Generatie, onderhoud en karakterisering van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide darm- en colonorganoïden

Summary

Hier worden gedetailleerde methoden beschreven voor het genereren, onderhouden en karakteriseren van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide dunne darm- en colonorganoïden. Deze methoden zijn ontworpen om de reproduceerbaarheid te verbeteren, de schaalbaarheid uit te breiden en de werktijd te verkorten die nodig is voor het plateren en passeren van organoïden.

Abstract

Darmregionale specificatie beschrijft een proces waarbij unieke morfologie en functie worden overgedragen aan gedefinieerde gebieden van het zich ontwikkelende maagdarmkanaal (GI). Regionale specificatie in de darm wordt bepaald door meerdere ontwikkelingsroutes, waaronder de botmorfogenetische proteïne (BMP)-route. Op basis van normale regionale specificatie werd een methode ontwikkeld om menselijke colonorganoïden (HCO's) te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), waaronder menselijke embryonale stamcellen (hES) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Een driedaagse inductie van BMP-signalering vormt voldoende patronen in mid-/hinddarm-buisculturen in speciale AT-rijke sequentiebindende proteïne 2 (SATB2)-tot expressie brengende HCO's die alle belangrijke epitheelceltypen bevatten die aanwezig zijn in de menselijke dikke darm, evenals co-ontwikkelende mesenchymale cellen. Het weglaten van BMP (of toevoeging van de BMP-remmer NOGGIN) tijdens deze kritieke patroonperiode resulteerde in de vorming van menselijke darmorganoïden (HIO's). HIO's en HCO's lijken morfologisch en moleculair op respectievelijk de zich ontwikkelende dunne darm en de dikke darm van de mens. Ondanks het nut van HIO's en HCO's voor het bestuderen van de menselijke darmontwikkeling, is het genereren van HIO's en HCO's een uitdaging. Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, onderhouden en karakteriseren van HIO's en HCO's. Daarnaast worden de kritieke stappen in het protocol en aanbevelingen voor probleemoplossing gegeven.

Introduction

Het bestuderen van de ontwikkeling van de menselijke dikke darm is moeilijk vanwege beperkingen op het gebruik van menselijk foetaal weefsel. Diermodellen zijn van onschatbare waarde geweest en in het verleden gebruikt voor genetische benaderingen bij muizen om de darmontwikkeling te bestuderen. Verschillen tussen de darmontwikkeling van muizen en mensen beperken echter de toepasbaarheid van muizen als modelsysteem. Hoewel de vorming van crypten in de dunne darm en de dikke darm van muizen bijvoorbeeld postnataal plaatsvindt, worden mensen geboren met volledig gevormde crypten¹. Bovendien bevatten de menselijke dunne darm en dikke darm celtypen die niet bij muizen worden aangetroffen, waaronder motilin (MLN)-expressie van entero-endocriene cellen in de dunne darm² en mucine 5B (MUC5B)-expressie van bekercellen in de dikke darm ^3,4. Om deze reden is het belangrijk om een celkweeksysteem te hebben dat nauwkeurig de dynamische moleculaire gebeurtenissen modelleert die de vroege stadia van de ontwikkeling van de dikke darm bepalen. Daarom biedt het sturen van hPSC's om cellen met colonkenmerken te genereren een krachtig model voor de studie van de ontwikkeling van de menselijke dikke darm.

Er zijn protocollen ontwikkeld om de reproduceerbare⁵, synchrone en efficiënte vorming van darmachtige⁶ en colonachtige organoïden⁷ uit hPSC's te vergemakkelijken. Deze protocollen maken gebruik van een stapsgewijze differentiatieprocedure die de ontwikkeling van de foetale darm en dikke darm nabootst (Figuur 1). Ten eerste wordt definitief endoderm gegenereerd uit menselijke pluripotente stamcellen door behandeling met Activine A, een nodaal mimeticum. Blootstelling van het definitieve endoderm aan hoge niveaus van WNT en fibroblastgroeifactor (FGF) induceert morfogenese in CDX2⁺ sferoïden in de midden-/achterdarmbuis. Sferoïden van de middendarm/dikke darm worden vervolgens ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) en gevormd in HIO's of HCO's door middel van een voorbijgaande manipulatie van BMP-signalering. Het remmen van BMP-signalering met NOGGIN of het toevoegen van groeimedium alleen resulteert in de vorming van HIO's, die lijken op de menselijke proximale dunne darm.

