Pure Shift nucleaire magnetische resonantie: een nieuw hulpmiddel voor plantmetabolomics

Samenvatting

Dit artikel presenteert het gebruik van PSYCHE en SAPPHIRE-PSYCHE bij de metabole profilering van planten en bevat gedetailleerde procedures voor monstervoorbereiding en optimale Pure Shift NMR-spectraregistratie. Er worden voorbeelden besproken waarmee de resolutiewinst die wordt bereikt door homonucleaire ontkoppeling een uitgebreider begrip van het systeem mogelijk maakt.

Samenvatting

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een van de krachtigste hulpmiddelen die worden gebruikt in metabolomics. Het staat als een zeer nauwkeurige en reproduceerbare methode die niet alleen kwantitatieve gegevens levert, maar ook structurele identificatie mogelijk maakt van de metabolieten die aanwezig zijn in complexe mengsels.

Metabole profilering door ¹H NMR is nuttig gebleken bij de studie van verschillende soorten plantscenario's, waaronder de evaluatie van gewasomstandigheden, oogst- en post-oogstbehandelingen, metabole fenotypering, metabole routes, genregulatie, identificatie van biomarkers, chemotaxonomie, kwaliteitscontrole, oorsprongsbenaming, enz. Signaaloverlapping van het grote aantal resonanties met uitgebreide J-koppelingsveelvouden bemoeilijkt echter de spectraanalyse en de interpretatie ervan, en vormt een beperking voor klassieke ¹H NMR-profilering.

In het afgelopen decennium zijn nieuwe NMR-breedband homonucleaire ontkoppelingstechnieken ontwikkeld waardoor multiplet-signalen samensmelten tot enkele resonantielijnen - gewoonlijk Pure Shift-methoden genoemd - om het spectraresolutieprobleem te overwinnen dat inherent is aan ^{klassieke 1-uurs}NMR-spectra.

Hier wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd van de bereiding van plantenextracten en de procedure om optimale Pure Shift PSYCHE- en SAPPHIRE-PSYCHE-spectra vast te leggen in drie verschillende plantmatrices - vanille-plantenbladeren , aardappelknollen (S. tuberosum) en Kaapse kruisbessen (P. peruviana). Het effect van de toename in resolutie in metabole identificatie, correlatieanalyse en multivariate analyses, vergeleken met klassieke spectra, wordt besproken.

Inleiding

De volledige set metabolieten waaruit een organisme bestaat - substraten, tussenproducten en eindproducten van biologische processen - werd in 1998 bedacht met de term metaboloom. Het is algemeen bekend dat het metaboloom nauw verwant is aan het fenotype, en het is van bijzonder belang voor planten omdat het de directe interactie tussen het genotype en de omgeving weerspiegelt ^1,2. Daarom is de karakterisering van het metabolomische profiel van het grootste belang geworden in planten. Door de identificatie en kwantificering van biomarkers (sleutelmetabolieten) en metabole patronen is het onderscheid tussen soorten, cultivars, ontwikkelingsstadia, pathogene ziekten of omgevingsomstandigheden (dagelijkse en seizoensgebonden veranderingen, bodem, waterstress, mechanische stress, oogst- en naoogstbehandelingen) mogelijk geweest ^3,4,5.

Massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie zijn de meest gebruikte analytische platforms voor dit doel. In tegenstelling tot MS-methodologieën staat NMR als een zeer reproduceerbare, niet-bevooroordeelde, kwantitatieve, nauwkeurige en niet-destructieve techniek die minimale monstervoorbereiding vereist, waardoor het geschikt is voor metabolomics-studies. In vergelijking met MS-methoden is de inherente lage gevoeligheid echter een beperking. In de afgelopen jaren en door het gebruik van hoogveldmagneten, cryogene sondes, microspoelapparaten en Dynamic Nuclear Polarization (DNP)-methoden is de gevoeligheid van NMR sterk verbeterd. In het geval van de laatste benadering bijvoorbeeld lag de gevoeligheidswinst op het niveau van twee tot drie ordes van grootte ^6,7. Tot op heden is bijna 20% van de gepubliceerde metabolomics-studies gebaseerd op NMR en het aantal stijgt met⁷.

