Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nucleaire transporttesten in gepermeabiliseerde corticale neuronen van muizen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62710

⸱

9 juli 2021

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Whiting School of Engineering, Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor selectieve plasmamembraanpermeabilisatie van primaire corticale neuronen van muizen voor geautomatiseerde analyse van neuronaal nucleocytoplasmatisch transport met een hoog gehalte.

Samenvatting

Verstoring van het nucleocytoplasmatisch transport is in toenemende mate betrokken bij de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten. Bovendien is er een groeiende erkenning van celspecifieke verschillen in de complexe structuur van de kernporie, wat leidt tot de noodzaak om nucleaire transportmethoden aan te passen voor gebruik in neuronen. Gepermeabiliseerde celtesten, waarbij het plasmamembraan selectief wordt geperforeerd door digitonine, worden veel gebruikt om passief en actief nucleair transport in onsterfelijke cellijnen te bestuderen, maar zijn niet toegepast op neuronale culturen. Bij onze eerste pogingen zagen we het snelle verlies van de integriteit van het kernmembraan in primaire corticale neuronen van muizen die werden blootgesteld aan zelfs lage concentraties digitonine. We veronderstelden dat neuronale kernmembranen uniek kwetsbaar kunnen zijn voor het verlies van cytoplasmatische ondersteuning. Na het testen van meerdere benaderingen om de nucleaire stabiliteit te verbeteren, zagen we een optimale nucleaire integriteit na hypotone lysis in aanwezigheid van een geconcentreerd runderserumalbuminekussen. Neuronale kernen die met deze benadering zijn bereid, importeren op betrouwbare wijze recombinante fluorescerende lading op een energieafhankelijke manier, waardoor de analyse van nucleaire import door microscopie met een hoog gehalte met geautomatiseerde analyse wordt vergemakkelijkt. We verwachten dat deze methode breed toepasbaar zal zijn voor studies naar passief en actief nucleair transport in primaire neuronen.

Inleiding

Verstoring van het nucleocytoplasmatisch transport, het gereguleerde transport van eiwitten en RNA tussen de kern en het cytoplasma, is in toenemende mate betrokken bij de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten (recent herzien1). Wij en anderen hebben structurele en functionele verstoring van het nucleocytoplasmatisch transportapparaat gerapporteerd in postmortem weefsel en diermodellen van C9orf72 amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie (FTD), de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Huntington 2,3,4,5 . De mechanismen en functionele gevolgen van verstoring van het nucleocytoplasmatisch transport voor neurodegeneratie, en benaderingen voor therapeutische redding, zijn gebieden van lopend onderzoek.

Kernporiën zijn grote transmembraancomplexen van ~30 nucleoporine-eiwitten die diffusie van kleine moleculen over het kernmembraan mogelijk maken, maar in toenemende mate de doorgang van ladingen >40 kD beperken via een permeabiliteitsbarrière van fenylalanine-glycine (FG)-rijke nucleoporinen in het centrale kanaal6. Grotere ladingen die sequenties van nucleaire lokalisatiesignalen (NLS) of nucleaire exportsignalen (NES) bevatten, ondergaan actief, receptorgemedieerd transport door de porie via nucleaire transportreceptoren (importines en exportines) en een steile gradiënt van de kleine GTPase Ran over het nucleaire membraan (onlangs beoordeeld7). Er is een breed scala aan methoden ontwikkeld om de dynamiek van nucleair transport in gekweekte cellen te analyseren, waaronder het transport van endogene ladingen en gelabelde reporterconstructies die dienen als substraten voor de belangrijkste subklassen van transportreceptoren. Dergelijke benaderingen zijn gemakkelijk aangepast aan neuronen 2,5,8 en bieden een uitlezing van verstoringen van nucleair transport in de context van een intacte, levende cel. In live celtesten is het vermogen om nucleaire transportreacties direct te manipuleren of ze geïsoleerd van andere cellulaire processen te onderzoeken echter beperkt.

