Methodenartikel

Hyperactief biggeBac Transposase-gemedieerde kiembaantransformatie in de herfst Legerworm, Spodoptera frugiperda

DOI:

10.3791/62714

⸱

23 september 2021

 , 
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabiele insertie van genetische lading in insectengenomen met behulp van transponeerbare elementen is een krachtig hulpmiddel voor functionele genomische studies en het ontwikkelen van genetische plaagbestrijdingsstrategieën. Het meest gebruikte transponeerbare element in insectentransformatie is piggyBacen piggyBac-gebaseerdekiembaantransformatie is met succes uitgevoerd in modelinsecten. Het is echter nog steeds een uitdaging om deze technologie toe te passen in niet-modelinsecten die landbouwongedierte bevatten. Dit artikel rapporteert over kiembaantransformatie van een wereldwijde landbouwplaag, de herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, met behulp van het hyperactieve varkenBac transposase (hyPBase).

In dit werk werd het hyPBase-mRNA geproduceerd en gebruikt in plaats van helpplasmide in embryonale micro-injecties. Deze verandering leidde tot de succesvolle generatie van transgene FAW. Verder worden ook de methoden voor het screenen van transgene dieren, pcr-gebaseerde snelle detectie van transgene insertie en thermische asymmetrische interlaced PCR (TAIL-PCR) -gebaseerde bepaling van de integratieplaats beschreven. Dit artikel presenteert dus een protocol om transgene FAW te produceren, wat piggyBac-gebaseerdetransgenese in FAW en andere lepidoptera-insecten zal vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, is inheems in tropische en subtropische gebieden van Amerika. Momenteel is dit een verwoestende insectenherbivoor in meer dan 100 landen wereldwijd1. FAW-larven voeden zich met meer dan 350 waardplanten, waaronder enkele belangrijke basisvoedselgewassen2. Het sterke migratievermogen van FAW-volwassenen draagt bij aan de recente snelle verspreiding van Amerika naar andere plaatsen1,2. Als gevolg hiervan bedreigt dit insect nu de voedselzekerheid internationaal. Het toepassen van nieuwe technologieën kan geavanceerde studies in FAW vergemakkelijken en nieuwe strategieën bieden om deze plaag te beheersen.

Insectenkiemlijntransformatie is gebruikt om de genfunctie te bestuderen en transgene insecten te genereren voor gebruik bij genetische controle3,4. Van de verschillende methoden die worden gebruikt om genetische transformatie bij insecten te bereiken, is de op piggyBac-elementen gebaseerde methode de meest gebruikte methode5. Vanwege de lage transpositiesnelheid is het echter nog steeds een uitdaging om transgenese uit te voeren bij niet-modelinsecten. Onlangs is een hyperactieve versie van piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld6,7. Kiembaantransformatie werd onlangs bereikt in FAW8, het eerste rapport dat de hyPBase gebruikte bij lepidoptera-insecten. In dit rapport wordt gedetailleerde informatie beschreven over het gebruik van hyPBase mRNA bij het genereren van transgene FAW. De hier beschreven methode kan worden toegepast om de transformatie van andere lepidoptera-insecten te bereiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In vitro synthese van hyPBase mRNA

OPMERKING: De volledige coderingssequentie van de hyPBase-sequentie werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pTD1-Cas9-vector (zie de tabel met materialen) om de pTD1-hyPBase-constructie te produceren, die een hyPBase-expressingcassette bevat, T7-promotor: polyhedrin-5 'UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). De volledige volgorde van de pTD1-hyPBase-constructie wordt verstrekt in het aanvullende materiaal.

