Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het succesvol aanpakken van de obstakels die onderzoek op neonatale ratten beperken, is belangrijk voor het bestuderen van de verschillen in uitkomsten die worden gezien bij pediatrische ruggenmergletsels (GCI's) in vergelijking met volwassen GCB's. Bovendien kan het betrouwbaar introduceren van therapieën in de doelcellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) een uitdaging zijn en kunnen onnauwkeurigheden de werkzaamheid van de studie of therapie in gevaar brengen. Dit protocol combineert virale vectortechnologie met een nieuwe chirurgische techniek om gentherapieën nauwkeurig te introduceren bij neonatale ratten op postnatale dag 5. Hier wordt een virus dat is ontworpen voor retrograde transport (retroAAV2) van Cre geïntroduceerd op de axonterminals van corticospinale neuronen in het ruggenmerg, waar het vervolgens naar de cellichamen wordt getransporteerd. Een dubbel-floxed inverted orientation (DIO) designerreceptor die uitsluitend wordt geactiveerd door designer drug (DREADD) virus wordt vervolgens geïnjecteerd in de somatomotorische cortex van de hersenen. Deze dubbele infectietechniek bevordert de expressie van de DREADDs alleen in de co-geïnfecteerde corticospinale tractus (CST) neuronen. De gelijktijdige co-injectie van de somatomotorische cortex en cervicale CST-terminals is dus een geldige methode voor het bestuderen van de chemogenetische modulatie van herstel na cervicale DWARSLAESIE-modellen bij neonatale ratten.
Inleiding
Hoewel dwarslaesie een relatief zeldzame gebeurtenis is in de pediatrische populatie, is het bijzonder traumatisch en veroorzaakt het een permanente handicap die een enorme logistieke vooruitziende blik vereist. Bovendien wordt een hoger percentage pediatrische GCB's geclassificeerd als cervicaal en compleet in vergelijking met de volwassen populatie 1,2. Een kenmerk van zoogdiersoorten is dat pasgeborenen aanzienlijk beter herstellen van dwarslaesie dan volwassenen, en dit biedt een kans om de drijvende mechanismen voor herstel bij jongere populaties te beoordelen 3,4,5. Desondanks zijn er minder multimodale studies die onderzoek naar pasgeborenen en babyknaagdieren aanpakken, deels vanwege de extra moeilijkheid om zich nauwkeurig te richten op geselecteerde populaties neuronen in de veel strakkere anatomische oriëntatiepunten van jongere dieren6. Dit artikel richt zich op de directe injectie van zeer efficiënte anterograde en retrograde adeno-geassocieerde vectoren in het ruggenmerg van de rat om belangrijke motorische paden te moduleren met de toepassing van Cre-afhankelijke-DREADDs, waardoor het bereik van multimodale regeneratiestudies wordt uitgebreid.
Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen met een breed scala aan toepassingen, waaronder de introductie van genetisch materiaal om doelgenen te vervangen, groei-eiwitten te upreguleren en het anatomische landschap van het CZSte traceren 7,8,9. Veel van de anatomische details van spinale motorische routes zijn bestudeerd met behulp van klassieke tracers, d.w.z. gebiotinyleerd dextran amine. Hoewel traditionele tracers een belangrijke rol hebben gespeeld bij het blootleggen van neuroanatomie, zijn ze niet zonder hun nadelen: ze labelen willekeurig paden, zelfs als ze correct worden geïnjecteerd, en studies hebben aangetoond dat ze worden opgenomen door beschadigde axonen 10,11,12. Bijgevolg kan dit leiden tot onjuiste interpretaties in regeneratiestudies waarbij afgehakte axonen kunnen worden aangezien voor regenererende vezels.