Door BMP-signalering te activeren met behulp van BMP2, worden sferoïden in de midden-/achterdarm gevormd tot HCO's, die de patroonvorming in het epitheel en mesenchym⁷ behouden. HCO's bevatten met dikke darm verrijkte bekercellen die MUC5B tot expressie brengen en zijn in staat om darmspecifieke insuline-achtige 5 (INSL5)-tot expressie brengende entero-endocriene cellen te genereren. Geïsoleerd mesenchym uit HCO's brengt homeobox A13 (HOXA13) en HOXD13 tot expressie, die ook tot expressie komen in humaan primair colonmesenchym⁸. Het is belangrijk om te onthouden dat de patroonstap plaatsvindt tijdens dag 7-10 van het differentiatieprotocol. Deze periode van drie dagen is voldoende om colonpatronen te induceren die behouden blijven na uitgebreide in-vitrocultuur .

De hieronder beschreven protocollen zijn bedoeld voor onderzoekers die bekend zijn met de feedervrije hPSC-cultuur. Voor onderzoekers die niet bekend zijn met dit type hPSC-cultuur, is een training over hPSC's zoals die wordt aangeboden door Stem Cell Technologies of de Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) in het Cincinnati Children's Hospital aan te bevelen. De kwaliteit van de startende hPSC's is van cruciaal belang en kan van invloed zijn op alle stroomafwaartse stappen. Het protocol dat volgt, begint met hPSC's die 4 dagen zijn gekweekt en klaar zijn om te splitsen.