Bij gepermeabiliseerde celtesten wordt het plasmamembraan selectief geperforeerd en wordt het cytoplasma vrijgegeven, waardoor de nucleaire envelop en de nucleaire poriecomplexen intact blijven en in staat zijn om passief of energieafhankelijk bidirectioneel transport uit te voeren 9,10. Dergelijke transportreacties kunnen gemakkelijk worden gereconstitueerd door toevoeging van hele cellysaten, cytoplasmatische fracties of gezuiverde recombinante nucleaire transporteiwitten en hun ladingen. Gepermeabiliseerde celtesten maken dus een breed scala aan biochemische of biofysische onderzoeken mogelijk, waaronder de afgifte van recombinante of synthetische eiwitten en RNA's die relevant zijn voor de studie van neurodegeneratieve ziekten.

Gezien meldingen van celspecifieke verschillen in de structuur van het kernporiecomplex en de transportdynamiek11,12, wilden we de permeabiliseerde celtest aanpassen voor gebruik in primaire neuronale culturen. Hoewel het veel wordt gebruikt om nucleair transport in onsterfelijke cellijnen te analyseren, vonden we, ondanks uitgebreid literatuuronderzoek, geen gepubliceerde rapporten van neuronale plasmamembraanpermeabilisatie die het behoud van de integriteit van het kernmembraan verifieerden. De meeste protocollen zijn gebaseerd op digitonine, een wasmiddel dat zich richt op de unieke cholesterolsamenstelling van het plasmamembraan, om het kernmembraan te perforeren terwijl het kernmembraan intact blijft13. Onze eerste pogingen om digitonine te gebruiken in primaire corticale neuronen van muizen toonden onmiddellijk verlies van integriteit van het kernmembraan, wat blijkt uit diffusie van een 70 kD fluorescerend dextran in de kern. We veronderstelden dat het scheuren van de nucleaire envelop zou kunnen worden veroorzaakt door mechanische verstoring door verlies van cytoplasmatische ondersteuning, en testten meerdere optimalisatiemethoden, waaronder moleculaire crowding, cytoskeletale stabilisatie en alternatieve methoden voor cellyse. Hier beschrijven we een methode van snelle hypotone permeabilisatie met behulp van een geconcentreerd runderserumalbumine (BSA)-kussen om neuronale kernen te beschermen en stroomafwaartse analyse van neuronale nucleaire import te vergemakkelijken. We hebben deze methode onlangs gebruikt om het mechanisme van dipeptide repeat proteïne disruptie in C9orf72-ALS/FTD14 te evalueren en verwachten dat het breed toepasbaar zal zijn op toekomstige studies van passief en actief nucleair transport in primaire neuronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Eerst beschrijft het protocol het genereren van primaire neuronale culturen (stap 1) en de voorbereiding van materialen voor de transporttest (stap 2), gevolgd door de transporttest zelf (stappen 3-4) en beeldacquisitie en -analyse (stap 5). Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (ACUC) van de Johns Hopkins University.