Hoewel Proton NMR het meest populaire en gevoelige experiment is voor NMR-metabolomics-vingerafdrukken, heeft het enkele nadelen. Ten eerste worden alle ¹H NMR-signalen die in het monster worden gedetecteerd, verdeeld in een klein venster dat overeenkomt met het chemische verschuivingsvenster van protonen, wat resulteert in overvolle spectra. Ten tweede splitst de homonucleaire scalaire koppeling de signalen in meerdere componenten (signaalmultipliciteit), waardoor het protonsignaal over een breder frequentiebereik wordt verspreid, waardoor de spectralezing verder wordt bemoeilijkt door de drukte en signaaloverlapping te vergroten. Bovendien wordt NMR-metabolomics gebruikt bij de analyse van mengsels die gewoonlijk 50 tot 300 moleculen bevatten met een NMR-waarneembare concentratie, waardoor complexe spectra worden gegenereerd die bestaan uit 200 tot 2000 pieken.

Homonucleaire ontkoppeling proton NMR, ook bekend als Pure Shift, is een methode die de ineenstorting van een multipletsignaal tot een enkele piek induceert. Het is een uitstekend hulpmiddel voor het verhogen van de signaalresolutie in drukke spectra ^8,9,10 en is daarom een handig hulpmiddel voor plantenmetabolomics¹¹.

In het afgelopen decennium zijn er nieuwe Pure Shift-pulssequenties ontstaan, die zowel de gevoeligheid als de ontkoppelingsprestaties verhogen. Hun toepassingsgebied is ook uitgebreid, van moleculaire structuuropheldering^12,13 tot fluxomics¹⁴, mengseltoewijzing 15,16,17, translationele diffusiemetingen ¹⁸, enantiomere discriminatie¹⁹, eenheidsverdeling in copolymeren²⁰, onder andere.

Historisch gezien hebben Broadband Pure Shift-experimenten last van een lage gevoeligheid en gecompliceerde verwerkingsmethoden, waardoor hun reikwijdte bij de beoordeling van biologische extracten wordt beperkt⁸. In 2014 publiceerden Foroozandeh et al. een nieuw Pure Shift-experiment, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), gebaseerd op anti-z-COSY pulssequentie die een uitstekende homonucleaire ontkoppeling en verbeterde gevoeligheidswaarden^opleverde. Omdat PSYCHE echter een 2D-interferogramexperiment is waarbij brokken tijddomeingegevens worden verkregen, lijdt het aan periodieke zijbandartefacten die het gevolg zijn van J-koppelingsmodulatievervormingen aan de randen van het stuk. In complexe mengsels leveren deze artefacten signalen op die groter zijn dan die geassocieerd met metabolieten die in zeer lage concentraties aanwezig zijn, wat de analyse belemmert¹¹. Er zijn twee methoden om deze artefacten te verwijderen - TSE-PHYCHE²² en een meer recente wijziging van het PSYCHE-experiment genaamd SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)²³.

In 2019 toonden we voor het eerst^{aan 11} dat de SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift-methode, die artefacten verwijdert met bijna geen gevoeligheidsstraf²³, kan worden gebruikt voor de analyse van complexe biologische mengsels, zoals extracten van de vruchten van Physalis peruviana, algemeen bekend als Kaapse kruisbessen¹¹. We hebben aangetoond dat deze methoden de prestaties van metabolomics-data-analyses zoals metabole toewijzing, correlatieanalyse en multivariate coëfficiëntenanalyse verhogen¹¹. Sindsdien zijn verschillende Pure Shift metabolomics-studies op verschillende biologische matrices, zoals zachte koralen²⁴, hypericumplanten²⁵, honing^26,27, thee²⁷, pepermuntolie²⁶ en walnoten²⁸ aangepakt, wat het belang ervan als een nieuw hulpmiddel voor metabolomics-analyse aantoont. Paradoxaal genoeg maakte de overgrote meerderheid van deze onderzoeken gebruik van de standaard en eenvoudig te implementeren PSYCHE-pulssequentie, beschikbaar in elke spectrometerbibliotheek, in plaats van de SAPPHIRE-PSYCHE-pulssequentie, waarvan is aangetoond dat deze beter presteert. Het vereist echter een beter begrip van de pulsvolgorde voor een goede instelling.