Protocol

1. Generatie van menselijke darm- en colonorganoïden

1. Voorbereiden van ECM-gecoate platen
   1. Voeg 50 ml koud DMEM-medium toe aan een conische buis van 50 ml.
   2. Verwijder een hoeveelheid van 4x hESC-gekwalificeerde ECM (zie de materiaaltabel) uit de vriezer van -80 °C en ontdooi op ijs.
      NOTITIE: Raadpleeg het analysecertificaat van het product om het volume ESC-gekwalificeerde ECM te bepalen dat nodig is om een 4x voorraad te bereiden.
   3. Als de hESC-gekwalificeerde ECM niet volledig is ontdooid, neem dan 750 μL DMEM uit de conische buis van 50 ml en meng dit met de ECM.
   4. Breng het DMEM/hESC-gekwalificeerde ECM-mengsel over in de conische buis van 50 ml met DMEM en meng goed. Voeg 0,5 ml per putje toe aan elk van de 4 celkweekplaten met 24 putjes.
   5. Schud de platen om de ECM gelijkmatig over de put te verdelen om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt is. Sluit de met ECM beklede platen met behulp van parafilm af en laat ze minimaal 1 uur op kamertemperatuur in een bioveiligheidskast staan. Bewaar ECM-gecoate platen bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken of totdat ze nodig zijn.
2. hPSC's eencellige beplating
   1. Plaats een ECM-gecoate plaat met 24 putjes gedurende 30 minuten in een bioveiligheidskast om deze op kamertemperatuur te laten komen.
   2. Plaats mTeSR1 complete medium, celloslatingsoplossing en geavanceerde DMEM in een waterbad van 37 °C en laat ze 30 minuten opwarmen.
   3. Controleer of hPSC's ten minste 85% confluent zijn met minimale differentiatie. Verwijder indien nodig alle gedifferentieerde cellen.
   4. Bereid het platingmedium als volgt voor in een conische buis van 50 ml: 13 ml mTeSR1 en 13 μl 10 mM Y-27632 Rho-geassocieerde proteïnekinase (ROCK)-remmer.
      OPMERKING: Y-27632 remt anoikis en verhoogt de overleving van afzonderlijke cellen.
   5. Om cellen van een plaat met 6 putjes te verzamelen, zuigt u het medium op van 3 tot 4 putjes en wast u één keer met 2 ml geavanceerde DMEM per putje.
   6. Zuig de geavanceerde DMEM op en doseer 1 ml van de celdissociatieoplossing in elk putje. Incubeer de plaat gedurende 5-7 minuten in een incubator met 5% CO₂, 37 °C. Controleer onder de microscoop of cellen in suspensie zijn.
   7. Dissocieer eventuele resterende klontjes cellen door 4-5 keer op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van 5 ml.
   8. Voeg 2 ml geavanceerde DMEM toe aan elk putje, pipetteer voorzichtig 4-5 keer op en neer en breng over naar een conische buis van 15 ml. Draai de cellen 3 minuten op 300 × g bij kamertemperatuur.
   9. Zuig het medium uit de buis zonder de celpellet op te zuigen en voeg 6 ml van het voorbereide medium mTeSR1 plus ROCK-remmer toe. Resuspendeer de cellen voorzichtig door 3-4 keer op en neer te pipetteren en breng de suspensie vervolgens over naar de rest van het mTeSR1/ROCK-remmermedium in de buis van 50 ml. Resuspendeer krachtig 4-5 keer en tel de cellen met behulp van een hemacytometer.
   10. Zuig de ECM op van de plaat met 24 putjes net voor het plateren van de cellen. Resuspendeer de cellen opnieuw door 2-3 keer op en neer te pipetteren en doseer 0,5 ml van de celsuspensie in elk putje.
       OPMERKING: De optimale beplatingsdichtheid moet worden bepaald door de onderzoeker. Hier is het optimale celgetal 80.000-200.000 cellen per putje.
   11. Schud de plaat voorzichtig 3 keer met de klok mee, 3 keer tegen de klok in, 3 keer vooruit en achteruit en 3 keer van links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verspreiden.
