Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Samenvatting

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.

Samenvatting

Het succesvol aanpakken van de obstakels die onderzoek op neonatale ratten beperken, is belangrijk voor het bestuderen van de verschillen in uitkomsten die worden gezien bij pediatrische ruggenmergletsels (GCI's) in vergelijking met volwassen GCB's. Bovendien kan het betrouwbaar introduceren van therapieën in de doelcellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) een uitdaging zijn en kunnen onnauwkeurigheden de werkzaamheid van de studie of therapie in gevaar brengen. Dit protocol combineert virale vectortechnologie met een nieuwe chirurgische techniek om gentherapieën nauwkeurig te introduceren bij neonatale ratten op postnatale dag 5. Hier wordt een virus dat is ontworpen voor retrograde transport (retroAAV2) van Cre geïntroduceerd op de axonterminals van corticospinale neuronen in het ruggenmerg, waar het vervolgens naar de cellichamen wordt getransporteerd. Een dubbel-floxed inverted orientation (DIO) designerreceptor die uitsluitend wordt geactiveerd door designer drug (DREADD) virus wordt vervolgens geïnjecteerd in de somatomotorische cortex van de hersenen. Deze dubbele infectietechniek bevordert de expressie van de DREADDs alleen in de co-geïnfecteerde corticospinale tractus (CST) neuronen. De gelijktijdige co-injectie van de somatomotorische cortex en cervicale CST-terminals is dus een geldige methode voor het bestuderen van de chemogenetische modulatie van herstel na cervicale DWARSLAESIE-modellen bij neonatale ratten.

Inleiding

Hoewel dwarslaesie een relatief zeldzame gebeurtenis is in de pediatrische populatie, is het bijzonder traumatisch en veroorzaakt het een permanente handicap die een enorme logistieke vooruitziende blik vereist. Bovendien wordt een hoger percentage pediatrische GCB's geclassificeerd als cervicaal en compleet in vergelijking met de volwassen populatie ^1,2. Een kenmerk van zoogdiersoorten is dat pasgeborenen aanzienlijk beter herstellen van dwarslaesie dan volwassenen, en dit biedt een kans om de drijvende mechanismen voor herstel bij jongere populaties te beoordelen ^3,4,5

Protocol

Alle volgende chirurgische en dierverzorgingsprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van Temple University. Het beschreven protocol is een overlevingsoperatie en de dieren werden uiteindelijk geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg natriumpentobarbital aan het einde van hun tijdspunten.

1. Pre-chirurgische voorbereiding

1. Bereid ten minste twee getrokken glazen naalden voor virale injectie met behulp van 3,5 ml glazen capillaire pipetten; één naald voor de DREADD en één naald voor de rCre. Bereid uit voorzorg 4-5 naalden voor als ze intraoperatief breken.
2. Snijd met behulp van....

Resultaten

Succesvolle injectie en transport van de virale vector moet resulteren in de transductie van unilaterale neuronen in het ruggenmerg en de motorische cortex. Figuur 4 toont de labeling van laag V CST-neuronen in de motorische cortex van een hersencoronasectie die Cre-afhankelijk-DREADDs-mCherry tot expressie brengt, gelijktijdig geïnjecteerd met een contralaterale wervelkolominjectie van rCre. De secties waren gekleurd met dsRed-antilichaam.