1. Primaire corticale neuronculturen van muizen

  1. Bereid de voorraadoplossingen voor.
    1. Dissectiebuffer: Combineer 50 ml 10x HBSS, 15 ml 1 M glucose (in dH2O), 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 ml natriumpyruvaat en 5 ml 100x penicilline-streptomycine. Breng het volume op 500 ml met dH2O. Steriel filter en bewaar bij 4 °C.
    2. Papaïne: Verdun papaïne tot 30 mg/ml met dissectiebuffer. Bewaren bij 4 °C.
    3. DNase: Verdun DNase I tot 10 mg/ml met dissectiebuffer. Aliquot en bewaren bij -20 °C.
    4. Plating medium: Voeg 5% foetaal runderserum (FBS), 2% B-27, 1% Glutamax en 1% penicilline-streptomycine toe aan het neurobasale medium. Steriel filteren en bewaren bij 4 °C.
    5. Voedingsmedium: Voeg 2% B-27, 1% Glutamax en 1% penicilline-streptomycine toe aan het Neurobasale medium. Bewaren bij 4 °C.
  2. Smeer de borden in.
    1. Smeer de optische platen met 96 putjes met glazen bodem in met poly-D-lysine (20 μg/ml) en laminine (1:100) in steriel dH2O. Plaats de plaat een nacht in een broedmachine.
    2. Spoel de putjes op de dag van de dissectie driemaal met steriel dH2O en vervang ze door Neurobasal medium. Balanceer in een broedmachine gedurende ten minste 30 minuten.
  3. Ontleed en verteer de cortex.
    NOTITIE: Voer de dissectie uit op een schone bank met behulp van geautoclaveerd gereedschap om cultuurbesmetting te voorkomen.
    1. Euthanaseer de E15-16 C57BL/6J zwangere vrouw door cervicale dislocatie. Spuit de buik in met 70% ethanol. Werk snel. Gebruik een schaar en een getande tang om een incisie in de buik te maken, snijd de baarmoeder weg en breng de embryo's vervolgens uit de vruchtzak over in een petrischaaltje. Onthoofd de embryo's met een schaar en verzamel koppen in een petrischaaltje van 10 cm met dissectiebuffer.
    2. Gebruik onder een ontleedmicroscoop een fijne tang om de schedel te verwijderen en de hersenvliezen weg te pellen. Breng de hele hersenen over in een vers petrischaaltje van 10 cm met dissectiebuffer. Scheid de hemisferen en verwijder de subcorticale structuren.
    3. Hak de cortex fijn met een steriel scheermesje en breng ze over in een conische buis met 5 ml dissectiebuffer. Voeg 100 μL papaïne toe (bouillon 30 mg/ml, eindconcentratie 0,6 mg/ml) en 50 μL DNase (voorraad 10 mg/ml, eindconcentratie 0,1 mg/ml). Verteer in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min.
      OPMERKING: Spijsvertering langer dan 10 minuten is schadelijk voor de overleving van cellen.
    4. Verwijder het bovenstaande en was twee keer met 10 ml plating media om de spijsvertering te stoppen. Laat het weefsel tussen elke wasbeurt door de zwaartekracht bezinken.
    5. Trituleer voorzichtig in 2 ml plating media met P1000 pipet tot grote stukken weefsel verdwijnen (ongeveer 20 keer). Voeg nog eens 8 ml platingmedia toe om het volume op ongeveer 10 ml te brengen en leid de celsuspensie door een celzeef van 40 μm.
  4. Plaat en onderhoud neuronen.
    1. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen in voorverwarmd platingmedium. Tel de cellen en verdun tot 500.000 cellen/ml in het platingmedium. Keer voorzichtig om om te mengen en breng over naar een steriel meerkanaals reservoir.
    2. Zuig de neurobasale media uit de putjes op en voeg onmiddellijk 100 μL cellen per putje toe met een meerkanaals pipet (50.000 cellen/putje). Laat de gecoate putjes niet opdrogen.
    3. Vervang na 24 uur dissectie 50% van het medium met het voedingsmedium. Ga door met 50% mediumverandering om de dag tot dag 5-7 om de in vitro assays uit te voeren.