   12. Breng de plaat over naar een incubator van 37 °C, 5% CO₂ en incubeer gedurende 24 uur.
       OPMERKING: Verstoor de plaat de eerste paar uur niet om een goede verspreiding van cellen in de putjes te garanderen.
   13. Zuig na 24 uur (Figuur 2A) het verbruikte medium op, voeg 0,5 ml mTeSR1 per putje toe, incubeer opnieuw bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 24 uur (Figuur 2B) en ga dan verder met de volgende stap.
3. Differentiatie van definitief endoderm (DE) van hPSC's
   1. Voeg in een conische buis van 15 ml 13 ml Activine Day 1 medium toe (zie de materiaaltabel), 13 μl 100 μg/ml Activine A en 1,95 μl 100 μg/ml BMP4. Verwarm het medium in een waterbad van 37 °C.
   2. Zuig het mTeSR1-medium op van de plaat met 24 putjes en voeg 0,5 ml Activin Day 1-medium per putje toe. Plaats de plaat in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ en incubeer gedurende 24 uur. Controleer de cellen na 24 uur.
      OPMERKING: Uitgebreide celdood zou duidelijk moeten zijn, zoals weergegeven in figuur 2C. Hoewel de monolaag schaars zal lijken, zullen kolonies cellen zich hebben uitgebreid.
   3. Bereid Activin Dag 2 volledig medium voor door 12,5 μL 100 μg/ml Activine A toe te voegen aan 12,5 ml Activin Dag 2 medium in een conische tube van 15 ml. Plaats de buis in een waterbad van 37 °C.
   4. Neem de 24-puts differentiatieplaat uit de CO₂ -incubator en verwijder het verbruikte medium. Doseer 0,5 ml voorverwarmd Activin Day 2 medium per putje en plaats de plaat 24 uur terug in de CO₂ -incubator.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het doseren van het medium. Doseer het medium niet direct in het midden van het putje, omdat hierdoor de cellen in de monolaag loskomen. Doseer voorzichtig het medium langs de zijkant van de put. De volgende dag wordt een monolaag cellen gevormd met verwaarloosbare celdood. Cellen zouden nu ~90 tot 95% confluent moeten zijn (Figuur 2D).
   5. Bereid Activin Day 3 volledig medium voor door 12,5 μL 100 μg/ml Activine A toe te voegen aan 12,5 ml Activin Day 3 medium in een conische tube van 15 ml. Plaats de buis in een waterbad van 37 °C.
   6. Verwijder het gebruikte medium en doseer 0,5 ml Activin Day 3 medium per putje.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het doseren van medium. Doseer het medium niet direct in het midden van de put, omdat hierdoor de cellen in de monolaag loskomen. Doseer voorzichtig het medium langs de zijkant van de put. De volgende dag zou de monolaag in dit stadium volledig moeten samenvloeien met weinig tot geen celdood. Probeer geen sferoïden in het midden van de dikke darm te genereren als de monolaag 24 uur na het toevoegen van het medium Activin Day 3 niet samenvloeit. Zie figuur 2E voor de ideale morfologie van de DE-monolaag voordat we overgaan tot het genereren van sferoïden in de middenachterdarm.
   7. Voer immunofluorescentie (IF)-kleuring uit van de monolaag voor de expressie van forkhead box A2-eiwit (FOXA2) en geslachtsbepalende regio Y (SRY)-box transcriptiefactor 17 (SOX17) bij het optimaliseren van DE-differentiatie.
4. Differentiatie van DE in sferoïden in de midden-achterdarm
   1. Voeg in een conische buis van 50 ml 25 ml inductiemedium in de middendikke darm met FGF4 (geen CHIR99021) toe en plaats dit 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
   2. Om het volledige inductiemedium in de middendikke darm te bereiden, voegt u 7,5 μL CHIR99021 toe nadat het medium warm is.