De volgende methode maakt gebruik van het twee-virale vectorsysteem dat onlangs populair is geworden in modulatiestudies, met twee verschillende virale vectoren in twee afzonderlijke gebieden van hetzelfde neuron13,14. De eerste is een vector die lokaal de cellichamen van projectieneuronen infecteert. De andere is een retrograde vector die wordt getransporteerd vanuit de axonterminals van de projectielonen (figuur 1). De retrograde vector draagt Cre-recombinase en de lokale vector bevat de "Cre-On" dubbel-gefloxeerde sequentie waarin een fluorescerend eiwit (mCherry) wordt gecodeerd. Het native transgen dat zowel hM3Dq als mCherry tot expressie brengt, is omgekeerd ten opzichte van de promotor en wordt geflankeerd door twee LoxP-sites (figuur 2). mCherry komt dus alleen tot expressie in de dubbel getransduceerde projectieneuronen waar Cre-recombinase een recombinatiegebeurtenis induceert tussen de LoxP-sites, waarbij de oriëntatie van het transgen in het juiste leesframe wordt omgedraaid en de expressie van zowel het DREADD- als het fluorescerende eiwit mogelijk wordt gemaakt. Zodra het virale transgen in de juiste oriëntatie is, en indien van toepassing, kunnen de DREADDs tijdelijk neuromodulatie induceren via een afzonderlijk geïnjecteerd ligand, d.w.z. clozapine-N-oxide. Het protocol is ontworpen om induceerbaar neuromodulatieonderzoek bij pasgeborenen te verifiëren, waarbij DREADDS worden geïnjecteerd om de CST's selectief te moduleren. Het twee-virale systeem fungeert als een verzekeringspolis en zorgt ervoor dat elke DREADD-positieve cel traceerbaar is onder fluorescentie met hoge betrouwbaarheid om de injecties te valideren.
Deze methode helpt ook om de kloof in neonataal onderzoek te overbruggen. Pediatrische dwarslaesie presenteert zijn uitdagingen, en onderzoek dat regeneratie, kiemen of plasticiteit analyseert, moet de verschillen tussen pasgeborenen en volwassenen benadrukken 3,15,16,17. Door de chirurgische ingreep te optimaliseren en eerdere anatomische studies met Nissl-kleuring uit te voeren, werden de coördinaten voor zowel de craniale als de spinale injecties gevalideerd. Het doel was om een methode te bieden voor dubbele injecties in een neonatale rat met verhoogde getrouwheid en overlevingskansen.
Voor het huidige model werd de anterograde vector geïnjecteerd in de cellichamen van de somatomotorische cortex met behulp van bregma als referentie 18,19. In termen van de spinale injecties werd de retrograde vector geïnjecteerd in laminae V-VII, waar de CST-axonterminals 20,21 bevinden. Er zijn veel fundamentele vragen die ten grondslag liggen aan hoe bepaalde laesiemodellen jongere dieren anders beïnvloeden en hoe het daaropvolgende herstel afwijkt van een ouder dier. Deze studie toont een robuuste manier om cervicale verwondingen en het herstelvermogen van de voorpootfunctie bij neonatale knaagdieren te bestuderen. Daarentegen hebben de meeste eerdere studies betrekking op herstel voortbeweging na lumbale of thoracale verwondingen 5,22,23,24. Door de dubbel-virale vector te koppelen aan de nieuwe injectietechniek die hier wordt beschreven, helpt dit protocol bepaalde problemen (d.w.z. overlevingskansen) te verminderen die neonatale knaagdieronderzoeken kunnen teisteren. Deze methode is robuust, praktisch en veelzijdig: kleine variaties in de techniek maken het mogelijk om verschillende paden te richten, d.w.z. ventrale CST, dorsale CST en de opgaande dorsale paden.
Voor dit systeem wordt één lokaal werkend virus (bijv. AAV2) geïnjecteerd in het gebied van de neuronale cellichamen van belang. Een tweede retrograde getransporteerd virus dat de expressie van het lokale virus regelt, wordt geïnjecteerd op de axonterminals voor die neuronale populatie. Zo worden per definitie alleen corticospinale neuronen gelabeld. Het retroAAV-Cre-virus werd gekozen met een constitutief actieve CMV-promotor omdat het shuttleplasmide wordt gebruikt om verschillende AAV-serotypen te genereren voor Cre-afhankelijke expressie in verschillende celtypen. Voor corticale injecties werd gekozen voor AAV2 met het transgen aangedreven door de synapsine-1 promotor om elke expressie tot neuronen te beperken. Omdat het 2-virale systeem meer afhankelijk is van de oorsprong en beëindiging van de neuronale populatie van belang, kunnen verschillende promotors worden gebruikt, als ze de expressie van de genen van belang binnen de neuronale populatie van belang kunnen stimuleren. De exciterende neuronale promotor, CamKII, zou bijvoorbeeld kunnen worden vervangen door de synapsine-1. Naast het gebruik van deze AAV-serotypen kunnen retrograde transport naar onvolwassen en in veel mindere mate ook volwassen corticospinale motorneuronen worden bereikt met behulp van het hoge retrograde transporteerbare lentivirus (HiRet)25. HiRet lentivirussen gebruiken een chimere Rabiës / VSV glycoproteïne om opname op de synaps te richten voor retrograde transport. In combinatie met een Tet-On promotor ondersteunt dit 2-virale systeem induceerbare expressie op een retrograde-afhankelijke manier 26,27.