2. Voorbereiding van de onderdelen van de nucleaire transporttest

  1. Transportbuffer (TRB, aangepast van15)
    1. Los voor de bereiding van 5x TRB 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)2, 25 mM NaOAc, 2,5 mM EGTA en 1,25 M sucrose op in dH2O. Breng de pH op 7,3 en bewaar de buffer bij 4 °C.
    2. Bereid op de dag van het transportexperiment 1x TRB-BSA voor. Verdun 5x TRB in dH2O, voeg EDTA-vrije proteaseremmercocktail, 2 mM DTT en 50 mg/ml BSA toe.
  2. Energieregeneratiemix (ERM, aangepast van 9,16)
    1. Om 20x ERM te bereiden, lost u 2 mM ATP lithiumzout, 2 mM GTP lithiumzout, 80 mM creatinefosfaat en 400 E/ml creatinekinase op in 1x TRB.
    2. Vries aliquots voor eenmalig gebruik in bij -20 °C.
  3. Preparaat van het extract van hele cellen (WCE, bron van transportreceptoren en eiwitten uit de Ran-cyclus).
    OPMERKING: Cytoplasmatisch of hele-celextract (WCE) kan worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele doelen. Hier wordt het preparaat van WCE beschreven zoals gebruikt in de initiële neurontransporttesten10.
    1. Kweek HEK293T cellen tot confluentie in vijftien kweekschaaltjes van 150 mm. Maak los met trypsine-EDTA, resuspendeer in media die 10% foetaal runderserum bevatten om trypsine te remmen, en pelletcellen bij 200 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude 1x TRB met vers toegevoegde proteaseremmercocktail.
    2. Sonicaat op ijs, 3 x 10 pulsen, met behulp van een draagbare sonde-sonicator. Klaren door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    3. Meet de eiwitconcentratie (doel 8-10 mg/ml) en vries aliquots voor eenmalig gebruik in vloeibare stikstof in voordat ze bij -80 °C worden bewaard.
  4. Recombinante nucleaire importlading
    OPMERKING: Het transportprotocol in de stappen 3-5 kan worden aangepast voor elke fluorescerende nucleaire transportlading om de actieve of passieve nucleaire transportroute van belang te ondervragen. Hier beschrijft het protocol de expressie en nucleaire import van Rango (Ran-gereguleerde import in β lading), die bestaat uit het importine β-bindende domein van importine α1 geflankeerd door de fluorescerende eiwitten CyPet en YPet14,17. Rango is een veelzijdige sensor die kan worden gebruikt voor FRET en nucleaire importtests, waar het functioneert als een directe import β lading.
    1. Transformeer E. coli BL21(DE3)-cellen met het Rango-plasmide (met een N-terminal 6-His tag) door middel van een hitteschok als volgt. Ontdooi een aliquot van 50 μL BL21(DE3) cellen op ijs. Combineer met 100-200 ng plasmide. Meng door 4-5 keer op de buis te tikken en incubeer vervolgens 30 minuten op ijs voordat u het 40 s op een plaat van 42 °C legt. Breng onmiddellijk terug naar het ijs voor nog eens 2-5 minuten.
    2. Voeg 900 μL SOC-media toe bij kamertemperatuur en incubeer op een shaker bij 37 °C gedurende 1 uur alvorens de cellen op een voorverwarmde agarplaat te verspreiden (1,5% agar, LB-media, 100 μg/ml ampicilline). Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C. Bewaar de plaat maximaal 1 week bij 4 °C of gebruik hem direct voor de eiwitproductie.
    3. Begin de eiwitproductie door drie starterculturen van 25 ml te inoculeren in buisjes van 50 ml met een toenemend aantal kolonies (~3-10) van de BL21(DE3) plaat. Na een nacht incubatie bij 37 °C op een schudder, selecteert u de culturen met een ODvan 600 nm < 1,0 om een cultuur van 1 l in LB-media te inoculeren met behulp van een schotvrije Fernbach-kolf van 2,8 l. Groei bij 37 °C tot het bereiken vanOD 600 nm = 0,1-0,3.
      OPMERKING: Het gebruik van oudere BL21(DE3) LB-agarplaten of een hoge dichtheid van starterculturen (OD600 nm >1.0) kan de opbrengst en zuiverheid van het eiwitpreparaat verminderen.
    4. Koel af tot kamertemperatuur (22-25 °C) door op ijs te leggen. Induceer eiwitexpressie met 0,3 mM IPTG (eindconcentratie) en incubeer op een shaker (80-120 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 12-14 uur.
    5. Verzamel de cellen door centrifugatie (6.000 x g, 15 min, 4 °C) en suspendeer in 30 ml ijskoude 10 mM imidazool in PBS (pH 7,4), aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmercocktail. Lyseer met twee passages door een ijskoude Franse drukcel en klar het lysaat door centrifugatie (16.000 x g, 40 min, 4 °C).
    6. Incubeer het lysaat met agarosehars met nikkelaffiniteit met een hoog debiet (30-60 min, 4 °C), met 1 ml hars per 1 l E. coli-cultuur . Plaats de hars in de chromatografiekolommen, was met 10-20 volumes ijskoud 10 mM imidazool/PBS (pH 7,4). Elute Rango in stappen van 25 mM imidazool/PBS (25-200 mM, pH 7,4), met een 5-voudig bedvolume in elke stap.
    7. Gebruik SDS-PAGE om de batches met de hoogste zuiverheid te selecteren en te bundelen.
    8. Bereid de XB-buffer voor door 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 50 mM sucrose op te lossen in dH2O. Stel de pH in op 7,7.
    9. Dialyseer het eiwit in XB-buffer en concentraat door centrifugatie (7500 x g, 4 °C) op een ultrafiltratieapparaat met een grenswaarde van 30 kD voor het molecuulgewicht.
    10. Meet de eiwitconcentratie volgens de Bradford-methode of een andere voorkeursmethode en vries aliquots voor eenmalig gebruik in vloeibare stikstof in voordat u ze bij -80 °C opbergt.