   3. Verwijder het gebruikte medium, doseer 0,5 ml inductiemedium in de middendikke darm per putje en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C 5% CO₂ .
   4. Nadat de condensatie van de cellen in de monolaag de volgende dag heeft plaatsgevonden (figuur 3A), vervangt u het gebruikte medium door vers inductiemedium in de middendarm en plaatst u de plaat gedurende 24 uur terug in een incubator van 37 °C met 5% CO₂ .
      OPMERKING: Buisvormige structuren zullen merkbaar zijn na 48 uur inductie in het midden van de achterdarm, zoals weergegeven in figuur 3B. De sferoïden in het midden van de hinddarm beginnen op dag 3 uit de monolaag te ontluiken, zoals weergegeven in figuur 3C.
   5. Om te voorkomen dat de drijvende sferoïden worden weggegooid tijdens het verwisselen van het medium, brengt u het oude medium over in een buis van 15 ml en centrifugeert u gedurende 1 minuut op 300 × g . Resuspendeer de sferoïden in 12,5 ml vers inductiemedium in de middendarm, voeg 0,5 ml per putje toe aan dezelfde plaat met 24 putjes en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 24 uur.
   6. Oogst op dag 4 van de inductie van de dikke darm (Figuur 3D) drijvende sferoïden uit de plaatputten door het medium op te vangen in een buis van 15 ml, gevolgd door centrifugeren bij 300 × g gedurende 1 minuut. Ga verder met de volgende stap voor het inbedden van sferoïden in de middendikke darm in ECM.
5. Beplating en patroonvorming van sferoïden in de midden-/achterdarm in ECM
   1. Ontdooi de ECM-basaalmembraanmatrix 's nachts bij 4 °C voor de inbedding.
      OPMERKING: Deze ECM verschilt van de hESC-gekwalificeerde ECM. De ECM moet op ijs worden gezet en het juiste volume ECM kan worden verdeeld in voorgekoelde microcentrifugebuisjes van 1,5 ml op ijs. Tabel 1 bevat informatie over het ECM-volume. Zorg ervoor dat het volume ECM ten minste 75% is in de druppel waarin de sferoïden zullen worden ingebed.
   2. Verwarm een plaat met 24 putjes in een broedstoof van 37 °C.
   3. Verzamel de drijvende sferoïden uit alle 24 putjes met behulp van een pipet van 1000 μl en breng ze over in een conische buis van 15 ml. Draai de sferoïden gedurende 1 minuut op kamertemperatuur op 300 × g . Zuig het grootste deel van het medium op, maar laat het volume over dat nodig is voor het plateren (tabel 1).
   4. Bereid 1000 μL en 200 μL pipetpunten voor door de uiteinden af te snijden. Haal de voorverwarmde plaat met 24 putjes eruit.
   5. Meng de drijvende sferoïden, breng het juiste volume over naar de ECM-buis die op ijs is geplaatst en suspendeer vervolgens de sferoïden en ECM opnieuw door te pipetteren om ze goed te mengen.
   6. Neem 65 μL van het mengsel van sferoïden en ECM met de gesneden 200 μL pipetpunten en laad deze naar het midden van elk putje in de plaat met 24 putjes. Om er zeker van te zijn dat er een goede ECM-druppel wordt gevormd, tilt u de pipet voorzichtig en langzaam op terwijl het mengsel wordt gedoseerd.
      OPMERKING: Plaat 30-100 sferoïden per putje.
   7. Breng de plaat voorzichtig over naar een incubator van 37 °C, 5% CO₂ en incubeer gedurende 5 minuten.
   8. Draai de plaat ondersteboven en incubeer gedurende 15-25 minuten, waardoor de ECM-druppels een koepelachtige structuur behouden.
   9. Bereid tijdens de incubatie het gewenste medium voor en warm het op. Zodra de ECM is gestold, voegt u 0,5 ml HIO- of HCO-patroonmedium toe aan elk putje en incubeert u bij 37 °C, 5% CO₂. Zie Figuur 3E voor een afbeelding van sferoïden in ECM.