Retrograde virussen brengen vectoren in de synaptische ruimte van een doelneuron, waardoor het door het axon van die cel kan worden opgenomen en naar het cellichaam kan worden getransporteerd. Hoewel lentivirale vectoren eerder enorm succes hebben gehad en langetermijnexpressie bieden in gentherapiestudies, draaide deze methode om een paar eenvoudige redenen naar adeno-geassocieerde virale vectoren26,28: AAV is zuiniger, vergelijkbaar effectief en vormt minder logistieke last, aangezien het een lagere bioveiligheidsniveauaanduiding heeft 29,30,31,32 . Hoewel AAV2, het meest gebruikte serotype, een robuuste transfectie van CST-axonen vertoont, kunnen toekomstige onderzoekers opmerken dat AAV1 enige veelzijdigheid biedt omdat het transynaptisch labelt, waardoor verschillende mogelijke iteraties in toekomstige studies naar voren komen33. De laatste aanpassing is om het retrograde virus te coderen met Cre-recombinase, zodat meerdere anterogradevectoren tegelijkertijd kunnen worden geïntroduceerd, waardoor onnodig intern virusafval wordt verminderd en de kans wordt gemaximaliseerd dat de DREADDs zich in de juiste oriëntatie uitdrukken.
Uiteindelijk demonstreert dit protocol gelijktijdige injectie in de cortex en cervicale wervelkolom, specifiek gericht op respectievelijk de cellichamen en de axonterminals van het corticospinale kanaal. High-fidelity transfectie wordt gezien in de hersenschors en het ruggenmerg. Hoewel het beschreven protocol werd geperfectioneerd voor Sprague Dawley-ratten van 5 dagen oud, is het geschikt voor postnatale dagen 4-10 met kleine aanpassingen aan anesthesie en stereotactische coördinaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle volgende chirurgische en dierverzorgingsprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van Temple University. Het beschreven protocol is een overlevingsoperatie en de dieren werden uiteindelijk geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg natriumpentobarbital aan het einde van hun tijdspunten.
1. Pre-chirurgische voorbereiding
- Bereid ten minste twee getrokken glazen naalden voor virale injectie met behulp van 3,5 ml glazen capillaire pipetten; één naald voor de DREADD en één naald voor de rCre. Bereid uit voorzorg 4-5 naalden voor als ze intraoperatief breken.
- Snijd met behulp van microscissors 1-2 mm overtollig glas van de naald af.
- Plaats deze voor elke naald op 30°, gebruik een micropipette-afschuinmachine om een punt te maken met een opening van 30-40 μm en een afgeschuinde hoek van 45°.
- Bewaar de naalden in een afgedekte petrischaal en steriliseer ze vervolgens door de petrischaal gedurende 15 minuten in een bioveiligheidskap onder UV-licht te plaatsen.
- Bereid de benodigde virussen voor door vóór de procedure een geschikt volume uit de vriezer van -80 °C te verwijderen, rekening houdend met het feit dat elk dier 3 μL van elk virus nodig heeft.
OPMERKING: Vervoer en bewaar het virus op ijs wanneer het niet in gebruik is. Dit protocol is ontwikkeld met behulp van AAV2-hM3Dq-mCherry en AAV2-retroCre om 3 μL van elk virus per dier te injecteren. Het DREADD plasmide, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (zie de Tabel van Materialen), werd gebruikt om de anterograde AAV2 te maken met een virale titer van 1,54 × 1012 genoomkopieën (GC)/ml. Het Cre plasmide, pAAV-CMV-scCre, werd gebruikt om de retrograde AAV2 te maken met een virale titer van 4,27 × 1012 GC/ml. - Steek de injector in de micropomp en plaats deze in een micromanipulator met een Vernier-schaal.
- Om de aan- of afwezigheid van virus in de naald visueel te bevestigen, laadt u gekleurde kleurstof, d.w.z. rode olie, in de naald. Vermijd bubbels in de naald.
- Steek de glazen naald in de injector en zorg ervoor dat de naald goed past.
- Herhaal, indien beschikbaar, het hele proces met een afzonderlijke injectiepomp voor elk virus. Als er slechts één injectiepomp beschikbaar is, bereid dan twee afzonderlijke naalden voor en vervang de gebruikte naald wanneer het tijd is om de virussen te verwisselen.