Dit artikel is bedoeld om nieuwe gebruikers te helpen bij het toepassen van Pure Shift-methoden bij de studie van planten, in het bijzonder bladeren van Vanilla sp (V. planifolia en V. pompona)²⁹, aardappelknollen (S. tuberosum)³⁰ en Kaapse kruisbessen (P. peruviana)³¹. Monstervoorbereiding, NMR-experimentele opstelling, data-acquisitie en data-analyse worden in detail beschreven. Bovendien bevat het protocol belangrijke aanwijzingen om onderzoekers, nieuw in het veld, te helpen bij het goed opzetten van PSYCHE- en SAPPHIRE-PSYCHE-experimenten bij het metabolomisch profileren van planten.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

1. Kaapse kruisbessen
   1. Doe 100-200 g vers fruit in een blendervaas. Houd gedurende 30 minuten op 4 °C en homogeniseer vervolgens in een laboratoriumblender.
   2. Breng het sap onmiddellijk over in plastic buizen van 50 ml, vries ze in vloeibare stikstof in en lyofiliseer ze gedurende 4 tot 5 dagen tot ze droog zijn.
   3. Maal het gevriesdroogde materiaal tot een fijn poeder met behulp van een elektrische molen.
      OPMERKING: Het hanteren van het droge materiaal moet snel gebeuren omdat het poeder zeer hygroscopisch is.
   4. Weeg 1 g van het gemalen materiaal af en voeg 10 ml ultrapuur water toe. Draaikolk gedurende 1 min.
   5. Sonicaat gedurende 20 minuten bij 10 °C en centrifugeer vervolgens bij 23.000 × g gedurende 20 minuten bij 10 °C.
   6. Win het supernatans terug en filtreer het door een 13 mm polytetrafluorethyleen (PTFE) spuitfilter van 0,45 μm.
   7. Lyofiliseer 1 ml van het gefilterde extract tot het droog is en suspendeer vervolgens de verkregen vaste stof opnieuw in 0,9 ml 200 mM natriumoxalaatbuffer pH 4. Draaikolk.
   8. Lyofiliseer het resulterende monster tot het droog is en los het op in 0,9 ml deuteriumoxide met 5 mM 3-(trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3-d_4-zuur natriumzout (TMSP-d₄).
   9. Vul de NMR-buis met 0,6 ml van het monster met behulp van een micropipet.
2. Vanilleblaadjes
   1. Verzamel de bladeren, maak ze schoon met vochtig tissuepapier en vries ze in hun geheel in vloeibare stikstof in.
   2. Breek de bladeren in kleine stukjes en vries ze 4 dagen tot ze droog zijn.
   3. Maal de droge stof met behulp van een elektrische molen tot een fijn poeder.
   4. Weeg 50 mg gemalen materiaal af en voeg 0,75 ml fosfaatbuffer pH 6,0 toe aan deuteriumoxide dat 0,1% TMSP (m/g) en 0,75 ml methanol-d4 bevat. Draaikolk gedurende 1 min.
   5. Sonificeer gedurende 20 minuten bij 25 °C.
   6. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 10 minuten bij 25 °C.
   7. Herstel het supernatans (~1,3-1,4 ml) en filtreer het door een 13 mm PTFE 0,45 μm spuitfilter.
   8. Vul de NMR-buis met 0,6 ml van het gefilterde monster met behulp van een micropipet.
3. Aardappel knollen
   1. Schil en snijd 4 tot 8 knollen in plakjes. Doe onmiddellijk ongeveer 125 g materiaal in stazakken en vries ze in vloeibare stikstof in.
      NOTITIE: Om oxidatie tijdens het hanteren te voorkomen, moet u de aardappel vochtig houden.
   2. Vries gedurende 4 tot 6 dagen tot het volledig droog is.
   3. Maal de droge stof met behulp van een elektrische molen tot een fijn poeder.
   4. Weeg 160 mg gemalen knol af en voeg 1,6 ml gedeïoniseerd water toe. Draaikolk gedurende 1 min.
   5. Sonicaat gedurende 45 minuten bij 10 °C.
   6. Centrifugeer bij 23.000 x g gedurende 20 minuten bij 10 °C.
   7. Recupereer het supernatans (~1,5 -1,6 ml) en verdamp het tot het droog is in een gekoelde centrifugale vacuümconcentrator gedurende 16 uur, bij 10 °C.
   8. Voeg aan de verkregen vaste stof (20-25 mg) 0,9 ml 100 mM natriumoxalaatbuffer pH 4, vortex toe en verdamp gedurende 16 uur bij 10 °C.
   9. Los de verkregen vaste stof op in 0,9 ml deuteriumoxide met 3 mM TMSP.
   10. Centrifugeer bij 23.000 x g gedurende 5 minuten bij 10 °C en filtreer het supernatans rechtstreeks in de NMR-buis via een 13 mm PTFE 0,45 μm spuitfilter.
       OPMERKING: In dit geval werd directe filtratie in de NMR-buis uitgevoerd om stappen in de voorbereiding van meer dan 1000 monsters te verminderen.