   10. Kweek de sferoïden gedurende 3 dagen in het patroonmedium.
   11. Verander na 3 dagen het HIO- of HCO-patroonmedium in een normaal groeimedium en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂.
       LET OP: De organoïden op dit tijdstip (dag 10) zijn organoïden in een vroeg stadium. Op basis van het projectdoel kunnen sommige organoïden in een vroeg stadium worden gebruikt voor vroege patroonanalyse, zoals beschreven in sectie 2.
6. Uitgroei en passage van menselijke darm- en colonorganoïden
   1. Vervang na dag 10 het groeimedium elke 3 dagen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de beplatingsdichtheid en de groei van de organoïden, kunnen frequentere mediawisselingen nodig zijn. Mediumveranderingen moeten worden uitgevoerd voordat het fenolrood (pH-indicator) in het medium geel wordt.
   2. Incubeer de organoïden tot dag 21 (Figuur 3F).
      OPMERKING: BMP2-behandeling zal resulteren in een verminderd aantal organoïden (~3-voudig minder dan HIO's) die uit sferoïden groeien. Daarom moet een groter aantal sferoïden worden geplateerd voor het genereren van HCO's.
7. Splitsing van organoïden op dag 21
   1. Inspecteer de organoïden.
      OPMERKING: De organoïden moeten op dag 21 worden gesplitst, omdat de ECM op dag 21 bijna is afgebroken als gevolg van de groei en uitbreiding van organoïden.
   2. Bereid de pipetpunten van 1000 μl en 200 μl voor door de uiteinden af te knippen.
   3. Verwarm een Nunc-plaat met 24 putjes in een broedmachine van 37 °C.
   4. Verdeel het juiste volume ECM in de voorgekoelde buizen van 1,5 ml (tabel 1).
   5. Schraap de ECM-druppel met de organoïden voorzichtig af met een pipetpunt van 1000 μL en pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer om de ECM te breken.
   6. Breng het mengsel over in een petrischaaltje van 60 mm en controleer de organoïden onder een microscoop. Scheid de organoïden eventueel van elkaar met behulp van een steriele tang. Zorg ervoor dat de scheiding het epitheel van de organoïden niet beschadigt.
   7. Breng de organoïden over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 30 s bij 300 × g . Zuig het bovenstaande op en laat ~1 ml medium in de buis.
      OPMERKING: Het volume van het medium kan worden gewijzigd op basis van het doel van het experiment. Als er meer organoïden per ECM-druppel nodig zijn, kan het mediumvolume worden verlaagd. Als er echter minder organoïden nodig zijn, kan het gemiddelde volume worden verhoogd.
   8. Meng de organoïden goed, breng het juiste volume over in de ECM-buis die op ijs is geplaatst en suspendeer de organoïden en ECM vervolgens opnieuw door te pipetteren om ze goed te mengen.
   9. Voeg 65 μL van het mengsel van sferoïden en ECM toe aan het midden van elk putje van de 24-gaats plaat met behulp van de gesneden 200 μL pipetpunten.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om tijdens het pipetteren eerst de organoïden op te nemen en vervolgens de ECM. Tijdens het doseren van het mengsel bevinden de organoïden zich dus aan de bovenkant van de ECM-druppel.
   10. Zet de plaat 5 minuten in een incubator van 37 °C met 5% CO₂ .
   11. Draai de plaat nog 15-25 minuten ondersteboven om ervoor te zorgen dat de ECM-druppels een koepelachtige structuur behouden.
   12. Voeg 0,5 ml HIO/HCO-uitgroeimedium toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂.
       OPMERKING: Het uitgroeimedium is hetzelfde voor zowel HIO's als HCO's na patroonvorming.
   13. Vervang het medium elke 2-3 dagen tot dag 35 (Figuur 3G).