2. Anesthesie en chirurgische voorbereiding van de site
- Weeg het dier op een digitale weegschaal. Noteer het preoperatieve gewicht om het vereiste volume van de anestheticum te bepalen.
OPMERKING: Uit dit protocol bleek dat de meest betrouwbare anesthesietechniek om een bevredigend verdovingsvlak gedurende de operatietijd te garanderen, een combinatie van ketamine en onderkoeling is. Ketamine is onvoldoende om anesthesie op zichzelf te garanderen, en het aanvullen met xylazine heeft een smalle drempel voordat de intraoperatieve mortaliteit toeneemt. Hypothermie op zichzelf is niet voldoende voor langdurige operaties (dubbele wervelkolom- en hersenchirurgie vereisen waarschijnlijk >1 uur stabiele anesthesie). - Verdoof de pup door verdunde ketamine (10 mg/ml) subcutaan tussen de schouderbladen te injecteren, zodat het dier een dosis ketamine van 100 mg/kg krijgt; wacht 5 min.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, op postnatale dag 5 weegt een rattenjong 10 g en krijgt 0,1 ml van de verdunde ketamine-oplossing (10 mg / ml). - Zet de pup 6-8 min op crushed ice. Bescherm het tegen bevriezing door het dier in een latex handschoen of parafilm te plaatsen om direct contact met ijs te voorkomen.
- Knijp de voet stevig samen met een tang om een geschikt verdovingsvlak te bevestigen. Als reflexieve terugtrekking optreedt, laat dan nog eens 2 minuten op ijs staan voordat u verder gaat.
- Breng in grote lijnen antisepticum aan op het hoofd en de rug van het dier met behulp van steriel gaas gedrenkt in een 5% jodiumoplossing. Steriliseer vervolgens met gaas gedrenkt in 70% ethanol. Breng de antiseptische doekjes elk drie keer aan, afwisselend jodium en ethanol om het gaas te weken.
OPMERKING: Er is geen oogzorg nodig omdat jonge pups hun ogen pas openen op de leeftijd van 14 dagen. - Als een dier een dubbele operatie (hersenen + wervelkolom) moet ondergaan, zorg dan voor een normale zoutoplossing bolus vóór de operatie (0,02 ml / g) subcutaan tussen de schouderbladen.
OPMERKING: als het dier tijdens de operatie reageert en verdere anesthesie vereist is, vervang het dier dan gedurende 5 minuten op ijs.
3. Chirurgische veld- en instrumentvoorbereiding
- Autoclaaf de chirurgische hulpmiddelen die een scalpelhouder, rongeurs, hemostats, medium punt gebogen tangen en retractors bevatten
- Maak de microscoop klaar en installeer de neonatale rat stereotaxische adapter om deze stevig in de stereotaxische houder voor volwassenen te plaatsen.
- Voer de operatie uit met behulp van gesteriliseerde handschoenen. Open een verpakking met voorverpakte steriele chirurgische handschoenen en plaats de steriele handschoenwikkel op tafel, waarbij de wikkel als extra ruimte wordt gebruikt om gebruikt gereedschap te plaatsen.
OPMERKING: Het is belangrijk om goede chirurgische praktijken te volgen en steriliteit te behouden tijdens de procedure. - Bevestig een 11-mesje in de scalpelhouder. Plaats steriele zoutoplossing, 4,0 chrome catgut-hechtdraad, 4,0 zijden hechtdraad en materialen om bloedingen onder controle te houden, bijvoorbeeld steriel gaas, steriele applicators met katoenpunt en driehoeken.
- Stel twee chirurgische velden in zoals hierboven beschreven, waarbij één site is toegewezen voor craniotomie en de andere site is toegewezen voor cervicale laminectomie.
- Haal het dier op en bevestig het in de stereotaxische adapter: omdat de pasgeborenen erg kraakbeenachtig zijn, fixeer je ze voorzichtig door de oorstaven breed naar de mandibulaire gewrichten te richten. Eenmaal horizontaal gestabiliseerd, introduceert u voorzichtig het voorste mondstuk.
OPMERKING: Een niet-bindende regel die wordt gebruikt om een "plat" chirurgisch gebied te bieden, is om de oorstaven op dezelfde hoogte te bevestigen en het mondstuk op ongeveer 2-3 niveaus lager.