Discussie

Induceerbare genetische modulatie van hersenactiviteit met injecteerbare chemogenetische modifiers is een krachtig hulpmiddel bij het bestuderen van de verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan het herstel van dwarslaesie. De nauwkeurigheid van de targeting voor de induceerbare G-eiwit-gekoppelde receptoren (DREADDs) wordt verder verhoogd als men bedenkt dat fluorescentietracering de anatomische precisie in de histologie valideert. Dit artikel bespreekt een betrouwbare methode om te onderzoeken of het al dan.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	Voor gebruik met de scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	Voor gebruik met de scalpel.
1 mL Spuiten	Becton, Dickinson and Company	309659	Voor anesthesie SC injectie en vloeistof bolus
4.0 zijden hechtdraad	Ethicon	771-683G	Voor huid sluiting
4.0 Chromic Catgut Hechdraad	DemeTECH	NN374-16	Om spier te herbinden tijdens het sluiten.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Gebruikt om de uiteinden van de getrokken glas capillaire buisjes te slijpen om functionele glas naalden te vormen.
5% Jodium Oplossing	Purdue Products L.P.	L01020-08	Voor gebruik bij sterilisatie van de chirurgische locatie.
70% Ethanol	N/A	N/A	Voor sterilisatie van nieuw bereide glas naalden, dier modellen tijdens chirurgische voorbereiding
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	Om het dier in de juiste bewustzijnstoestand te houden tijdens chirurgie.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	Om chirurgische instrumenten te steriliseren door verhitting.
Digitale Weegschaal	Okaus	REV.005	Voor het wegen van het dier tijdens chirurgische voorbereiding.
Flexibele Naaldbevestiging	World Precision Instruments	MF34G-5	Voor het schoonmaken van glas naalden en het laden van rode olie in glas naalden.
Glas capillaire buisjes	World Precision Instruments	4878	Voor getrokken glas naalden - moet ontworpen zijn voor nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	Voor algemeen gebruik in chirurgie.
Medium Punt Gebogen Forceps	Roboz	RS-5136	Voor algemeen gebruik in chirurgie.
Micromanipulator met een Vernier Schaal	Kanetec	N/A	Voor precies richten tijdens chirurgie.
Microschaar	Roboz	RS-5621	Voor het afsnijden van glas snuifjes van vers getrokken glas capillaire buisjes.
Lab Standaard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	Om de neonatale stereotaxic houder op zijn plaats te houden
Lab Standaard met Muis & Neonates Adapter	51615	Voor neonatale schedel fixatie tijdens craniale chirurgie en spinale injecties
Microscoop met Licht en Vernier Schaal Oculair	Leitz Wetzlar	N/A	Gebruikt om het slijpen van getrokken glas capillaire buisjes in functionele glas naalden te visualiseren en te meten.
MicroSyringe Pomp Controller	World Precision Instruments	62403	Om de injectiesnelheid te controleren.
Nanoliter 2000 Pomp Hoofd Injector	World Precision Instruments	500150	Om virus op een gecontroleerde manier te laden en te injecteren.
Naald Puller	Narishige	PC-100	Om glas capillaire buisjes te verhitten en uit elkaar te trekken om glas naalden te vormen.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmide
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmide #44361)	Bryan Roth’s lab door Addgene		DREADD plasmide
Parafilm	Bemis	PM-996	Om te helpen met het laden van virus in de nanoinjector.
PrecisionGlide Naalden (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Voor gebruik met de 1mL en 10 mL spuiten om injectie van het dier model mogelijk te maken.
Ratten Tandtang	Roboz	RS-5152	Voor het grijpen van stekelprocessen.
Rode Olie	N/A	N/A	Om een front te bieden voor visualisatie van virus dat weefsel binnenkomt tijdens injectie.
Retractors	Roboz	RS-6510	Om de chirurgische wond open te houden.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Om spier van de wervelkolom te verwijderen tijdens chirurgie.
Scalpel Blad Handgreep	Roboz	RS-9843	Om de huid en vetkussen van het dier model tijdens chirurgie te snijden.
Schaar	Roboz	RS-5980	Voor algemeen gebruik in chirurgie.
Haakjes Verwijdertang	Kent Scientific	INS750347	Om de haakjes te verwijderen, mocht ze verkeerd aangebracht zijn.
Steriele Doek	Phenix Research Products	BP-989	Om een steriele oppervlakte voor de operatie te bieden.
Steriele Wattenstaafjes	Puritan	806-WC	Om bloed in de chirurgische wond op te nemen terwijl steriliteit wordt gehandhaafd.
Steriele Gaas	Covidien	2146	Om het chirurgische gebied en chirurgische gereedschappen schoon te maken terwijl steriliteit wordt gehandhaafd.
Steriele Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	Voor gebruik bij bloedverdunning, en voor het vervangen van vloeistoffen na de operatie.
Chirurgische Handschoenen	N/A	N/A	Voor gebruik door de chirurg om een steriele zone tijdens chirurgie te handhaven.
Chirurgische Verwarmingspad	N/A	N/A	Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur van het dier model tijdens chirurgie.
Chirurgische Microscoop	N/A	N/A	Voor verbeterde visualisatie van de chirurgische wond.
Chirurgische Stapler	Kent Scientific	INS750546	Om de haakjes aan te brengen.
Water Convectie Verwarmingspad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Voor gebruik in het post-operationele herstelgebied om de lichaamstemperatuur van het bewusteloze dier te handhaven.
Gewichte Haakjes	N/A	N/A	Om de chirurgische