Methodenartikel

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

DOI:

10.3791/62728

⸱

14 juni 2021

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het ontwerp van een minimale DNA-sjabloon en de stappen voor enzymatische amplificatie, waardoor snelle prototyping van testbare eiwitten in minder dan 24 uur mogelijk is met behulp van celvrije expressie. Na ontvangst van DNA van een leverancier wordt het genfragment PCR-versterkt, gesneden, gecirculiseerd en cryo-banked. Een kleine hoeveelheid van het gebankte DNA wordt vervolgens verdund en aanzienlijk versterkt (tot 106x) met behulp van isotherme rollende cirkelversterking (RCA). RCA kan microgramhoeveelheden van de minimale expressiesjabloon opleveren uit picogramniveaus van uitgangsmateriaal (mg-niveaus als alle beginnende synthetische fragmenten worden gebruikt). In dit werk resulteerde een starthoeveelheid van 20 pg in 4 μg van het eindproduct. Het resulterende RCA-product (aaneenschakeling van de minimale sjabloon) kan direct worden toegevoegd aan een celvrije reactie zonder zuiveringsstappen. Omdat deze methode volledig pcr-gebaseerd is, kan het toekomstige screeningsinspanningen met hoge doorvoer mogelijk maken in combinatie met geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celvrije genexpressie (CFE) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel met vele toepassingen. Dergelijke toepassingenomvatten ziektedetectie1,2,3,4,5,6,micronutriënten en detectie van kleinemoleculen 7,8,9,10,11,12,biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, onderwijs19,20,21, productie van moeilijke eiwitten17,22,23,24,25,26,27, en variant screening23,28,29,30,31,32 ,33. Dit komt door het open karakter van celvrije systemen en de flexibiliteit die ze bieden. Veel geweldige overzichtsartikelen bieden historisch onderwijs en toekomstperspectieven op de technologie34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Een typische celvrije reactie bestaat uit drie belangrijke componenten: celextract, energiemix en genetische sjabloon. Actief celextract bevat alle benodigde machines voor transcriptie en vertaling (TXTL) en kan op verschillende manieren worden verwerkt36. Glycolytische tussenproducten, elektrolyten, aminozuren en cofactoren in de energiemix ondersteunen het TXTL-proces. Het is een belangrijke bron van variabiliteit in celvrije experimenten45 en kan op vele manieren worden voorbereid34,46. De voorbereiding van de genetische sjabloon heeft minder verbeteringen ondergaan, omdat traditionele kloonmethoden resulteren in plasmiden met uitstekende expressiekenmerken. Het nadeel van deze traditionele methoden is de doorlooptijd en de hoeveelheid biologische expertise die nodig is om ze te bouwen en te vermeerderen. Recente optimalisatie-inspanningen hebben geresulteerd in eenvoudige 24-uurs workflows voor celextractbereiding47,48 die parallel met energiemixvoorbereiding49,50kunnen worden uitgevoerd. Traditioneel klonen voegt echter meerdere dagen toe aan de cfe prototyping tijdlijn (Tabel 1)23. Snel versterkte PCR-producten uit het commerciële genfragment kunnen direct worden gebruikt51, maar dit beperkt het aantal prototyping-experimenten omdat slechts 1 μg DNA wordt geproduceerd, wat overeenkomt met ongeveer vijf reacties (traditionele volumes van 15 μL). Met deze extra stappen van circularisatie en isotherme amplificatie is meer dan milligram hoeveelheden van het DNA mogelijk (~ 5.000 reacties voor 1 mg). Dit verhoogt drastisch het aantal tests dat kan worden uitgevoerd in high-throughput screening van eiwitten of combinatorische enzymnetwerken (celvrije metabole engineering); het zorgt ook voor een effectieve conservering van de lineaire sjabloonbibliotheek als DNA met hoge concentratie. Bovendien zou een grotere hoeveelheid sjabloon nodig zijn om grotere hoeveelheden eiwit te prototypen die nodig zijn voor materiaalwetenschappelijke toepassingen (op eiwitten gebaseerde vezels en hydrogels). Sommige beperkingen van lineaire sjablonen kunnen worden overwonnen door een uittreksel van BL21 DE3 Star te gebruiken of recent ontdekte methoden te gebruiken om lineaire sjablonen te beschermen tegen degradatie52,53,54. Dit heeft echter geen betrekking op het hebben van beperkte voorraden door de leverancier geproduceerd DNA voor PCR-amplificatie of de kwestie van biologische expertise en apparatuur die nodig is voor klonen.

