken betrokken bij degeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen4,5,6. In neuronale culturen waar dendritische vertakking gemakkelijker kan worden gevisualiseerd, reguleren de interacties tussen niet-zuster dendritische takken de plaatsen en mate van synaptische clustering langs de takken, een gedrag dat synaptische coactiviteit en plasticiteit kan beïnvloeden7,8,9. Daarom is karakterisering van de morfologische parameters van de dendritische boom met behulp van tweedimensionale (2D) neuronale culturen voordelig voor het begrijpen van dendritische morfogenese en functionaliteit van enkele en netwerken van neuronen. Toch is dit een uitdagende taak omdat dendritische takken een complex gaas vormen, zelfs in "vereenvoudigde" 2D-neuronale culturen.
Er zijn verschillende tools ontwikkeld om dendritische structuren automatisch te traceren en te analyseren10,11,12,13. De meeste van deze tools zijn echter ontworpen voor 3D-neuronale netwerken en zijn van nature te complex om te gebruiken met 2D-netwerken. Daarentegen omvatten minder geavanceerde morfologische analysetools meestal een aanzienlijk onderdeel van computerondersteunde handmatige arbeid, die zeer tijdrovend is en vatbaar voor operatorbias14. Bestaande semi-automatische tools, zoals 'ImageJ'15 (een NIH open-source beeldverwerkingspakket met een uitgebreide verzameling door de gemeenschap ontwikkelde biologische beeldanalysetools), verminderen grotendeels de handmatige arbeid van gebruikers. Tijdens de beeldverwerking zijn echter nog enkele handmatige ingrepen nodig en kan de kwaliteit van de segmentatie minder dan wenselijk zijn.
Dit artikel presenteert de SOA, een eenvoudige geautomatiseerde tool die directe segmentatie en oriëntatieanalyse van dendritische takken binnen 2D-neuronale netwerken mogelijk maakt. De SOA kan verschillende lijnachtige objecten in 2D-afbeeldingen detecteren en hun morfologische eigenschappen karakteriseren. Hier gebruikten we de SOA voor het segmenteren van dendritische takken in 2D-fluorescentiebeelden van dendritische netwerken in cultuur. De software identificeert de dendritische takken en voert met succes metingen uit van morfologische parameters zoals parallellisme en ruimtelijke verdeling. De SOA kan eenvoudig worden aangepast voor de analyse van cellulaire processen van andere celtypen en voor het bestuderen van niet-biologische netwerken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het Israëlische ministerie van Volksgezondheid heeft het gebruik van muizen goedgekeurd onder protocol IL-218-01-21 voor het ethisch gebruik van proefdieren. SOA is alleen compatibel met Windows 10 en Python 3.9. Het is beschikbaar als een open-source code: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. Op deze link is er ook een README. DM-bestand met aanwijzingen voor het downloaden van de software, een koppeling naar de website van de software en een vereistenbestand met informatie over de vereiste versies van alle pakketten. Aanvullende voorbeelden van analyses die met behulp van de software zijn uitgevoerd, zijn daar ook verstrekt.
Figuur 1: SOA-workflow voor segmentatie en groeirichtinganalyse. Getoond worden de verwerkingsstappen van fluorescerende beelden van dendritische netwerken en data-analyse getoond. Het 2D-beeld wordt geüpload, gesegmenteerd (in twee stappen: dendritische takken worden gedetecteerd als lijnen en vervolgens worden de relevante lijnen samengevoegd) en de ruimtelijke informatie van elke dendritische tak wordt verkregen. De gegevens worden verzameld voor alle dendritische takken in het beeld. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd om de gewenste morfologische parameters te geven. Afkorting: SOA = segmentatie en oriëntatie analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Open de SOA-applicatie.
- Open het URL-adres: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, zoek de map SOA.zip zip en download het ZIP-bestand door te dubbelklikken.
- Pak de map uit door met de rechtermuisknop op SOA.zip te klikken en bestanden uitpakken te kiezen. Bekijk het venster Extractiepad en opties dat wordt geopend en het tekstvak Doeladres waarin het pad voor de uitgepakte bestanden wordt weergegeven. Om uit te pakken naar een andere locatie, klikt u op een van de mappen in het rechterdeelvenster van het venster om er de doelmap van te maken. Klik op OK om de bestanden uit te pakken naar die map.
- Open het uitgepakte SOA-bestand en dubbelklik op SOA.exe. Wacht tot er een zwart venster wordt geopend, waarna de toepassing verschijnt.