3. Bepaling van de optimale omstandigheden voor de permeabilisatie van het plasmamembraan

OPMERKING: Vanwege variaties tussen elke batch neuronen, optimaliseert u de permeabilisatiecondities voor elke batch neuronen. Voer dit op dezelfde dag uit voordat u nucleaire transporttests uitvoert.

  1. Bereid in een plastic stagingplaat met 96 putjes een seriële verdunning van Tris-HCl pH 7,5 (om osmotische zwelling te veroorzaken), bij 0 μM, 10 μM, 20 μM en 40 μM in elk van de drie BSA-concentraties: 50 mg/ml, 100 mg/ml en 150 mg/ml (voor moleculaire crowding/mechanische ondersteuning). Verwarm de oplossingen voor op 37 °C.
  2. Spoel de neuronen één keer af in voorverwarmde PBS. Verwijder de PBS en breng Tris/BSA over van de staging plate. Keer terug naar de couveuse gedurende 4 minuten.
  3. Haal uit de broedmachine en plaats de kweekplaat op ijs. Spoel 2 x 5 minuten in 1x TRB-BSA (zoals bereid in stap 2.1.2).
  4. Voeg na de laatste spoeling 70 kD Texas Red-gelabeld dextran (0,6 mg/ml) en Hoechst (1:10.000) toe in 1x TRB-BSA. Laat de plaat 15 minuten op kamertemperatuur staan, beschermd tegen licht.
  5. Afbeelding met behulp van een confocale microscoop om de buffer en de BSA-concentratie te identificeren waarbij het permeabilisatiepercentage van het plasmamembraan het hoogst is, maar het kernmembraan nog steeds de toegang van het 70 kD dextran beperkt (doel ≥ 80%). Gebruik deze voorwaarden voor volgende experimenten.

