Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van actief nucleair extract uit larvale stadium 4 C. elegans en het visualiseren van transcriptieactiviteit in een in vitro systeem.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is sinds de introductie in 1963 een belangrijk modelsysteem voor biologisch onderzoek. C. elegans is echter niet volledig gebruikt in de biochemische studie van biologische reacties met behulp van zijn nucleaire extracten zoals in vitro transcriptie en DNA-replicatie. Een belangrijke hindernis voor het gebruik van C. elegans in biochemische studies is het verstoren van de dikke buitenste cuticula van de nematode zonder de activiteit van het nucleaire extract op te offeren. Hoewel verschillende methoden worden gebruikt om de nagelriem te breken, zoals Dounce-homogenisatie of ultrasoonapparaat, leiden ze vaak tot eiwitinstabiliteit. Er zijn geen vastgestelde protocollen voor het isoleren van actieve nucleaire eiwitten uit larven of volwassen C. elegans voor in vitro reacties. Hier beschrijft het protocol in detail de homogenisatie van larvale stadium 4 C. elegans met behulp van een Balch-homogenisator. De Balch-homogenisator gebruikt druk om de dieren langzaam door een smalle opening te dwingen die de cuticula breekt tijdens het proces. Het uniforme ontwerp en de nauwkeurige bewerking van de Balch-homogenisator maken een consistente slijping van dieren tussen experimenten mogelijk. Fractionering van het homogenaat verkregen uit de Balch-homogenisator levert functioneel actief nucleair extract op dat kan worden gebruikt in een in vitro methode voor het testen van de transcriptieactiviteit van C. elegans.

Inleiding

De kleine, vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudig maar krachtig modelorganisme voor het aanpakken van een breed scala aan biologische vragen. Sinds de introductie in 1963 zijn de nematoden van onschatbare waarde geweest voor het beantwoorden van vragen in neurobiologie, metabolisme, veroudering, ontwikkeling, immuniteit en ^genetica1. Enkele van de vele kenmerken van het dier die het een ideaal modelorganisme maken, zijn korte generatietijd, de effectiviteit van RNA-interferentie, transparant lichaam en de voltooide kaarten van zowel de cellulaire afstamming als het zenuwstelsel.

Hoewel ....

Protocol

1. Mediavoorbereidingen

1. Bereid steriele lysogeniebouillon (LB) agarplaten en vloeibare media volgens de instructies van de fabrikant.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 op een LB agarplaat. Incubeer de bacteriestreak bij 37 °C 's nachts.
3. Bewaar de E. coli OP50 streepplaat bij 4 °C na incubatie. De E. coli OP50 plaat kan veilig worden bewaard bij 4 °C gedurende 2 weken indien verpakt in parafilm om vochtverlies te voorkomen.
4. Bereid 2 L Nematode Growth Media (NGM) met behulp van het recept in tabel 1.
   OPMERKING: Nystatine is optioneel. Nystatine helpt voorkomen dat s....

Resultaten

Het volgen van de geschetste stappen zou functioneel nucleair extract moeten opleveren (figuur 1), afwijking in de maal- of wasstappen kan leiden tot slechte activiteit of lage opbrengsten. Als functioneel C. elegans nucleair extract wordt verkregen, zal het het gebied stroomafwaarts van de CMV-promotor op het DNA-sjabloon transcriberen wanneer het wordt toegevoegd aan de eerder beschreven in vitro test. Het resulterende RNA-transcript kan .......

Discussie

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om het eukaryote transcriptiesysteem te bestuderen vanwege het goedkope onderhoud en het gemak van genetische manipulatie. Hier wordt een protocol voor consistente isolatie van functioneel actief nucleair extract van L4 C. elegans beschreven. Hoewel dit protocol gericht was op het visualiseren van transcriptieactiviteit, kan het cDNA dat post-transcriptioneel wordt geproduceerd, worden gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR om een nauwkeurigere meting van d.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Verbruiksartikelen en reagentia
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL individuele PCR-buizen	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL steriele microbuizen	Genesee Scientific	24-282S
100% absoluut moleculair graad ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serologische pipet	VWR international	89130-898
150 mm petrischalen	Tritech Research	T3325
15 mL conische centrifugebuizen	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic spuiten	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject spuiten	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuümfiltercup 0,22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conische centrifugebuizen	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serologische pipet	VWR international	89130-902
5 mL serologische pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcoholbestendige marker	VWR International	52877-310
Bacto pepton	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calciumdichloor	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Degeïoniseerd water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel kleuring, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Droog ijs
Escherichia coli OP50-stam	CGC	OP50
Glazijnzuur	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nucleair extract in vitro transcriptie systeem, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes oplossing, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Zoutzuur 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorietbleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesiumdichloor	Millipore Sigma	M8266
Magnesiumsulfaat	Millipore Sigma	M7506
Medium weegschalen	Fisher Scientific	02-202-101
microscoopglaasjes, Vista vision	VWR International	16004-368
moleculair graad water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatine	Millipore Sigma	N1638
PCR systeem, FailSafe met premix A	Lucigen	FS99100
Kaliumchloride	Millipore Sigma	P39111
Kaliumfosfaat dibasisch	Millipore Sigma	P3786
Kaliumfosfaat monobasisch	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
eiwit analysekit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcriptiekit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extractiekit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Natriumchloride	VWR International	BDH9286-12KG
Natriumhydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Steriele spuitfilter met 0,2 µm Polyethersulfon membraan	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcriptie primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcriptie primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Apparatuur
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C koelkast	ThermoFisher Scientific
-80 °C vriezer	Eppendorf