Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Summary

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Abstract

Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA's te identificeren die worden vertaald door ribosomen en polysoomgerelateerde factoren te analyseren. Hoewel geautomatiseerde gradiëntmakers en gradiëntfractioneringssystemen vaak worden gebruikt met deze techniek, zijn deze systemen over het algemeen duur en kunnen ze onbetaalbaar zijn voor laboratoria die beperkte middelen hebben of de kosten niet kunnen rechtvaardigen vanwege hun onregelmatige of incidentele noodzaak om deze methode uit te voeren voor hun onderzoek. Hier wordt een protocol gepresenteerd om reproduceerbaar polysoomprofielen te genereren met behulp van standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste moleculair biologische laboratoria zonder gespecialiseerde fractioneringsinstrumenten. Bovendien wordt een vergelijking van polysomische profielen gegenereerd met en zonder een gradiëntfractioneringssysteem verstrekt. Strategieën om reproduceerbare polysoomprofielen te optimaliseren en te produceren worden besproken. Saccharomyces cerevisiae wordt in dit protocol gebruikt als modelorganisme. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast en aangepast om ribosoomprofielen te genereren voor veel verschillende organismen en celtypen.

Introduction

Ribosomen zijn mega-Dalton ribonucleoproteïnecomplexen die het fundamentele proces van het vertalen van mRNA in eiwitten uitvoeren. Ribosomen zijn verantwoordelijk voor het uitvoeren van de synthese van alle eiwitten in een cel. Eukaryote ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden aangeduid als de kleine ribosomale subeenheid (40S) en de grote ribosomale subeenheid (60S) op basis van hun sedimentatiecoëfficiënten. Het volledig geassembleerde ribosoom wordt aangeduid als het 80S monosoom. Polysomen zijn groepen ribosomen die zich bezighouden met het vertalen van een enkel mRNA-molecuul. Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtige methode die wordt gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA's te identificeren die verband houden met het vertalen van ribosomen en polysoomassociatiefactoren^{te analyseren} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Deze techniek wordt vaak gebruikt om polysomen te scheiden van enkele ribosomen, ribosomale subeenheden en messenger ribonucleoproteïnedeeltjes. De profielen verkregen uit fractionering kunnen waardevolle informatie opleveren over de translatieactiviteit van polysomen¹⁴ en de assemblagestatus van de ribosomen 15,16,17.

Ribosoomassemblage is een zeer complex proces dat wordt vergemakkelijkt door een groep eiwitten die bekend staat als ribosoomassemblagefactoren 18,19,20,21. Deze factoren vervullen een breed scala aan functies tijdens ribosoombiogenese door interacties met vele andere eiwitten, waaronder ATPasen, endo- en exo-nucleasen, GTPases, RNA-helicases en RNA-bindende eiwitten²². Polysoomfractionering is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om de rol van deze factoren in ribosoomassemblage te onderzoeken. Deze methode is bijvoorbeeld gebruikt om aan te tonen hoe mutaties in het polynucleotidekinase Grc3, een pre-rRNA-verwerkingsfactor, het ribosoomassemblageproces negatief kunnen beïnvloeden^17,23. Polysoomprofilering heeft ook benadrukt en aangetoond hoe de geconserveerde motieven in de ATPase Rix7 essentieel zijn voor ribosoomproductie¹⁶.

De procedure voor polysoomfractionering begint met het maken van oplosbare cellysaten uit interessante cellen. Het lysaat bevat RNA, ribosomale subeenheden en polysomen, evenals andere oplosbare cellulaire componenten. Een continue, lineaire sucrosegradiënt wordt gemaakt in een ultracentrifugebuis. De oplosbare fractie van cellysaat wordt voorzichtig op de bovenkant van de sucrosegradiëntbuis geladen. De geladen gradiëntbuis wordt vervolgens onderworpen aan centrifugatie, die de cellulaire componenten scheidt op grootte binnen de sucrosegradiënt door de zwaartekracht. De grotere componenten reizen verder in de gradiënt dan de kleinere componenten. De bovenkant van de gradiënt herbergt de kleinere, langzamer reizende cellulaire componenten, terwijl de grotere, sneller reizende cellulaire componenten aan de onderkant te vinden zijn. Na centrifugatie wordt de inhoud van de buis verzameld als fracties. Deze methode scheidt effectief ribosomale subeenheden, monosomen en polysomen. De optische dichtheid van elke fractie wordt vervolgens bepaald door de spectrale absorptie te meten bij een golflengte van 254 nm. Het plotten van absorptie versus fractiegetal levert een polysoomprofiel op.