2. NMR-gegevensverzameling en -verwerking

1. Eerste installatie van NMR
   1. Breng de monsters over naar de NMR-spectrometer.
   2. Stem de sondekop af en stem deze af.
   3. Vergrendel en vul het monster op.
   4. Kalibreer de harde pols van 90°. Kalibreer de 90°-puls met behulp van een van de standaardprocedures.
   5. Voer een standaard 1D proton NMR-spectrum uit.
2. PSYCHE-experiment
   1. Selecteer de reset_psyche_1d pulssequentie uit de Bruker Topspin-bibliotheek (Figuur S1). Gebruik de volgende standaardparameters: 5 kHz spectrale breedte (SW2), ten minste 1 of 2 seconden ontspanningsherstelvertraging (D1), 16 dummyscans (DS), 64 of 128 complexe datapunten per blok (L31) en 64 of 128 scans (NS) (Figuur S1).
      OPMERKING: L31 is het aantal complexe digitale punten dat in elk Pure Shift-blok wordt verkregen, het beste in te stellen op een macht van 2. ²¹ okt.
   2. Stel de gewenste excitatie van de CHIRP-pulsomdraaihoek in (CNST61) en 10 kHz voor de CHIRP-pulsbandbreedte (CNST60) (Figuur S2).
      OPMERKING: Het PSYCHE-experiment is gebaseerd op een anti-z-COSY schema; daarom moet de omkeerhoek van de CHIRP-puls klein zijn om herkoppelingsartefacten te voorkomen (Figuur 1). De absolute intensiteit neemt toe met de excitatie-fliphoek. De periodieke artefacten worden ook verbeterd, verspreiden zich in het spectrum en verhogen de "ruis" (Figuur 1). De "ruis" wordt een combinatie van standaardruis en chuncking-artefacten. Een goed compromis tussen gevoeligheid en artefacten met lage herkoppeling is om CNST61 = 20° in te stellen. ^19,22 Stuks
   3. Stel de harde pulslengte (P1) in op de eerder gekalibreerde waarde en de pulslengte van de PSYCHE-vorm op 30 ms (P49) (Figuur S2).
      OPMERKING: Het is erg belangrijk om de waarde van de harde puls te kalibreren, aangezien de vormpulskrachten automatisch op basis van deze waarde worden berekend.
   4. Kies de Crp_psyche.20 (SPNAM 37) vormpuls voor het PSYCHE-element (Figuur S2).
   5. Stel de sterkte in van de pulsveldgradiënt die wordt toegepast tijdens het PSYCHE-element (GPZ0). Kies RECT.1 voor de gradiëntvormpuls (GPNAM 0) (Figuur S2).
      OPMERKING: Tijdens het PSYCHE-element wordt een zwakke magnetische veldgradiënt toegepast, normaal gesproken tussen 1% en 4% van de maximale sterkte van de gradiënt, afhankelijk van de sonde.
   6. Stel het aantal blokken in dat moet worden verkregen om de Pure Shift FID (TD1) te reconstrueren (Figuur S3).
      OPMERKING: PSYCHE is verkregen als een pseudo-2D-experiment waarbij TD1 het aantal Pure Shift-interferogramblokken is. De spectrumresolutie is afhankelijk van de grootte van het spectrale venster (SW1) en het totale aantal verkregen punten, dat TD1*2*L31 is. Doorgaans bieden 16 of 32 blokken met 64 of 128 complexe punten per blok voldoende digitale resolutie. Omdat PSYCHE op een interferogram-manier wordt opgenomen, verhoogt een hoger aantal blokken de digitale resolutie, maar ook de totale acquisitietijd¹⁹. Homonucleaire J-koppelingen evolueren tijdens elk blok, wat resulteert in een oscillerend J-modulatiepatroon^21,23. Na de Fouriertransformatie genereert dit periodieke zijbandartefacten die afhankelijk zijn van de lengte van het blok (Figuur 2). Om artefacten te verminderen, moet de duur van het blok kort zijn, meestal minder dan 16 ms (blokduur = 2*in0: Figuur S1). Als de blokduur hoog is, verlaag dan L31.
   7. Verwerk de gegevens met het Proc_reset AU-programma van Bruker en de Fouriertransformatie.