Afbeelding 2: Voorbeeld van een workflow met de GUI van de SOA. Linkerkolom: GUI-secties van de workflow. Middelste kolom: afbeelding van een dendritisch netwerk, verwerkt tijdens de workflow (schaalbalk: 20 μm). Rechterkolom: vergroting van het gebied gemarkeerd door een rode rechthoek in de afbeeldingen van de middelste kolom (schaalbalk: 4 μm). Stap 1: Selectie en uploaden van een afbeelding. Stap 2: De eerste fase van segmentatie is de detectie van lijnen die de geïdentificeerde dendritische takken vertegenwoordigen. Stap 3: De tweede fase van segmentatie is de op nabijheid gebaseerde fusie van segmentvoering in individuele dendritische takken. De instellingen van alle stappen kunnen worden gewijzigd. Afkortingen: SOA = segmentatie en oriëntatie analyse; GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Open een afbeelding om te analyseren.
- In de menubalk uploaden van SOA Viewer | selecteer Bestand kiezen | kies een afbeelding uit de computerbestanden | klik erop (alleen .png .jpg .tif .bmp bestanden) | | openen observeer het pad van het bestand | Volgend.
3. Segmentatie optimalisatie
OPMERKING: Wijzig in de menubalk Eigenschappen van de SOA-viewer de waarden van de geselecteerde parameters om de instellingen van het segmentatieproces aan te passen. Een gedetailleerde beschrijving van de parameters, zoals de drempel, wordt gegeven in het aanvullend materiaal.
- Pas in Randen de drempel voor de weergave aan door de drempelwaarde te selecteren en een getal in te voeren.
OPMERKING: Hoe lager het getal voor de drempel, hoe meer lijnen worden gedetecteerd. Drempel is een getal dat varieert van 0 tot 255. De standaardwaarde is ingesteld op 0. - In Regels samenvoegen:
- Pas de minimale afstand aan om samen te voegen voor het display door de minafstand te selecteren die u wilt samenvoegen en een getal in te voeren.
OPMERKING: De minimale afstand tot samenvoegen varieert van 0 tot 30 pixels. De standaardwaarde is ingesteld op 20. - Pas de minimale samenvoeghoek voor het scherm aan door de minhoek te selecteren die u wilt samenvoegen en een getal in te voeren.
OPMERKING: De minhoek om samen te voegen varieert van 0 tot 30°. De standaardwaarde is ingesteld op 10.
- Pas de minimale afstand aan om samen te voegen voor het display door de minafstand te selecteren die u wilt samenvoegen en een getal in te voeren.
- Klik op Voorbeeldsegmentatieafbeelding maken.
OPMERKING: Een voorbeeldafbeelding van de segmentatieresultaten wordt weergegeven op basis van de bijgewerkte waarden. Bovendien wordt het aantal regels vóór het samenvoegen en het aantal regels na het samenvoegen weergegeven. - Wijzig de parameters om maximale identificatie van segmenten te bereiken. Als het nodig is om de eigenschappen te wijzigen, klikt u op de knop Venster sluiten en volgt u de stappen 3.1-3.4.
4. Maak de uitvoerbestanden.
- Druk op OK om de segmentatieafbeeldingen en de analysegrafieken te visualiseren. Observeer het venster dat verschijnt voor het selecteren van een locatie waar het .xlsx bestand wordt opgeslagen.
- een | voor een bestandsnaam invoegen Kies Opslaan | wacht tot het .xlsx bestand met gegevens is gemaakt en opgeslagen.
OPMERKING: Naast het .xlsx bestand worden de volgende bestanden automatisch weergegeven: een bestand met de oorspronkelijke afbeelding, de lijnherkenningsafbeelding, de uiteindelijke afbeelding van de segmentatie en drie analysegrafieken.
5. Navigatie werkbalk
OPMERKING: Een navigatiewerkbalk is opgenomen in alle figuurvensters en kan worden gebruikt om door de gegevensset te navigeren. Elk van de knoppen onder aan de werkbalk wordt hieronder beschreven.
- Als u heen en weer wilt navigeren tussen eerder gedefinieerde weergaven, gebruikt u de knoppen Vooruit en Vorige .
OPMERKING: De knoppen Start, Vooruit en Vorige zijn vergelijkbaar met de besturingselementen Start, Vooruit en Terug in een webbrowser. Home keert terug naar het standaardscherm, de oorspronkelijke afbeelding. - Gebruik de zoomknop om te pannen en zoomen. Als u pannen en zoomen wilt activeren, drukt u op de zoomknop en beweegt u de muis naar een gewenste locatie in de afbeelding.
- Als u de figuur wilt pannen, houdt u de linkermuisknop ingedrukt terwijl u deze naar een nieuwe positie sleept. Laat de muisknop los en het geselecteerde punt in de afbeelding verschijnt in de nieuwe positie. Houd tijdens het pannen de x - of y-toetsen ingedrukt om de beweging te beperken tot respectievelijk de x - of y-as .