4. Analyse van de invoer van kernenergie

  1. Bereid de transportreacties voor
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle reacties in de plaat tegelijkertijd kunnen worden gestart, bereidt u het reactiemengsel voor in een plastic stagingplaat met 96 putjes op ijs, voorafgaand aan de permeabilisatie van de neuronen. Voer minimaal twee technische replica's per toestand uit. Voeg bedieningselementen toe aan elke plaat.
    1. Bereid het basisreactiemengsel voor dat bestaat uit 2,5 mg/ml WCE, 1x ERM, fluorescerende lading (200 nM Rango) en Hoechst 33342 (10 mg/ml, 1:10.000) in 1x TRB-BSA, voldoende voor 50 μl per putje. OPTIE: Voeg 70 kD Texas rood gelabeld dextran toe om de integriteit van de nucleaire porie tijdens de transportreactie te kunnen monitoren, rekening houdend met het feit dat confocale microscopie nodig is om de uitsluiting van nucleair dextran in beeld te brengen.
      OPMERKING: De verstrekte WCE-concentratie is een redelijk uitgangspunt voor testoptimalisatie. Voer empirische tests uit van elke batch WCE om de optimale concentratie te bepalen die nodig is voor een efficiënte nucleaire import van de gewenste lading. Vermijd het combineren van gegevens van duplo's die zijn bereid met verschillende batches WCE, aangezien de invoerefficiëntie kan variëren.
    2. Bereid de controles voor, waaronder (1) alleen vracht: Rango, maar geen WCE of ERM en (2) remmer: fluorescerende lading, ERM, WCE en 100 μM importazool (IPZ, een kleine molecuulremmer van belang β18). Gebruik als alternatieve remmer 0,8 mg/ml tarwekiemagglutinine (WGA)19.
      OPMERKING: Breng de remmers in de testmix die WCE bevat gedurende ten minste 30 minuten in evenwicht voordat met het transport wordt begonnen. Voor maximale remming moet de remmer ook de remmer bevatten bij de spoelstappen na permeabilisatie in de overeenkomstige putjes.
  2. Permeabiliseren en spoelen van de neuronen
    1. Permeabiliseer de neuronen volgens het optimale, batchspecifieke protocol dat in stap 3 is geïdentificeerd.
    2. Haal de kweekplaat uit de broedmachine en plaats deze direct op ijs. Spoel 2x gedurende 5 minuten in 1x TRB-BSA. Voeg een remmer toe aan de spoelingen voor de aangewezen putjes.
  3. Voer de transportreactie uit.
    1. Verwijder na de laatste spoeling 1x TRB-BSA. Gebruik snel een meerkanaalspipet (50 μL/putje) om de voorgemengde transportreacties over te brengen op de gepermeabiliseerde cellen.
    2. Plaats de plaat onmiddellijk in een microscoop met een hoog gehalte bij kamertemperatuur om time-lapse-beeldvorming te starten (zie stap 4.4) of plaats de plaat op de bank, beschermd tegen licht, en laat de reactie doorgaan gedurende de gewenste tijdsperiode (bijv. 30-120 min) voorafgaand aan fixatie en beeldvorming.
    3. Fixeer desgewenst 4% paraformaldehyde/PBS gedurende 15 minuten, spoel 2x gedurende 5 minuten in PBS en breng over op 50% glycerol/PBS voor latere beeldvorming. Houd de vaste platen beschermd tegen licht bij 4 °C (stabiel tot 1 week of langer).
  4. Live beeldvorming
    OPMERKING: Pas in dit stadium elke gewenste beeldacquisitie- en analysemethode toe.
    1. Plaats de plaat in een microscoop met een hoog gehalte. Voer een eerste testplaat uit om beeldvormingsparameters te optimaliseren en op te slaan, waaronder vergroting, focus, belichtingstijden (Hoechst en FITC) en intervallen voorafgaand aan het uitvoeren van experimentele monsters. Sla de parameters op om opnieuw te laden met elke volgende plaat.
      OPMERKING: Stel voor kwantitatieve analyse de belichtingstijd voor de fluorescerende importlading (FITC) in op ruim onder de verzadiging bij steady-state of het laatst te gebruiken tijdstip. Stel dit vast met behulp van de testplaat, gericht op de helft van de maximale verzadiging om variaties in intensiteit onder experimentele omstandigheden mogelijk te maken. Verzamel de Hoechst-beelden voor elk frame en tijdpunt om nucleaire identificatie mogelijk te maken tijdens de daaropvolgende geautomatiseerde analyse.
    2. Pas indien nodig de focusoffset aan met Hoechst als focusgolflengte en voer het beeldvormingsprotocol uit. Verzamel de beelden elke 5 minuten gedurende 30 minuten. Pas het interval en de reactietijd indien nodig aan op basis van de beeldvormingssnelheid en kinetiek van de importreactie van belang.