2. Verificatie van de patroonvorming van organoïden door middel van reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

1. Voordat u RNA verzamelt, moet u 1x RNA-lysisbuffer voorbereiden volgens de instructies van de fabrikant.
2. Gooi het verbruikte medium weg en voeg 350 μL lysisbuffer toe aan elk putje van de plaat met 24 putjes. Lyseer de organoïden door op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml. Voor een betere lysis, vortex kort op maximale snelheid gedurende 5 s.
3. Bewaar alle monsters bij -80 °C tot ze klaar zijn voor RNA-extractie. Als u klaar bent, haalt u de RNA-monsters uit de vriezer van -80 °C en ontdooit u ze 10 minuten op ijs. Draai de buizen krachtig bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten om volledige lysis van de monsters te garanderen.
4. Plaats de monsters opnieuw op ijs en ga verder met RNA-extractie volgens de instructies van de fabrikant. Breng de RNA-monsters over naar een vriezer van -80 °C als u nog niet klaar bent om door te gaan naar de volgende stap.
5. Voer RNA-extractie, DNAse-behandeling, cDNA-synthese en RT-qPCR uit met behulp van standaardmethodologie. Raadpleeg Tabel 2 voor een lijst met namen en sequenties van primers.

3. Verificatie van de patroonvorming van organoïden door immunofluorescentie

1. Verzameling en fixatie van organoïden
   1. Zuig HIO- of HCO-medium op uit de juiste putjes en voeg aan elke put 1 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe. Scheid de organoïden van de ECM met behulp van een gesneden pipetpunt van 200 μL. Pipetteer op en neer om grote brokken ECM van de organoïden te scheiden.
   2. Breng de organoïden over in een conische buis van 15 ml en vul de rest van de buis met ijskoud PBS en meng voorzichtig door de buis om te keren. Laat de organoïden door de zwaartekracht bezinken en aspireer de PBS.
      OPMERKING: Als de organoïden niet bezinken door de zwaartekracht, centrifugeer dan gedurende 1 minuut bij 300 × g .
   3. Zuig de PBS op en voeg 1 ml ijskoude ECM-afbrekende oplossing toe. Houd de buis 10-15 minuten op ijs op een roterend platform met zacht schudden.
      OPMERKING: Kantel de buis in een hoek van 45° om een goede menging van de organoïden en de celhersteloplossing mogelijk te maken. Na 10-15 minuten moeten de organoïden zich op de bodem van de buis nestelen, wat de volledige vertering van de ECM aangeeft.
   4. Voeg koude PBS toe in de buis tot 15 ml; Meng goed door de tube meerdere keren om te keren. Wanneer de organoïden zich op de bodem van de buis nestelen, zuigt u de PBS op en voegt u 1 ml voorgekoeld 4% paraformaldehyde toe om de organoïden te fixeren. Incubeer de organoïden met 4% paraformaldehyde op ijs gedurende 1 uur.
   5. Vul de rest van de tube met ijskoude PBS en plaats deze een nacht horizontaal op een schommelplateau bij 4 °C. Gooi de volgende dag het paraformaldehyde/PBS weg in de daarvoor bestemde afvalcontainer en was het eenmaal met 15 ml ijskoud PBS, zoals beschreven in stap 3.1.2.
   6. Zuig de PBS op en vul de tube met 30% sucrose in PBS. Plaats de buis een nacht horizontaal op een schommelplateau bij 4 °C.
   7. De volgende dag embed de organoïden in een basismodel van 7 mm x 7 mm x 5 mm met OCT-medium en vries ze snel in met behulp van een droogijs/ethanolbad.
   8. Droog de blokken af met laboratoriumdoekjes, wikkel ze in een papieren handdoek en bewaar ze een nacht in een vriezer van -80 °C. Snijd de volgende dag 5 μm-secties op microscoopglaasjes met behulp van een cryostaat. Bewaar de glaasjes bij -80 °C.
2. Immunofluorescentie kleuring van de organoïden
   1. Verwerk de objectglaasjes uit de vriezer van -80 °C en voer IF-kleuring uit volgens standaardprotocollen.
   2. Breng dekglaasjes aan op de objectglaasjes en droog ze bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht gedurende ten minste 2 uur of een nacht voordat u ze beeldt.
   3. Maak de dia's foto's met behulp van een 25x objectief van een confocale microscoop.

Results

De succesvolle generatie van sferoïden tijdens de inductiefase van het midden/achterdarm is een indicatie van succesvolle patroonvorming. Voer IF-kleuring voor CDX2 uit op zwevende sferoïden en op de monolaag om te bevestigen dat de patronen correct zijn. Hoewel kleuring in het definitieve endoderm (DE) stadium de effectiviteit van DE-inductie kan aangeven, is sferoïde generatie niet mogelijk zonder efficiënte DE-inductie. Om de efficiëntie van DE-inductie te testen, voert u IF-kleuring ...