Dit werk presenteert een protocol dat expliciet is ontworpen om de hoeveelheid expressiesjabloon te verhogen die kan worden verkregen uit kleine hoeveelheden door de leverancier geproduceerde genfragmenten (meestal 500-1000 ng gelyofiliseerd poeder). De beschreven methode vereist niet de vaardigheden die nodig zijn om traditioneel klonen in plasmiden uit te voeren of te transformeren en te vermeerderen in levende cellen. Na ontvangst van een genfragment in de post kan een gebruiker voldoende sjablonen produceren voor veel celvrije reacties door gebruik te maken van isotherme rollende cirkelversterking (RCA) (Figuur 1)23. Hoewel de hoeveelheid DNA die van de leverancier wordt ontvangen voldoende kan zijn voor beperkte screeningsinspanningen, is deze snel uitgeput en is het opnieuw kopen van genfragmenten tijdrovend en kostbaar. De methode is ook bijzonder geschikt voor genen die giftig en moeilijk te klonen zijn in E. coli.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het ontwerpen van het genfragment

OPMERKING: Het genfragment moet alle noodzakelijke genetische elementen bevatten voor transcriptie /translatie, inclusief promotor, ribosoombindingsplaats (RBS), startcodon, het gen van belang en terminator. Hoewel de terminator niet nodig is voor een lineaire expressiesjabloon (LET), is het belangrijk als de gebruiker besluit de reeks in een plasmide in te voegen. Deze sequenties werden opgetild uit het pJL1-sfGFP-plasmide55 (geschenk van het laboratorium van Michael Jewett), dat een T7-promotor gebruikt. Naast deze noodzakelijke genetische elementen wordt een restrictie-enzym cut site toegevoegd zes basenparen voor de promotor (5' cut site) en nog eens zes baseparen na de terminator (3' cut site), in dit geval met behulp van HindIII (andere restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt, maar het is nuttig om de sequenties te standaardiseren met één high fidelity restriction enzyme om het aantal te verminderen dat nodig is om in de bibliotheek te blijven). Primer-sites worden toegevoegd tien baseparen stroomopwaarts van de 5'-cutsite en tien baseparen stroomafwaarts van de 3'-cutsite, in dit geval met behulp van gestandaardiseerde M13-primersequenties (primers zijn goedkope voorraadartikelen). De gebruikte restrictie-enzymplaats en primers zijn ter beoordeling van de gebruiker. De gebruiker moet er echter voor zorgen dat de sequenties nergens anders in de sjabloon aanwezig zijn (wil geen ongewenste sneden of sites van versterkingsinitiatie maken). De volgordes voor de sjablonen die in dit werk worden gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in het aanvullende materiaal. Deze stappen worden gebruikt om wijzigingen aan te brengen vanuit deze basissjabloon.

  1. Bepaal het gewenste gen dat tot expressie moet worden gebracht en verkrijg de aminozuursequentie of de genetische sequentie als deze is uitgedrukt in E. coli.
  2. Als het een aminozuursequentie is, voer dan codonoptimalisatie voor E. coli uit met behulp van een van de vele standaard leverancierstools56. Als u de sjabloon in het supplement gebruikt, zorg er dan voor dat de geoptimaliseerde reeks geen HindIII-beperkingssites (AAGCTT) heeft. In het geval dat dit het geval is, blijft u de reeks optimaliseren totdat er geen HindIII-site meer is.
  3. Kopieer de sequentie en plak deze in de meegeleverde sjabloon voor aanvullende sequentie #1 waar het gen van belang is aangegeven. Als u sfGFP tot expressie brengt, gebruikt u aanvullende reeks #1 zoals deze is. Als u subtilisine tot expressie brengt, gebruikt u aanvullende reeks #2 zoals deze is.
  4. Bestel de minimale template en de benodigde primers bij de gewenste DNA-synthesedienst.

2. Resuspendatie van het genfragment en de primers

OPMERKING: Volg na ontvangst van het genfragment de protocollen van de fabrikant voor resuspensie of gebruik deze eenvoudige handleiding om een DNA-voorraad aan te maken.