5. Analyse van het beeld

  1. Open in het dialoogvenster Beoordelingsplaat van de microscoop Hoechst- en FITC-afbeeldingen vanuit een representatief frame. Selecteer op het tabblad Analyse uitvoeren de optie Translocatie-verbeterde module en configureer de instellingen. Stel Hoechst in als het compartimentbeeld en FITC als het beeld van de translocatiesonde.
  2. Pas onder compartimenten bij benadering de nucleaire breedte, de intensiteit boven de lokale achtergrond en de minimale/maximale oppervlakte aan. Activeer automatisch afzonderlijke aanraakcompartimenten , aangezien de neuronen de neiging hebben om te clusteren. Bekijk de resultaten door Testrun te selecteren. Pas de instellingen aan om de nauwkeurigheid van de identificatie van neuronale kernen te maximaliseren en tegelijkertijd foutieve opname van niet-neuronale kernen of puin te beperken.
    OPMERKING: Gliabesmetting, indien aanwezig, kan in deze stap doorgaans worden uitgesloten op basis van de nucleaire grootte. Het bepalen van de optimale instellingen voor de identificatie van het compartiment is een afweging tussen nauwkeurigheid en celaantal en moet empirisch worden ingesteld, afhankelijk van de test, het celtype en de kweekdichtheid. Strikte parameters zullen een groot aantal cellen weglaten, maar minder fouten bevatten, terwijl liberale parameters meer inclusief zullen zijn maar meer fouten zullen bevatten. Als er verschillende celpopulaties (d.w.z. ziektemutanten) of behandelingen zijn opgenomen die de nucleaire grootte kunnen beïnvloeden, raden we aan om grootte-/intensiteitsparameters in te stellen die breed genoeg zijn om aan alle omstandigheden te voldoen om te voorkomen dat er meerdere parametersets binnen een experiment nodig zijn.
  3. Om artefacten van de nucleaire rand te voorkomen, definieert u meetgebieden enkele pixels binnen en buiten de rand van het compartiment die zijn gedefinieerd door Hoechst-kleuring. Afhankelijk van de vergroting en samenvoeging, stelt u 2-4 pixels in voor de afstand tot het binnenste gebied en 1-2 pixels voor de afstand tot het buitenste gebied. Pas de breedte van het buitenste gebied aan (1-2 pixels).
  4. Selecteer de gewenste methode voor achtergrondschatting (standaard van Auto Constant wordt aanbevolen). Selecteer in Gegevenslogboek configureren de gewenste uitvoerparameters, waaronder de gemiddelde inwendige intensiteit, de gemiddelde uitwendige intensiteit en de binnenste/buitengemiddelde intensiteit (de verhouding nucleair tot cytoplasmatisch (N/C). Sla de analyseparameters op.
    OPMERKING: Het opnemen van interne positieve en negatieve controles in elk experiment wordt sterk aangemoedigd om ervoor te zorgen dat parameters de gevoeligheid maximaliseren om de biologische gebeurtenis van belang te detecteren.
  5. Gebruik het dialoogvenster Plaathulpprogramma's om een analyse uit te voeren op de gewenste plaat(en) met behulp van de opgeslagen parameters en de metingen te exporteren.
  6. Bekijk en vat de gegevens samen op basis van de behandelingstoestand. OPTIE: Pas filters toe om niet-fysiologische gegevens te verwijderen, zoals de intensiteit van de sonde = 0 en de extremen van de NC-verhouding (d.w.z. <0,1 en >100). Pas alle filters op dezelfde manier toe op alle omstandigheden en experimenten.
  7. Als extra correctie voor baseline fluorescentie, normaliseer de gegevens naar de controleputjes waarin lysaat en ER zijn weggelaten. Om vergelijkingen tussen biologische replicaten (d.w.z. onafhankelijke neuronale kweekpreparaten) te vergemakkelijken, drukt u de uiteindelijke nucleaire importgegevens uit als een percentage van tijd 0.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan (Figuur 1A) is de meest kritieke stap in het protocol en moet worden geverifieerd voordat verder wordt gegaan met de analyse van nucleaire import. Vanwege variaties tussen elke kweekpreparaat, wordt routinematig een eerste titratieplaat uitgevoerd om de optimale, batchspecifieke concentraties van hypotone Tris-HCl-buffer en BSA-buffer te identificeren, zoals beschreven in stap 3. Onder- en overpermeabiliseerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hierboven beschreven protocol biedt een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het selectief permealiseren van het plasmamembraan van primaire corticale neuronen van muizen voor nucleaire importanalyse. Hier wordt een toepassing van de methode voor nucleaire importanalyse van een directe import β lading (Rango) getoond, maar dezelfde benadering kan worden gebruikt om de passieve en actieve import van een breed scala aan fluorescerende ladingen te analyseren. Permeabilisatie maak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NINDS K08NS104273 (naar L.R.H.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M HEPESGibco15630-080
10x HBSSGibco14185-052
32% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714-S
96-well optical glass platesCellVisP96-1.5H-N
ATP lithium saltMillipore Sigma11140965001
B27Gibco17504-044
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002
BL21(DE3) E. coliNEBC2527H
Bovine serum albumin fraction V, heat shock, fatty acid freeSigma-Aldrich3117057001
Chromatography columnsBio-Rad7311550
Creatine kinaseMillipore Sigma10127566001
Creatine phosphateMillipore Sigma10621722001
Dextran, Texas Red, 70,000 MWThermo FisherD1864
DNase ISigma-AldrichDN25
E15-16 zwangere C57BL/6J vrouwtjesJackson Laboratory000664
ExcelMicrosoftN/A
Fetaal bovien serumHycloneSH30070.03
GlutamaxGibco35050-061
GlycerolThermo Fisher15514011
GTP lithium saltMillipore Sigma11140957001
HALT protease inhibitor (100x)Thermo Fisher78439
HEK293T cellenATCCCRL-3216
HIS-Select HF Nickel affinity gelSigma-AldrichHO537
Hoechst 33342Thermo FisherH1399
ImageExpress Micro Confocal High-content Imaging SystemMolecular DevicesN/AGebruikt voor time-lapse beeldvorming
ImidazoleMilliporeI3386
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
IPTGCorning46-102-RF
LaminineSigma-AldrichL2020
LB bouillonGrainger31FZ62
LSM800 confocal microscoopZeissN/AGebruikt voor dextran beeldvorming
MetaXpress High Content Image Analysis SoftwareMolecular DevicesN/A
Neurobasal mediumGibco21103
PapaïneWorthingtonLS003126
Penicilline-streptomycineGibco15140-122
Poly-D-LysineSigma-AldrichP6407
Protease inhibitor cocktailMillipore Sigma11873580001
Rango Plasmid (pRSET Rango2/a1 + linkers)N/AN/ApK44, met N-terminaal 6-His tag
SOC (super optimale bouillon met catabolite repressie) mediaQuality Biological340-031-671
NatriumpyruvaatGibco11360-070
Spin-X UF concentrators (30K MWCO)CorningCLS431484
Trypsine-EDTA (0,05%)Gibco25300054