      OPMERKING: We raden aan om het spectrum te transformeren met behulp van nulvulling en een sinusklok-apodisatie (Figuur S4).
3. Saffier-PSYCHE experiment
   1. Selecteer de pulssequentie SAPPHIRE-PSYCHE en stel de parameters van de pulssequentie in. De standaardparameters zijn de volgende: 5 kHz spectrale breedte (SW3), ten minste 1 of 2 seconden ontspanningsvertraging (D1), 16 dummyscans (DS), 8 of 16 scans per stap (NS) en D2 tot 14 ms (Figuur S5).
      OPMERKING: Deze sequentie behoort niet tot het repertoire van Bruker, maar de sequentie en de verwerkingsprogramma's kunnen worden verkregen van de website van de Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)²³. De D2-vertraging zorgt ervoor dat de T2-ontspanning constant blijft bij elke J-modulatiestap. D2 moet groter zijn dan 1/4 * SW1 + p16 + 2 * d16. ²³ okt.
   2. Stel de gewenste CHIRP-pulsomdraaihoekexcitatie in (CNST20) en 10 kHz voor de CHIRP-pulsbandbreedte (CNST21) (Figuur S6).
      OPMERKING: Net als in het reguliere PSYCHE-experiment moet de omdraaihoek van de CHIRP-puls kort zijn om herkoppelingsartefacten te voorkomen. CNST20 = 20° is een goed compromis tussen gevoeligheid en lage herkoppelingsartefacten 21,23,25.
   3. Stel de harde pulslengte (P1) in op de eerder gekalibreerde waarde en de pulslengte van de PSYCHE-vorm op 30 ms (P40) (Figuur S6).
      OPMERKING: Het is belangrijk om de waarde van de harde puls te kalibreren, omdat de vormpulskrachten er automatisch uit worden berekend.
   4. Kies de puls in de PSYCHE_Saltire_10kHz_30m vorm voor het PSYCHE-element (Figuur S6).
   5. Stel de sterkte in van de pulsveldgradiënt die wordt toegepast tijdens het PSYCHE-element (GPZ10). Kies RECT.1 voor de gradiëntvormpuls (GPNAM 10) (Figuur S7).
      OPMERKING: Tijdens het PSYCHE-element wordt een zwakke magnetische veldgradiënt toegepast, normaal gesproken tussen 1% en 4% van de maximale sterkte van de gradiënt, een waarde die afhankelijk is van de sonde.
   6. Stel het aantal stappen van de SAPPHIRE J-modulatie in F2 (TD2) in (Figuur S7).
      OPMERKING: normaal gesproken zorgen 8 stappen voor een uitstekende onderdrukking van zijbandartefacten (Figuur 2 en 3). Het totale aantal scans van de uiteindelijke Pure Shift FID is NS*TD2. ²³ okt.
   7. Stel de spectrale vensters F1 en F2 (SW1 en SW2) in (Figuur S5).
      OPMERKING: SW2=SW3/(2*TD2) en SW3/SW1 = TD2*N, waarbij TD2 en N zelfs gehele getallen²³ zijn. Het saffier-PSYCHE-experiment wordt verworven als een pseudo-3D waarbij F2 codeert voor de J-koppeling artefactfasemodulatie en F1 voor de Pure Shift-interferogramacquisitie²⁰. Aangezien SAPPHIRE-PSYCHE de J-modulatiezijbanden verwijdert, kan de interferogram Pure Shift-blokduur langer zijn dan die van reguliere PSYCHE (Pure Shift-blokduur = 1/SW1), meestal tussen 20 en 40 ms (Figuur 2). Langere data-acquisitie leidt echter tot hogere J-koppelingsevoluties, wat meer J-koppelingsfasemodulatiestappen zou vereisen om de sterkere zijbanden te verwijderen die zijn bereikt²³.
   8. Stel het aantal Pure Shift-blokken (TD1) in (Figuur S7).
      OPMERKING: Aangezien SAPPHIRE-PSYCHE de J-koppelingsfasemodulatie van het eerste blok moet compenseren, moet er een extra blok worden aangeschaft. Meestal geven 17 (16+1) of 33 (32+1) blokken voldoende digitale resolutie²³.
   9. Verwerk de gegevens door de pm_pshift en de pm_fidadd AU-programma's uit te voeren, gevolgd door Fouriertransformatie²³.
      OPMERKING: We raden aan om het spectrum te transformeren met behulp van nulvulling en een sinusklok-apodisatie (Figuur S4).