4. Het uitvoeren van de craniotomie en het blootstellen van de somatomotorische cortex
- Identificeer het gebied waar de incisie zal worden gemaakt door op de tang in de middellijn op de bovenkant van de hoofdhuid te drukken, voelend voor de sagittale hechting. Maak een incisie van 1 cm langs het sagittale hechtvlak, beginnend direct boven de ooglijn. Houd de huid strak om een schone, rechte en precieze incisie te garanderen.
- Identificeer bregma (de convergentie van de coronale en sagittale hechtingen) door de tang langs het oppervlak van de schedel voorzichtig te onderzoeken en goed te letten op de hechtlijnen en eventuele inkepingen veroorzaakt door de tang die langs de pariëtale en frontale botten loopt.
- Onderhoud de opening met de toepassing van verzwaarde haken aan de kant van de interesse. Merk op dat de spinale injectie aan de rechterkant wordt gemaakt, de craniale injectie aan de linkerkant.
- Verwijder de aponeurose met een combinatie van de katoenen uiteinden en microsnijders om de blootstelling van bregma te maximaliseren voor een verhoogde nauwkeurigheid. Zorg ervoor dat de coronale hechting ver genoeg zijdelings in het zicht is om een ruw sjabloon te bieden voor volgende injecties.
- Knip met behulp van de microscissors ongeveer een gedeelte van 3 x 2 mm van het linker frontale schedelbot direct naast bregma uit.
OPMERKING: Zodra de botklep zorgvuldig is verwijderd, moet er een duidelijk venster zijn met blootgesteld hersenmateriaal dat klaar is voor injectie. De resterende hechtlijnen aan de contralaterale kant van de hersenen zullen fungeren als een visuele gids voor het handhaven van de nauwkeurigheid langs de anterieur-achterste (AP) as. - Ruim vuil, hersenvocht (CSF) en bloed op met wattentips.
OPMERKING: Het is normaal dat bloed of liquor de visuele lijn enigszins vertroebelt, dus het is raadzaam om het gebied regelmatig met wattentips vrij te maken.
Figuur 3: Een schematische illustratie van de craniale injectiecoördinaten (mm) ten opzichte van bregma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Het virus laden en de injector positioneren
- Laad het virus in de injector door ~ 5 μL op een stuk parafilm te pipetteren en plaats de naald zo dat de punt bovenop de druppel van het virus rust.
- Zorg ervoor dat er extra virus in de injector wordt geladen om een soepele injectie te garanderen. Trek bijvoorbeeld bij het injecteren van in totaal 3 μL (1 μL voor elke injectieplaats) 4 μL van het virus op met een snelheid van 250 nL/s met behulp van de micropomp.
- Verwijder het overtollige virus met een laboratoriumdoekje.
- Plaats de micromanipulator zo dat de Vernier-schaal zichtbaar is en plaats de naald boven de sagittale hechtdraad.
- Laat de naald zakken tot net boven het gebied dat bregma vertegenwoordigt (figuur 3) en noteer de AP- en mediaaal-laterale (ML) coördinaten.
- Aangezien de injecties zich aan de linkerkant bevinden, genereert u doelcoördinaten door 1, 1,5 en 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) af te trekken van de ML-coördinaten voor bregma.
OPMERKING: De AP-positie is +0,5 mm van bregma voor alle drie de injecties. - Plaats de naald in positie voor de eerste injectie. AP: +0,5, ML: -1,0
- Laat de naald naar de blootgestelde hersenen zakken totdat deze de buitenste cortex inspringt. Noteer de hoogte van de naald en breng de naald naar beneden in positie door 0,6 mm af te trekken van de hoogte van het oppervlak van de hersenen. Diepte van de injectie: corticale oppervlak -0,6 mm.
OPMERKING: Het is belangrijk om de diepte van het oppervlak voor elke injectie op te merken, omdat er lichte verstoringen in de positionering van de rat kunnen optreden.
6. Virus injecteren in de somatomotorische cortex
- Zodra de naald op zijn plaats zit, programmeert u de injector om 1 μL te injecteren met een snelheid van 250 nL/min.
- Zodra de injectie is voltooid, laat u de naald gedurende 3 minuten in de cortex rusten.
- Herhaal de injecties voor de andere coördinaten: in totaal 3 injecties langs de cortex ten opzichte van bregma, allemaal op een diepte van -0,6 mm: 1) AP: +0,5 mm, ML: -1,0 mm 2) AP: +0,5 mm, ML: -1,5 mm 3) AP: +0,5 mm, ML: -2,0 mm.
- Na voltooiing van de injecties, raadpleeg rubriek 9 om te hechten en breng het dier over naar de andere operatietafel voor cervicale laminectomie.