  1. Voorbereiding van de sjabloon voor in vitro synthese
    1. Voer een PCR-reactie uit om de hyPBase-expressingcassette te versterken met behulp van een voorwaartse primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', en een omgekeerde primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase en pTD1-hyPBase plasmide als sjabloon.
      OPMERKING: De PCR-reactie (eindvolume van 50 μL) bevat 5,0 μL 10x Reactiebuffer, 4,0 μL 10 mM deoxynucleosidetrifosfaat (dNTP), 1,0 μL plasmide (50 μg/μL), 1,0 μL high-fidelity polymerase, 1,0 μL elk van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 33 μL nucleasevrij water. De instellingen waren als volgt: een initiële incubatie van 95 °C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 15 s en 68 °C gedurende 2 min.
    2. Controleer het PCR-product op een 1% agarosegel op 120 V in verse Tris-acetaat-ethyleendiamine tetra-azijnzuur (TAE) buffer gedurende 30 minuten en zuiver het product met de gelextractiekit.
      OPMERKING: Gebruik de PCR-productzuiveringskit niet. Zelfs een sporenhoeveelheid van het pTD1-hyPBase plasmide vermindert de efficiëntie van in vitro synthese aanzienlijk.
  2. In vitro synthese van hyPBase mRNA met behulp van een commerciële kit
    1. Ontdooi de bevroren reagentia volledig, houd het enzym en de 2x NTP/CAP-oplossing op ijs en laat de ontdooide 10x Reactiebuffer bij kamertemperatuur staan.
    2. Monteer de reactie bij kamertemperatuur door toevoeging van de volgende componenten: 2x NTP/CAP-oplossing: 10 μL; 10x Reactie buffer: 2 μL; Sjabloon DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymmix: 2 μL; Nucleasevrij water tot 20 μL.
    3. Meng de reagentia grondig door het mengsel voorzichtig op en neer te pipetteren en gedurende 2-4 uur bij 37 °C te incuberen.
  3. Terugwinning van gesynthetiseerd mRNA door lithiumchlorideprecipitatie
    1. Voeg 30 μL LiCl-precipitatieoplossing toe, meng grondig door op de buis te vegen en houd vervolgens gedurende ≥ 30 minuten op -20 °C.
    2. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 15 minuten met de maximale snelheid en verwijder voorzichtig het supernatant.
    3. Was de pellet eenmaal met 1 ml 70% ethanol, centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant voorzichtig.
    4. Droog de pellet gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en resuspend de pellet vervolgens met 20-40 μL nucleasevrij water.
    5. Verdun 1 μL mRNA-oplossing met 9 μL nucleasevrij water. Neem 2 μL om de mRNA-concentratie te bepalen en gebruik 8 μL om de mRNA-kwaliteit te controleren op een 1% agarosegel bij 100 V in verse TAE-buffer gedurende 40 minuten.
    6. Vul de mRNA-oplossing toe en bewaar bevroren bij -70 °C gedurende maximaal één jaar.
      OPMERKING: Droog de mRNA-pellet niet volledig; het kan moeilijker zijn om het op te lossen in water.

2. Micro-injectie

  1. Eier verzamelen
    1. Plaats 12 mannelijke poppen en 12 vrouwelijke poppen in een doos van 15 cm x 15 cm x 10 cm. Bedek de doos met een papieren handdoek. Plaats een 10% sucrose-oplossing in de doos voor het voeden van volwassenen.
    2. Stel op dag 2 na eclosie de volwassenen 's nachts bloot aan intens licht.
    3. Breng op dag 3 na eclosie de volwassenen over van stap 2.1.2 naar een donkere plaats. Verzamel de embryo's binnen 2 uur na ovipositie.
    4. Voeg druppels water toe aan het stuk van een papieren handdoek met verse eieren in een petrischaaltje op ijs. Breng de eieren voorzichtig over op een glazen schuif met een fijne borstel en lijn ze een voor een uit op een glazen dia. Houd de glazen glijden met de uitgelijnde eieren op ijs voordat u micro-injectie.
  2. Micro-injectie setup
    1. Injecteer een mengsel van een transgeen versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP)-tot expressie brengend plasmide (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) en steriel gedestilleerd water in de eieren, met behulp van de compensatiedruk van de geautomatiseerde micro-injector (zie de Tabel met materialen).
    2. Bewaar de geïnjecteerde eieren op 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relatieve vochtigheid totdat ze uitkomen.
    3. Voed de uitgekomen larven op een kunstmatig dieet en breng elke larve over naar een klein kopje in het vroege3e instar-stadium (~ 6 mm lang en de lichaamskleur wordt zwart).

3. Fluorescentiescreening en genetische kruising

  1. Verzamel de poppen en plaats ~150 vrouwelijke poppen en ~150 mannelijke poppen in een kooi van 35 cm x 35 cm x 35 cm. Hang verschillende stukjes keukenpapier (~30 cm x 15 cm) in de kooi om de eieren te verzamelen.
  2. Verzamel de papieren handdoekjes met eieren dagelijks en bewaar de eieren op 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relatieve vochtigheid tot het uitkomen.
  3. Houd de pasgeboren larven gedurende 5 minuten op 4 °C om ze te immobiliseren en breng ze vervolgens over op een ijskoude plaat.
  4. Screen de geïmmobiliseerde pasgeboren larven onder een fluorescentie stereomicroscoop. Selecteer de EGFP-positieve pasgeborenen, breng ze in ~ 2 weken naar het popstadium bij 27 ± 1 ° C en scheid ze naar geslacht volgens de fenotypeverschillen in de ventrale buiksegmenten.
    OPMERKING: De vrouwelijke pop heeft een spleetachtige genitale opening op het achtste abdominale segment en de cefalische randen van het negende en tiende segment buigen naar de genitale opening. De genitale opening van de mannelijke pop heeft een lichte verhoging op het negende buiksegment.
  5. Plaats de EGFP-positieve poppen en de wildtype poppen van het andere geslacht in een mannelijke: vrouwelijke verhouding van 1:1 in een kooi. Sib-cross de EGFP-uitdrukkende volwassenen om de volgende generaties te produceren.