Lineaire sucrosedichtheidsgradiënten kunnen worden gegenereerd met behulp van een gradiëntmaker. Na centrifugatie worden gradiënten vaak gefractioneerd en absorptiewaarden gemeten met behulp van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem 3,7,13,24,25. Hoewel deze systemen heel goed werken om polysoomprofielen te produceren, zijn ze duur en kunnen ze voor sommige laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier wordt een protocol gepresenteerd om polysomische profielen te genereren zonder het gebruik van deze instrumenten. In plaats daarvan maakt dit protocol gebruik van apparatuur die doorgaans beschikbaar is in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.

Protocol

1. Bereiding van 7% - 47% sucrosegradiënten

OPMERKING: Het lineaire bereik van de sucrosegradiënt kan worden gewijzigd om een betere scheiding te bereiken, afhankelijk van het gebruikte celtype. Dit protocol is geoptimaliseerd voor polysoomprofielen voor S. cerevisiae.

1. Bereid stamoplossingen van 7% en 47% sucrose in sucrosegradiëntbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ en 1 mM DTT). Filter steriliseer de sucrose bouillonoplossingen door een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
2. Bereid 14 ml van 17%, 27% en 37% sucrose-oplossingen door de 7% en 47% sucrose-bouillonoplossingen te doseren en te mengen op de in tabel 1 beschreven wijze.
3. Plaats zes polypropyleen centrifugebuizen (14 x 89 mm) in een volledig zichtbare reageerbuis. Zorg voor voldoende ruimte tussen de buizen zodat acties met de ene buis de andere niet storen.
4. Bevestig een lange naald aan een spuit van 3 ml. Gebruik voor dit protocol een naald van 9 inch en 22 G met een stompe punt (figuur 1), maar elke naald die lang genoeg is om de bodem van de centrifugebuis te bereiken, is voldoende.
   OPMERKING: Voer een testvulling en dispensatie uit om ervoor te zorgen dat de spuit de sucrose-oplossing kan vasthouden zonder te druppelen voordat de gradiënten worden ingesteld.
5. Voeg 2 ml van de 7% sucrose toe aan de bodem van elke centrifugebuis.
6. Voeg 2 ml van de 17% sucrose toe onder de 7% oplossing door de naaldpunt in de onmiddellijke nabijheid van de bodem van de buis te plaatsen en de oplossing langzaam en voorzichtig te doseren.
7. Herhaal met 2 ml elk van de 27%, 37% en 47% sucrose-oplossingen. Zorg ervoor dat elke laag van elkaar te onderscheiden is door een lijn die de scheiding van dichtheden markeert (figuur 2).
   OPMERKING: Als de gradiënten niet binnen 48 uur zullen worden gebruikt, bevriezen de buizen op dit punt, voordat ze in een continue gradiënt worden opgelost, de buizen met gelaagde sucroseoplossingen in vloeibare stikstof en bewaren ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
8. Bewaar gradiënten bij 4 °C 's nachts om gradiënten te laten bezinken tot een continu, toenemend percentage sucrose. Het duurt 8-12 uur voordat de gelaagde sucrose-oplossingen in een lineaire sucrosegradiënt zijn bezinkt. Lineaire gradiënten zijn stabiel tot 48 uur. Nachtelijke opslag bij 4 °C biedt voldoende tijd voor ontdooien en zetting in een lineaire gradiënt voor het gebruik van bevroren, gelaagde sucrose-oplossingen. Gebruik een densitometer om de gradiëntkwaliteit te beoordelen.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gradiënten op een stabiele plaats op te slaan waar ze niet worden verstoord, omdat bewegingen of trillingen de gradiënt zullen verstoren.

2. Bereiding van gistcelextracten

1. Ent de giststam van belang in 50 ml gistextract pepton dextrose (YPD) media en groei 's nachts bij 30 °C in een schuddende incubator tot stationaire fase.
   OPMERKING: De temperatuur kan variëren afhankelijk van de vereisten voor giststammen.
2. Breng 10 ml stationaire fasecultuur over in 1 l verse YPD-media. Incubeer de cellen met krachtig schudden bij 30 °C (of een andere geschikte temperatuur) totdat de cultuur de midden-exponentiële groeifase bereikt (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. Voeg in de midden-exponentiële groeifase cycloheximide toe aan de cultuur in een eindconcentratie van 0,1 mg / ml. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
4. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Op dit punt kunnen cellen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 °C.
5. Resuspendeer de cellen in gekoelde 700 μL polysoomextractiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml cycloheximide, 0,2 mg/ml heparine). Voeg 100 eenheden RNase Inhibitor toe en breng het over in een centrifugebuis van 1,5 ml.
6. Voeg ~400 μL voorgekoelde glasparels met een groottebereik van 425-600 μm toe aan de centrifugebuis. Verstoor de gistcellen door krachtige agitatie in een kraalklopper gedurende 5 minuten.
7. Verduidelijk het lysaat door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
8. Bepaal de concentratie van het RNA in het geklaarde lysaat door de absorptie bij 260 nm te meten met een spectrofotometer of met behulp van een op fluorescentie gebaseerd RNA-detectiesysteem.
   OPMERKING: Voor zeer nauwkeurige RNA-concentratiemetingen gebruikt u op fluorescentie gebaseerde RNA-detectiekits.
9. Zorg ervoor dat de RNA-concentratie 0,5-1 μg/μL is. Als de RNA-concentratie te laag is, verminder dan het volume van polysoomextractiebuffer dat wordt gebruikt om de cellen in toekomstige experimenten te resuspenderen.
   OPMERKING: Laad het lysaat onmiddellijk na lyse- en RNA-kwantificering op de gradiënten. Indien nodig vriest flash de lysaten in vloeibare stikstof in en bewaar ze enkele dagen bij -80 °C.