  1. Centrifugeer de buis (300 x g gedurende 5 s) om de DNA-pellet aan de onderkant te verzamelen.
  2. Voeg dubbel gedestilleerd water (ddH2O) toe om een eindconcentratie van 10 ng/μL DNA-sjabloon te maken.
  3. Vortex de oplossing op een gemiddelde stand voor 5-10 s.
  4. Los de gehele pellet op door gedurende 20 minuten te incuberen bij 50 °C.
  5. Korte vortex weer
  6. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 s om de oplossing op de bodem van de buis te verzamelen.
  7. Bewaren bij -20 °C of gebruiken in PCR.
  8. Bereid een primervoorraad van 100 μM door de primers opnieuw te suspenderen in nucleasevrij water. Om de hoeveelheid toe te voegen water te bepalen, vermenigvuldigt u het aantal nanomol gelyofiliseerde primer met 10. Als de buis bijvoorbeeld 45 nM gelyofiliseerde primer bevat, voegt u 450 μL ddH2O toe en vortex de oplossing.
  9. Bewaar de primer stock oplossingen bij -20 °C of blijf de versterking uitvoeren.

3. Versterking van het genfragment via PCR

OPMERKING: Bepaal welke PCR-kit geschikt is voor het gen van belang. Kleinere genen (<1.000 kb) kunnen meer vatbaar zijn voor een goedkoper Taq-polymerase, terwijl grotere genen (≥1.000 kb) kunnen profiteren van high fidelity polymerase om fouten te verminderen. Het is belangrijk op te merken dat deze initiële PCR-amplificatie niet nodig is als de gebruiker zich niet bezighoudt met het behoud van het initiële genfragment (het biedt meerdere pogingen tot circularisatie en maakt vergelijkende studies van LET versus RCA-product mogelijk). Het is ook belangrijk op te merken dat deze PCR-versterkte LET direct in reacties kan worden gebruikt; zoals vermeld in de inleiding, zou het echter slechts een beperkt aantal reacties toestaan als de verdere versterkingsstappen buiten beschouwing werden gelaten. Spijsvertering en ligatie kunnen direct op het geresuspendeerde genfragment worden uitgevoerd57 (als men zeker is, hebben ze niet meer LET nodig om extra circularisatievoorraden uit te voeren). Als dit het geval is, slaat u sectie 3 over en gaat u verder naar sectie 4. Volg deze stappen om PCR uit te voeren.

  1. Gebruik de 100 μM-voorraden uit stap 2.8 om 10 μM-werkoplossingen te creëren. Veel PCR-kitprotocollen vragen om 10 μM-oplossingen van primers.
  2. Programmeer de thermische cycler om de reactie uit te voeren volgens de protocollen van de fabrikant van de kit. Verschillende kits vragen om enigszins gevarieerde fietsparameters. Voor de kit die in de tabel met materialenwordt vermeld, zijn de voorwaarden 94 °C voor 30 s initiële denaturatie; 30 cycli van 94 °C voor 30 s denatureren, 45 °C voor 30 s gloeien en 68 °C voor 60 s verlenging; met een laatste verlenging bij 68 °C gedurende 5 minuten; en ten slotte een onbeperkte blokkering van 10 °C.
    1. Zorg ervoor dat u de juiste verlengingstijd selecteert (variabel afhankelijk van de lengte van het te versterken gen). Heb een verlengingstijd van 1 min voor elke 1.000 bp.
    2. Zorg ervoor dat u de juiste gloeitemperatuur voor de primers invoert. Gebruik een online Tm-calculator die zowel primers als ingangen gebruikt om de beste gloeitemperatuur te bepalen58. Een gloeitemperatuur van 45 °C is voldoende bij gebruik van M13 primers.
    3. Raadpleeg bij het bepalen van het aantal cycli het protocol van de fabrikant, maar 30 cycli zullen meestal resulteren in voldoende versterking.
  3. Bij het uitvoeren van PCR, ontdooi en vortex de dNTPs. Gebruik de PCR-buffer in de kit.
  4. Combineer in één PCR-buis alle kitcomponenten zoals aangegeven in het protocol van de fabrikant. Voeg voor een succesvolle amplificatie 1 μL geresuspendeerde DNA-voorraad toe (stap 2.6).
  5. Homogeniseer het mengsel voorzichtig door vortexing op medium stand voor 5-10 s. U kunt ook de helft van het volume 10-20 keer op en neer pipetten om te vortexen.
  6. Voer de PCR-reactie uit.
  7. Als het PCR-protocol geen laatste koelstap bevat, laat de reactie dan 5 minuten afkoelen bij 10 °C voordat u deze verwijdert om condensatie naar de bodem van de buis te drijven.
  8. Zuiver de reactie met behulp van een PCR-opruimkit volgens de instructies van de leverancier.
    1. Voeg in een buis van 1,5 ml DNA-bindingsbuffer en PCR-monster toe in een verhouding van respectievelijk 5: 1.
    2. Breng dit mengsel over in de centrifuge en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 1 min. Gooi de doorstroming weg.
    3. Voeg 200 μL DNA-wasbuffer toe aan de kolom en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    4. Centrifugeer gedurende 1 min bij 16.000 x g en gooi de doorstroming weg.
    5. Herhaal stap 2.8.3 en 2.8.4 zonder de incubatiestap van 1 minuut.
    6. Centrifugeer nog eens 1-2 minuten bij 16.000 x g om de resterende buffer te verwijderen.
    7. Eluteer het DNA in 46 μL ddH2O.
  9. Kwantificeer het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer.
  10. Bewaar het gezuiverde DNA bij -20 °C of ga verder met de volgende stap.