7. Het creëren van een wervelvenster voor nauwkeurige injecties in het ruggenmerg
- Identificeer de incisieplaats door vingers te gebruiken om de basis van de schedel te palperen. Begin bij de middellijn met de incisie 1-2 mm achter de schedelbasis met behulp van een # 11-mes en verleng de incisie 1 cm achteraan om de oppervlakkige spier bloot te leggen. Houd de huid strak door spanning aan te brengen met de duim en wijsvinger om een schone incisie te garanderen.
- Gebruik de scherpe punt van het mes en maak voorzichtig een reeks sneden langs de middellijn van de oppervlakkige spier om de ruggenmergholte en diepe spinale spieren bloot te leggen. Gebruik een tang om de spier open te spreiden en visualiseer het chirurgische venster.
OPMERKING: De oppervlakkige spier zal lichtroze lijken, terwijl de diepe spinale spieren licht witachtig grijs zullen lijken. - Zodra de diepe spinale spieren zijn blootgesteld, plaatst u retractors in het chirurgische venster. Gebruik indien nodig een tang om de laterale huid en spieren vast te pakken om ze rond de tanden van de retractors te strekken. Trek het chirurgische venster in tot een breedte van 7-8 mm, waardoor een onbelemmerd zicht op de wervelkolom mogelijk is.
- Identificeer de tweede cervicale (C2 of as) wervel door zijn prominente spineuze proces dat dorsaal en inkapseling in een grote koepelvormige spier projecteert. Gebruik een tang of een stompe sonde om dit proces te voelen en te identificeren, omdat dit het leidende oriëntatiepunt zal zijn.
OPMERKING: De aangrenzende C3-wervel wordt vaak enigszins afgesloten door de grote C2-spier; daarom helpt een zachte dissectie van spieren bij C3 met een tang of een botschraper om de wervel te definiëren en te helpen bij het tellen van wervels. - Gebruik de platte rand van een botschraper om C3-C7-wervels bloot te leggen door de diepe ruggenmergspier voorzichtig naar de zijkanten weg te schrapen. Start mediaal en schraap zijdelings langs de richting parallel aan de wervellaminae om een juiste blootstelling te garanderen, waardoor een duidelijk onderscheid van wervellaminae mogelijk is. Controleer eventuele bloedingen met katoenen tips.
- Snijd met behulp van een paar microscissors voorzichtig de zijranden van de kraakbeenachtige laminae bij C6 en C7. Gebruik C2 als leidraad bij het tellen van wervelniveaus.
- Verwijder met behulp van een fijne tang voorzichtig het ontlede deel van de lamina om het ruggenmerg bloot te leggen. Zorg ervoor dat het wervelvenster groot genoeg is om de gewenste injectieplaats te huisvesten. Verwijder alle scherpe of gekartelde delen van het bot die het ruggenmerg kunnen doorboren met microscissors en tangen zoals hierboven beschreven.
- Plaats het dier in de stereotaxische schedelhouder zoals beschreven in rubriek 3.6. Plaats bovendien een opgerold stuk gaas onder de stam van het dier om de achterhand op te tillen.
OPMERKING: Verhoging van de achterhand van het dier tilt de thorax effectief van het oppervlak van de houder om te voorkomen dat ademhalingsbewegingen de positie van de naald tijdens de injectie beïnvloeden. - Voordat u met injecties begint, moet u het ruggenmergvenster vrijmaken van bloed of hersenvocht door voorzichtig katoenen tips en Sugi-driehoeken op het gebied aan te brengen zonder het ruggenmerg te beledigen. Creëer verder een barrière rond de omtrek van het raam om occlusie van de injectieplaats door continue bloedingen of CSF-lekkage te voorkomen. Om dit te doen, plaatst u een klein stukje absorbeerbaar katoen in de laterale delen van het ruggenmergvenster.
8. Directe injecties in het ruggenmerg gericht op axonterminals
- Gebruik de punt van de glazen injectienaald om de middellijn van het ruggenmerg te benaderen door de spinale slagader te identificeren. Als de spinale slagader echter merkbaar uit het midden is of op enigerlei wijze afwijkt, benader dan de middellijn door de positie van het C2-processusproces te gebruiken en dit over de lengte van de wervelkolom te extrapoleren.