Discussion

De differentiatie van hPSC's in HIO's en HCO's is een complex proces dat bij elke stap kwaliteitscontroles vereist. De beginnende hPSC's moeten minimale differentiatie hebben voordat differentiatie naar DE wordt geïnitieerd. Het optimaliseren van de dichtheid van hPSC's die zijn geplateerd voor DE-differentiatie is van cruciaal belang voor het succes van het protocol. Om de kwaliteit van DE-differentiatie te waarborgen, voert u IF uit voor FOXA2 en SOX17 om de efficiëntie van DE-differen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Gemaakt in PBS.
5% Normaal ezelsserum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Celdetacheringsoplossing; verdeel 5 mL Accutase in 10 mL buizen totaal 20 buizen en bewaar bij -20 °C tot 6 maanden. Plaats bij 4 °C een nacht voor gebruik.
Activine A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitueer het gelyofiliseerd poeder op 100 µg/mL in steriele PBS met 0,1% bovien serumalbumine (BSA). Verdeel 38 µL van Activine A in voorgekoelde microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 °C (buizen verlopen 12 maanden na ontvangst).
Activine Dag 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Gebruik niet-essentiële aminozuren (NEAA, Corning 11140050) en bewaar bij 4 °C. Basisdag 1 medium: 500 mL van RPMI 1640 en 500 mL van NEAA. Wanneer je Activine Dag 1 medium bereidt, voeg dan 13 mL van basisdag 1 medium, 13 µl van Activine A (100 µg/mL), en 2 µl van BMP4 (100 µg/mL) toe. Het basismedium is tot 3 weken stabiel maar moet direct na toevoeging van groeifactoren worden gebruikt.
Activine Dag 2 medium (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Gebruik niet-essentiële aminozuren (Corning 11140050) en bewaar bij 4 °C. Basisdag 2 medium: 500 mL van RPMI 1640, 500 mL van NEAA en 1 mL van 0,2% serum. Wanneer je Activine Dag 2 medium bereidt, voeg dan 12,5 mL van basisdag 2 en 12,5 µL van Activine A (100 µg/mL) toe. Het basismedium is tot 3 weken stabiel maar moet direct na toevoeging van groeifactoren worden gebruikt.
Activine Dag 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Gebruik niet-essentiële aminozuren (Corning 11140050) en bewaar bij 4 °C. Basisdag 3 medium: 500 mL van RPMI 1640, 500 mL NEAA en 10 mL van 2% serum. Wanneer je Activine Dag 3 medium bereidt, voeg dan 12,5 mL van basisdag 3 en 12,5 µL van Activine A (100 µg/mL) toe. Het basismedium is tot 3 weken stabiel maar moet direct na toevoeging van groeifactoren worden gebruikt.
Alexa Fluor 488 Ezel anti-Geit	Thermo Scientific	A11055	1:500 verdunning (Secundaire antilichaam)
Alexa Fluor 488 Ezel anti-Konijn	Thermo Scientific	A21206	1:500 verdunning (Secundaire antilichaam)
Alexa Fluor 546 Ezel anti-Muis	Thermo Scientific	A10036	1:500 verdunning (Secundaire antilichaam)
Alexa Fluor 647 Ezel anti-Muis	Thermo Scientific	A31571	1:500 verdunning (Secundaire antilichaam)
Basisvorm	Fisher	22-363-552	N/A
Basis darm medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	Wanneer je Basis darm medium bereidt, voeg dan 500 mL van DMEM, 500 mL van N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL van B27 (Gibco), 500 mL van L-Glutamine toe om 2 mM L-Glutamine te krijgen (Corning A2916801), 5 mL van 100 U/mL Penicilline-Streptomycine (Gibco 15-140-122), en 7,5 mL van  1 M HEPES toe om 15 mM HEPES te krijgen.  Het basismedium is tot 3 weken stabiel maar moet direct na toevoeging van groeifactoren worden gebruikt.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detectiesysteem	Biorad	N/A	Andere qRT-PCR systemen kunnen worden gebruikt.
Celherstel oplossing	Corning	354253	ECM-afbraak oplossing
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitueer door 2,15 mL van DMSO op 10 mM toe te voegen. Bereid 50 µL aliquoten en bewaar bij -20 °C.  Bewaar poeder bij 4 °C, beschermd tegen licht.
CTRL HIO patroon medium	N/A	N/A	Basis darm medium en 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 verdunning (Secundaire antilichaam)
DE monolaag	N/A	N/A	Monolaag is gegenereerd in eerdere stappen (Sectie 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspendeer het gelyofiliseerd poeder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) tot een eindconcentratie van 1 mg/mL. Filter de oplossing voor sterilisatie door vacuüm met behulp van een Millipore filter sterilisatiebuis. Maak 10 mL aliquoten (1 mg/mL) en bewaar bij -20 °C tot 6 maanden. Plaats bij 4 °C een nacht voor gebruik.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	Wanneer je 100 ng/mL EGF bereidt, reconstitueer 500 µg/mL in steriele PBS. Voeg vervolgens 2 mL steriele PBS toe aan 1 mg EGF en maak 500 µ