Referenties

  1. Hutten, S., Dormann, D. Nucleocytoplasmic transport defects in neurodegeneration - Cause or consequence. Seminars in Cell & Developmental Biology. 5, 151-162 (2019).
  2. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  3. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-96 (2017).
  4. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-927 (2018).
  5. Coyne, A. N., et al. G4C2 repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (6), 1124-1140 (2020).
  6. Timney, B. L., et al. Simple rules for passive diffusion through the nuclear pore complex. The Journal of Cell Biology. 215 (1), 57-76 (2016).
  7. Paci, G., Caria, J., Lemke, E. A. Cargo transport through the nuclear pore complex at a glance. Journal of Cell Science. 134 (2), 247874(2021).
  8. Ding, B., Akter, M., Zhang, C. -L. Differential Influence of Sample Sex and Neuronal Maturation on mRNA and Protein Transport in Induced Human Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 46(2020).
  9. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 807-816 (1990).
  10. Brownawell, A. M., Holaska, J. M., Macara, I. G., Paschal, B. M. The use of permeabilized cell systems to study nuclear transport. Methods in Molecular Biology. 189, Clifton, N. J. 209-229 (2002).
  11. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  12. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  13. Colbeau, A., Nachbaur, J., Vignais, P. M. Enzymic characterization and lipid composition of rat liver subcellular membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 462-492 (1971).
  14. Hayes, L. R., Duan, L., Bowen, K., Kalab, P., Rothstein, J. D. C9orf72 arginine-rich dipeptide repeat proteins disrupt karyopherin-mediated nuclear import. eLife. 9, 51685(2020).
  15. Grote, P., Ferrando-May, E. In vitro assay for the quantitation of apoptosis-induced alterations of nuclear envelope permeability. Nature Protocols. 1 (6), 3034-3040 (2006).
  16. Lowe, A. R., et al. Importin-β modulates the permeability of the nuclear pore complex in a Ran-dependent manner. eLife. 4, 04052(2015).
  17. Kalab, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  18. Soderholm, J. F., et al. Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β. ACS Chemical Biology. 6 (7), 700-708 (2011).
  19. Newmeyer, D. D., Forbes, D. J. Nuclear import can be separated into distinct steps in vitro: nuclear pore binding and translocation. Cell. 52 (5), 641-653 (1988).
  20. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351 (6269), 173-176 (2016).
  21. Khosravi, B., et al. Cytoplasmic poly-GA aggregates impair nuclear import of TDP-43 in C9orf72 ALS/FTLD. Human Molecular Genetics. 26 (4), 790-800 (2016).
  22. Chou, C. -C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

gepermeabiliseerde neuronennucleaire importnucleocytoplasmatisch transportkernporiecomplexhypotone lyserunderserumalbumineimport van fluorescente vrachthigh content microscopie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.