OPMERKING: Raadpleeg rubriek 5.1 voor instructies over het laden van het virus. - Eenmaal geïdentificeerd, situeer de naald net achter de C5-lamina op de geschatte middellijn en gebruik dit als referentiepunt. Beweeg vervolgens met behulp van de micromanipulator de naald zijdelings naar rechts met 0,3 mm. Laat de naald zakken totdat deze net het oppervlak van het ruggenmerg raakt; steek vanaf deze diepte de naald 0,6 mm in het ruggenmerg. Blijf indien nodig de naald dopen totdat deze het ruggenmerg doorboort; trek vervolgens de naald in of laat deze zakken tot de juiste diepte.
- Injecteer 1 μL retroAAV2-scCre bij 250 nL/min. Nadat de injectie is voltooid, wacht u 2 minuten totdat het virus zich in het ruggenmerg verspreidt voordat u de naald langzaam terugtrekt. Herhaal de injecties met dezelfde laterale en dieptecoördinaten op nog twee plaatsen in het ruggenmergvenster, één in het midden en de laatste net voor de T1-lamina.
9. Wondsluiting en postoperatieve zorg
- Haal het dier uit de stereotaxische houder en haal de retractors of haken eruit. Ruim het wondgebied op met een paar druppels steriele normale zoutoplossing.
- Hecht de hoofdhuid met 4,0 zijden hechting, twee of 3 hechtingen in totaal.
- Gebruik bij het hechten van de cervicale opening 4,0 chromische darm om de spierlagen stevig opnieuw te bevestigen (2 hechtingen zouden voldoende moeten zijn). Hecht de cervicale huidopening met 4,0 zijde (4 hechtingen verwacht).
- Zodra het dier is gesloten, brengt u oordeelkundig vloeibaar verband aan over de hechtingen.
- Plaats het dier onder een verwarmingslamp en houd het nauwlettend in de gaten totdat het volledig opnieuw wordt gewekt. Zodra het dier wakker, bewegend en droog is, reinigt u de wonden voorzichtig met steriel gaas. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden.
- Breng het dier terug naar de thuiskooi met zijn moeder. Zorg ervoor dat verwaarlozing en kannibalisatie van de baby van de moeder naar de pups wordt voorkomen:
- Maak de onderzoekers vertrouwd met de moeder in afwachting van een operatie door middel van zachte behandeling (5-10 min) tweemaal daags, beginnend een week voor de operatie.
- Breng de pups samen terug naar de thuiskooi om verstoring voor de moeder te beperken.
- Injecteer de moeder met acepromazine 1,5 mg/kg q12 h subcutaan op de dag van de operatie.
OPMERKING: Pijnbestrijding dient het dubbele doel van het verstrekken van analgesie voor de pups en het aanmoedigen van een eerdere terugkeer naar activiteit, waardoor re-integratie bij de moeder wordt bevorderd. - Injecteer buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan q8 h vanaf de operatie gedurende in totaal 3 dagen (postoperatieve dagen 0, 1, 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle injectie en transport van de virale vector moet resulteren in de transductie van unilaterale neuronen in het ruggenmerg en de motorische cortex. Figuur 4 toont de labeling van laag V CST-neuronen in de motorische cortex van een hersencoronasectie die Cre-afhankelijk-DREADDs-mCherry tot expressie brengt, gelijktijdig geïnjecteerd met een contralaterale wervelkolominjectie van rCre. De secties waren gekleurd met dsRed-antilichaam.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Induceerbare genetische modulatie van hersenactiviteit met injecteerbare chemogenetische modifiers is een krachtig hulpmiddel bij het bestuderen van de verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan het herstel van dwarslaesie. De nauwkeurigheid van de targeting voor de induceerbare G-eiwit-gekoppelde receptoren (DREADDs) wordt verder verhoogd als men bedenkt dat fluorescentietracering de anatomische precisie in de histologie valideert. Dit artikel bespreekt een betrouwbare methode om te onderzoeken of het al dan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door een fellowship grant van Shriners Hospitals for Children SHC-84706.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | Voor gebruik met de scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | Voor gebruik met de scalpel. |
| 1 mL Spuiten | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Voor anesthesie SC injectie en vloeistof bolus |
| 4.0 zijden hechtdraad | Ethicon | 771-683G | Voor huid sluiting |
| 4.0 Chromic Catgut Hechdraad | DemeTECH | NN374-16 | Om spier te herbinden tijdens het sluiten. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Gebruikt om de uiteinden van de getrokken glas capillaire buisjes te slijpen om functionele glas naalden te vormen. |