3. Centrifugatie van gradiënten

1. Laad het lysaat voorzichtig op de bovenkant van de verlopen. Plaats de pipetpunt tegen de binnenwand, aan de bovenkant van de polypropyleenbuis. Draai de buis voorzichtig in een hoek en doseer het lysaat langzaam op de bovenkant van het verloop door tegen de muur te dribbelen. Zorg ervoor dat u het verloop niet verstoort of verstoort bij het laden van het lysaat.
   OPMERKING: De hoeveelheid geladen lysaat verschilt per celtype. De inhoud van het RNA zal ook variëren. Het kan nodig zijn om een aantal experimenten uit te voeren om de hoeveelheid lysaat te bepalen die nodig is om een optimaal polysoomprofiel te genereren. Voor gist is 300 μg RNA een goed startpunt voor optimalisatie.
2. Plaats de buizen voorzichtig in de voorgekoelde emmers van een zwenkbakrotor.
   OPMERKING: Elke polypropyleencentrifugebuis moet gelijke gradiëntvolumes hebben en de hoeveelheid van het geladen lysaat. Dit kan van buis tot buis verschillen. Zorg ervoor dat de variatie geen onbalansfout veroorzaakt tijdens ultracentrifugatie.
3. Centrifugeer de hellingen bij 260.110 x g gedurende 150 min bij 4 °C.

4. Breuk en gegevensverzameling

1. Verwijder de centrifugebuizen voorzichtig van de zwenkbakrotor en plaats ze in een buishouder.
2. Label de 96-well platen om de fracties op te slaan en voorkoelen op ijs.
   OPMERKING: Gebruik een 96-well plaat geschikt voor een spectrofotometer met een optisch venster tot 230 nm voor nucleïnezuurbepalingen bij 260 nm / 280 nm.
3. Verzamel 100 μL of 200 μL fracties vanaf de bovenkant van het verloop door voorzichtig een pipetpunt in de bovenkant van het verloop te steken. Verzamel fracties totdat de hele gradiënt is gealiquoteerd. Het aantal fracties is afhankelijk van het totale gradiëntvolume.
   OPMERKING: Verzamel de breuken op een manier die de rest van het verloop niet verstoort. Zorg ervoor dat alle fracties evenveel volume hebben. Naast handmatige fractionering is een andere goedkope methode voor fractionering het gebruik van een kleine peristaltische pomp.
4. Breng elke fractie over naar de 96-well plaat om de bodem van de centrifugebuis te bereiken. Bewaar de verzamelde fracties te allen tijde op het ijs.
5. Meet de absorptie van elke fractie bij 254 nm met een spectrofotometer. Gebruik de 7% en 47% sucrose-oplossingen als blanco's.
   OPMERKING: Houd er bij het meten van de absorptie van fracties rekening mee dat voor de meeste spectrometers en colorimeters het meest effectieve absorptiebereik 0,1-1 is. Als de absorptiemetingen buiten bereik zijn (≥1,0), hebben de fracties te veel materiaal. Verdun het monster, verzamel de gegevens en houd vervolgens rekening met de verdunningsfactor bij het uitzetten van het profiel.
6. Maak het polysoomprofiel door het breukgetal versus de absorptie uit te zetten.

Results

Drie representatieve polysoomprofielen zijn weergegeven in figuur 3. Alle profielen zijn van dezelfde giststam. Een typisch polysoomprofiel heeft goed opgeloste pieken voor de ribosomale subeenheden van de jaren 40, 60 en 80 en polysomen. De top van elke ribosomale subeenheid en polysoompiek zal zichtbaar zijn op elk profiel (figuur 3). Een representatief profiel van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem is weergegeven in figuu...

Discussion

Hier is een methode beschreven om polysomische profielen te maken zonder het gebruik van dure geautomatiseerde fractioneringssystemen. Het voordeel van deze methode is dat het polysome profilering toegankelijk maakt voor laboratoria die geen geautomatiseerde fractioneringssystemen hebben. De belangrijkste nadelen van dit protocol zijn vervelende handfractionering en verminderde gevoeligheid in vergelijking met het speciale dichtheidsfractioneringssysteem.

Dit protocol omvat een zorgvuldige voo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparine	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Naald, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Spuit, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801