4. PCR-detectie van transgene insertie

  1. Extraheer genomisch DNA uit de wild-type en EGFP-positieve individuele larven met behulp van een commerciële genomische DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Voer een PCR-reactie uit met behulp van het genomische DNA als sjabloon; een voorwaartse primer, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' in de ie1 promotor regio; en een omgekeerde primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' in het EGFP-gebied van de transformatievector.
  3. Stel elke PCR-reactie (eindvolume van 40 μL) in op 20 μL van het polymerasemengsel, 1,0 μL genomisch DNA (40 μg/μL), 1,0 μL elk van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 17 μL nucleasevrij water. Gebruik de volgende instellingen: een initiële incubatie van 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van 95 °C voor 20 s, 56 °C voor 20 s en 68 °C voor 40 s.
  4. Controleer de PCR producten op een 1% agarose gel op 120 V gedurende 30 min.

5. Bepaling van de transgene insertieplaats

  1. Voer zeer efficiënte TAIL-PCR uit met behulp van genomisch DNA als sjabloon om de integratieplaats van transgene insertie in de EGFP-positieve insecten te bepalen.
    1. Voer de PCR-reacties uit volgens de stappen die elders worden beschreven9.
      1. Gebruik drie primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', en P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgcgct-3', die specifiek zijn voor de piggyBac-vector, in respectievelijk de 3 rondes van pcr-reactie.
  2. Volg de uiteindelijke PCR-producten om de integratiesite te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een construct voor de expressie van hyPBase-bevattende T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signaal werd gegenereerd (Figuur 1A) en versterkt als een ~2,2 kb PCR fragment om hyPBase mRNA in vitro te synthetiseren (Figuur 1B). Vervolgens werd het hyPBase-mRNA geproduceerd en onderworpen aan agarose-gel-elektroforese. Het mRNA van de verwachte grootte (~1,1 kb band) werd gedetecteerd op een 1% agarose gel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lage omzettingssnelheid en de moeilijkheid om transgene componenten in verse embryo's af te leveren, beperken het succes van kiembaantransformatie bij veel niet-modelinsecten, vooral die van orde, Lepidoptera. Om de kiembaantransformatiesnelheid te verhogen, werd een hyperactieve versie van het meest gebruikte piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld7,10. Tot op heden wordt succesvolle kiembaantransformatie in lepidopteran insecten voornamelijk gemel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gerapporteerde onderzoek wordt ondersteund door de National Science Foundation I / UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies, onder Grant No IIP-1821936 en door industriële partners, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 en het National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 en 2353057000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5" Dental Cotton RollsPlastCare USA8542025591REARING
1 oz Souffle Cup LidsDARTPL1N
1 oz Souffle CupsDARTP100NREARING
48 oz Plastic Deli ContainersGenpackAD48REARING
Add-on Filter Set (Green)NightSea LLCSFA-BLFS-GRSCREENING
Borosilicate GlassSutter InstrumentsBF100-50-10INJECTION
Borosilicate GlassSUTTER INSTRUMENTBF-100-50-10
Dissecting ScopeNikonSMZ745TSCREENING
Featherweight ForcepsBioQuip4750REARING
Gutter GuardThermWell ProductsVX620REARING
Inverted MicroscopeOlympusIX71INJECTION
MicroinjectorNarishigeIM-300INJECTION
Micropipette PullerSutter InstrumentsP-1000INJECTION
Microscope SlidesVWR16004-22INJECTION
NightSea Full SystemNightSea LLCSFA-RB-DIMSCREENING
Nitrogen GasAWG/Scott-GrossNI 225INJECTION
Paper TowelsBounty 43217-45074REARING
Spodoptera frugiperda Artificial DietSouthland Products, IncN/A [Request Species/Quantity]REARING
Spodoptera frugiperda EggsBenzon Research, IncN/A [Request Species/Quantity]REARING
Taq MasterMixpolymerase mixture
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).
  12. Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transgene insectenembryo microinjectieEGFP expressiefluorescentiescreeningfunctionele genomicsgenetische plaagbestrijding

Gerelateerde artikelen