Resultaten

Analyse van het NMR-spectrum
PSYCHE-experimenten verhogen de spectraresolutie door gekoppelde resonanties in singlets²¹ in te storten, wat op zijn beurt de overlap vermindert en toewijzing en gegevensanalyse vergemakkelijkt. Pure Shift NMR kan worden toegepast op plantenextracten. Hier demonstreren we het gebruik ervan in drie verschillende matrices: vanilleblaadjes, aardappelknollen en Physalis peruviana-vruchten . De resolutieverbete...

Discussie

Structurele identificatie en kwantificering van metabolieten zijn sleutelkwesties bij de karakterisering van het metaboloom, gegevens die, wanneer ze worden onderworpen aan multivariabele analyses, het mogelijk maken om het bestudeerde biologische systeem beter te begrijpen. Monstervoorbereiding en gegevensverzameling zijn kritieke aspecten die moeten worden geoptimaliseerd om betrouwbare resultaten te leveren.

In dit artikel beschrijven en illustreren we de m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
77500 Series Freezone 4.5 Liter benchtop	Labconco	77500
Bruker Avance III 500 MHz uitgerust met een 5 mm TCI Z-gradient cryogene sonde	Bruker Corporation
Centrivap Gekoelde Centrifugale Concentrators Labconco 7310000 Serie	Labconco	7310000
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882
Slijpmachine MKM6003	Bosch	MKM6003
Licuadora Blender 8011S model Hgb2wts3	Waring	Hgb2wts3
Methanol-d4	Sigma-Aldrich	151947