Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Summary

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Abstract

Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA's te identificeren die worden vertaald door ribosomen en polysoomgerelateerde factoren te analyseren. Hoewel geautomatiseerde gradiëntmakers en gradiëntfractioneringssystemen vaak worden gebruikt met deze techniek, zijn deze systemen over het algemeen duur en kunnen ze onbetaalbaar zijn voor laboratoria die beperkte middelen hebben of de kosten niet kunnen rechtvaardigen vanwege hun onregelmatige of incidentele noodzaak om deze methode uit te voeren voor hun onderzoek. Hier wordt een protocol gepresenteerd om reproduceerbaar polysoomprofielen te genereren met behulp van standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste moleculair biologische laboratoria zonder gespecialiseerde fractioneringsinstrumenten. Bovendien wordt een vergelijking van polysomische profielen gegenereerd met en zonder een gradiëntfractioneringssysteem verstrekt. Strategieën om reproduceerbare polysoomprofielen te optimaliseren en te produceren worden besproken. Saccharomyces cerevisiae wordt in dit protocol gebruikt als modelorganisme. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast en aangepast om ribosoomprofielen te genereren voor veel verschillende organismen en celtypen.

Introduction

Ribosomen zijn mega-Dalton ribonucleoproteïnecomplexen die het fundamentele proces van het vertalen van mRNA in eiwitten uitvoeren. Ribosomen zijn verantwoordelijk voor het uitvoeren van de synthese van alle eiwitten in een cel. Eukaryote ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden aangeduid als de kleine ribosomale subeenheid (40S) en de grote ribosomale subeenheid (60S) op basis van hun sedimentatiecoëfficiënten. Het volledig geassembleerde ribosoom wordt aangeduid als het 80S monosoom. Polysomen zijn groepen ribosomen die zich bezighouden met het vertalen van een enkel mRNA-molecuul. Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een kra....

Protocol

1. Bereiding van 7% - 47% sucrosegradiënten

OPMERKING: Het lineaire bereik van de sucrosegradiënt kan worden gewijzigd om een betere scheiding te bereiken, afhankelijk van het gebruikte celtype. Dit protocol is geoptimaliseerd voor polysoomprofielen voor S. cerevisiae.

1. Bereid stamoplossingen van 7% en 47% sucrose in sucrosegradiëntbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ en 1 mM DTT). Filter steriliseer de sucrose bouillonoplossingen door een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
2. Bereid 14 ml van 17%, 27% en 37% sucrose-oplossingen door de 7% en 47% sucrose-bouillonoplossingen te doseren....

Results

Drie representatieve polysoomprofielen zijn weergegeven in figuur 3. Alle profielen zijn van dezelfde giststam. Een typisch polysoomprofiel heeft goed opgeloste pieken voor de ribosomale subeenheden van de jaren 40, 60 en 80 en polysomen. De top van elke ribosomale subeenheid en polysoompiek zal zichtbaar zijn op elk profiel (figuur 3). Een representatief profiel van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem is weergegeven in figuu.......

Discussion

Hier is een methode beschreven om polysomische profielen te maken zonder het gebruik van dure geautomatiseerde fractioneringssystemen. Het voordeel van deze methode is dat het polysome profilering toegankelijk maakt voor laboratoria die geen geautomatiseerde fractioneringssystemen hebben. De belangrijkste nadelen van dit protocol zijn vervelende handfractionering en verminderde gevoeligheid in vergelijking met het speciale dichtheidsfractioneringssysteem.

Dit protocol omvat een zorgvuldige voo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801