| 5% Jodium Oplossing | Purdue Products L.P. | L01020-08 | Voor gebruik bij sterilisatie van de chirurgische locatie. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Voor sterilisatie van nieuw bereide glas naalden, dier modellen tijdens chirurgische voorbereiding |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Om het dier in de juiste bewustzijnstoestand te houden tijdens chirurgie. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | Om chirurgische instrumenten te steriliseren door verhitting. |
| Digitale Weegschaal | Okaus | REV.005 | Voor het wegen van het dier tijdens chirurgische voorbereiding. |
| Flexibele Naaldbevestiging | World Precision Instruments | MF34G-5 | Voor het schoonmaken van glas naalden en het laden van rode olie in glas naalden. |
| Glas capillaire buisjes | World Precision Instruments | 4878 | Voor getrokken glas naalden - moet ontworpen zijn voor nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | Voor algemeen gebruik in chirurgie. |
| Medium Punt Gebogen Forceps | Roboz | RS-5136 | Voor algemeen gebruik in chirurgie. |
| Micromanipulator met een Vernier Schaal | Kanetec | N/A | Voor precies richten tijdens chirurgie. |
| Microschaar | Roboz | RS-5621 | Voor het afsnijden van glas snuifjes van vers getrokken glas capillaire buisjes. |
| Lab Standaard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | Om de neonatale stereotaxic houder op zijn plaats te houden |
| Lab Standaard met Muis & Neonates Adapter | 51615 | Voor neonatale schedel fixatie tijdens craniale chirurgie en spinale injecties | |
| Microscoop met Licht en Vernier Schaal Oculair | Leitz Wetzlar | N/A | Gebruikt om het slijpen van getrokken glas capillaire buisjes in functionele glas naalden te visualiseren en te meten. |
| MicroSyringe Pomp Controller | World Precision Instruments | 62403 | Om de injectiesnelheid te controleren. |
| Nanoliter 2000 Pomp Hoofd Injector | World Precision Instruments | 500150 | Om virus op een gecontroleerde manier te laden en te injecteren. |
| Naald Puller | Narishige | PC-100 | Om glas capillaire buisjes te verhitten en uit elkaar te trekken om glas naalden te vormen. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmide | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmide #44361) | Bryan Roth’s lab door Addgene | DREADD plasmide | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Om te helpen met het laden van virus in de nanoinjector. |
| PrecisionGlide Naalden (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Voor gebruik met de 1mL en 10 mL spuiten om injectie van het dier model mogelijk te maken. |
| Ratten Tandtang | Roboz | RS-5152 | Voor het grijpen van stekelprocessen. |
| Rode Olie | N/A | N/A | Om een front te bieden voor visualisatie van virus dat weefsel binnenkomt tijdens injectie. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | Om de chirurgische wond open te houden. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Om spier van de wervelkolom te verwijderen tijdens chirurgie. |
| Scalpel Blad Handgreep | Roboz | RS-9843 | Om de huid en vetkussen van het dier model tijdens chirurgie te snijden. |
| Schaar | Roboz | RS-5980 | Voor algemeen gebruik in chirurgie. |
| Haakjes Verwijdertang | Kent Scientific | INS750347 | Om de haakjes te verwijderen, mocht ze verkeerd aangebracht zijn. |
| Steriele Doek | Phenix Research Products | BP-989 | Om een steriele oppervlakte voor de operatie te bieden. |
| Steriele Wattenstaafjes | Puritan | 806-WC | Om bloed in de chirurgische wond op te nemen terwijl steriliteit wordt gehandhaafd. |
| Steriele Gaas | Covidien | 2146 | Om het chirurgische gebied en chirurgische gereedschappen schoon te maken terwijl steriliteit wordt gehandhaafd. |
| Steriele Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Voor gebruik bij bloedverdunning, en voor het vervangen van vloeistoffen na de operatie. |
| Chirurgische Handschoenen | N/A | N/A | Voor gebruik door de chirurg om een steriele zone tijdens chirurgie te handhaven. |
| Chirurgische Verwarmingspad | N/A | N/A | Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur van het dier model tijdens chirurgie. |
| Chirurgische Microscoop | N/A | N/A | Voor verbeterde visualisatie van de chirurgische wond. |
| Chirurgische Stapler | Kent Scientific | INS750546 | Om de haakjes aan te brengen. |
| Water Convectie Verwarmingspad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Voor gebruik in het post-operationele herstelgebied om de lichaamstemperatuur van het bewusteloze dier te handhaven. |
| Gewichte Haakjes | N/A | N/A | Om de chirurgische |
Referenties
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825(2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47(2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160(2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447(2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473(2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