- Als u wilt zoomen, houdt u de rechtermuisknop ingedrukt en sleept u deze naar een nieuwe locatie. Ga naar rechts om in te zoomen op de x-as en ga naar links om uit te zoomen op de x-as. Doe hetzelfde voor de y-as en de bewegingen omhoog/omlaag. Houd er bij het zoomen rekening mee dat het punt onder de muis stil blijft staan, waardoor u rond dat punt kunt in- of uitzoomen. Gebruik de speciale toetsen x, y of CONTROL om de zoom te beperken tot respectievelijk de x-, y- of beeldverhouding.
- Als u de modus Zoomen op rechthoek wilt activeren, klikt u op de knop Zoomen op rechthoek . Plaats de cursor over de afbeelding en druk op de linkermuisknop. Sleep de muis naar een nieuwe locatie terwijl u de knop ingedrukt houdt om een rechthoekig gebied te definiëren.
OPMERKING: De weergavelimieten van de assen worden ingezoomd op het gedefinieerde gebied wanneer de linkermuisknop wordt ingedrukt. De weergavelimieten van de assen worden uitgezoomd wanneer de rechtermuisknop wordt ingedrukt, waardoor de oorspronkelijke assen in het gedefinieerde gebied worden geplaatst. - Gebruik het hulpprogramma Subplotconfiguratie om het uiterlijk van de subplot te configureren.
OPMERKING: De linker-, rechter-, boven- en onderkant van de subplot, evenals de ruimte tussen rijen en kolommen, kunnen worden uitgerekt of gecomprimeerd. - Als u een dialoogvenster voor het opslaan van bestanden wilt openen, klikt u op de knop Opslaan en slaat u het bestand op in de volgende indelingen: .png, .ps, .eps, .svg of .pdf.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een representatieve analyse werd uitgevoerd op beelden van dendritische netwerken in cultuur. Cellen werden geëxtraheerd zoals beschreven door Baranes et al. 16,17. Kortom, hippocampuscellen werden geëxtraheerd uit de hersenen van postnatale ratten en gekweekt op 2D-glazen coverslips gedurende 1-2 weken. De culturen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd door middel van indirecte immunofluorescentie met behulp van een antilichaam tegen de dendritische e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Effectieve strategieën voor het extraheren van morfologische informatie uit 2D-beelden zijn dringend nodig om biologische beeldvormingsgegevens bij te houden. Hoewel beeldgegevens in uren kunnen worden gegenereerd, duurt een diepgaande analyse van de beelden lang. Hierdoor is beeldverwerking op veel terreinen duidelijk een groot obstakel geworden. Dit is deels te wijten aan de hoge complexiteit van de gegevens, vooral bij het omgaan met biologische monsters. Bovendien, omdat veel gebruikers geen gespecialiseerde programm...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Orly Weiss bedanken voor het opstellen van de cultuurbeelden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom en het Matplotlib ontwikkelingsteam; 2012 - 2021 Het Matplotlib ontwikkelingsteam. | 3.4.2 | een Python 2D plotting bibliotheek |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | artiest voor matplotlib om een schaalbalk weer te geven |
| NumPy | De NumPy community. | 1.20.3 | fundamenteel pakket voor wetenschappelijke computing bibliotheek |
| OpenCV | OpenCV team | 4.5.2.54 | Open Source Computer Vision Library |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1 (Community Edition) versie | Build #PC-203.6682.86, gebouwd op december 18, 2020. Runtime versie: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM door JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Geheugen: 978M, Kernen: 4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | de GUI beheren |
| python | Python Software Foundation Licentie | 3.9 versie | |
| Qt Designer | The QT Company Ltd. | 5.11.1 versie | |
| scipy | Community bibliotheek project | 1.6.3 | Python-gebaseerd ecosysteem van open-source software voor wiskunde, wetenschap en techniek |
| Seaborn | Michael Waskom. | 0.11.1 | Python's Statistische Gegevensvisualisatie Bibliotheek. |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | Python module voor het maken van Excel XLSX bestanden |
Referenties
- Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. Functional impact of dendritic branch-point morphology. Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 206-221 (2008).
- Chklovskii, D. Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin. Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).
- Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).
- Irwin, S. Dendritic Spine Structural Anomalies in Fragile-X Mental Retardation Syndrome. Cerebral Cortex. 10 (10), 1038-1044 (2000).
- Kaufmann, W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Pinchas, M., Baranes, D. Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering. PLoS ONE. 8 (12), 82083(2013).
- Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs. Brain Research. 1251, 30-41 (2009).
- Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity. PLoS ONE. 3 (11), 3782(2008).
- Glaser, J., Glaser, E. Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy. Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).
- Torben-Nielsen, B. An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies. Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).
- Parekh, R., Ascoli, G. Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience. Neuron. 78 (1), 206(2013).
- heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis. 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).
- Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2021).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).
- Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