4. Vertering en circularisatie

OPMERKING: Verdere versterking kan worden bereikt door het DNA te circulariseren, gevolgd door RCA. Verteer het DNA om het sjabloon voor circularisatie voor te bereiden. Dit verwijdert de primersequenties en creëert kleverige uiteinden aan zowel de 5 '- als 3'-uiteinden van de sjabloon. Bevestig deze uiteinden opnieuw via een ligatiereactie.

  1. Combineer in een PCR-buis 5 μL van de benodigde buffer, 20 U HindIII en 45 μL van het gezuiverde DNA uit stap 3.8.
  2. Homogeneer dit mengsel voorzichtig met een pipet.
  3. Incubeer het mengsel in een thermische cycler gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  4. Inactiveer HindIII door gedurende 20 minuten bij 80 °C te incuberen.
  5. Laat de reactie afkoelen tot 10 °C voordat u deze verwijdert om condensatie naar de bodem van de buis te drijven.
  6. Voeg 5 μL T4 ligasebuffer en 800 U T4 ligase toe aan het nieuw verteerde DNA.
    1. Gebruik T7 ligase, indien gewenst.
  7. Homogeneer dit mengsel voorzichtig met een pipet.
  8. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 25 °C om de circularisatiereactie uit te voeren.
  9. Zuiver de reactie met behulp van een PCR-opruimkit volgens de instructies van de leverancier. Gebruik hetzelfde protocol als in stap 3.8.
  10. Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer. De verwachte waarden zijn ~20 ng/μL.
  11. Bewaren bij -20 °C of doorgaan naar de volgende stap.

5. Isotherme rollende cirkelversterking

OPMERKING: De Rolling circle amplification (RCA) kan worden uitgevoerd met behulp van een commerciële kit of met individueel aangeschafte componenten. Het volgen van het protocol van de fabrikant zorgt voor een succesvolle versterking. Kits bevatten meestal een monsterbuffer, reactiebuffer en strengverdringend polymerase, zoals φ29-polymerase. Meerdere reactiebuizen kunnen worden gecombineerd om een grote hoeveelheid DNA te produceren voor celvrije expressie (4 μg van 20 pg uitgangsmateriaal). Het volgende protocol werkt efficiënt.

  1. Combineer in een enkele buis 20 μL van de monsterbuffer, 20 μL van de reactiebuffer, 0,8 μL van het enzym en 1 μL van de circulaire expressiesjabloon (CET) uit stap 4.9.
    OPMERKING: Dit heeft een totale DNA-massa van ~ 20 ng, maar RCA kan werken met picogramhoeveelheden, waardoor de verdunning van de CET en extreme enzymatische amplificatie mogelijk is als er een aanzienlijke behoefte is aan materiaal in de screening met hoge doorvoer.
  2. Homogeniseer het mengsel met een pipet en aliquot 10 μL van het mengsel in vier afzonderlijke buizen.
  3. Incubeer bij 30 °C gedurende 4-18 uur.
  4. Inactiveer het enzym door gedurende 10 minuten bij 65 °C te incuberen. Verlaag de temperatuur gedurende 5 minuten tot 12 °C om condensatie aan de onderkant van de buis te stimuleren.
    OPMERKING: Het is het gemakkelijkst om alle temperatuurstappen te combineren in een geautomatiseerd protocol op een thermische cycler.
  5. Verdun de resulterende oplossing door aan elke buis 15 μL ddH2O toe te voegen.
  6. Combineer alle buisjes en voeg direct toe aan een celvrije reactie.
  7. Gebruik indien gewenst een PCR-opruimkit om het product te zuiveren en eluteer het in 36 μL ddH2O om te kwantificeren. Zorg ervoor dat de sjabloonconcentratie ~100 ng/μL is.

6. Celvrije reactie

OPMERKING: Voer celvrije expressie uit door energiebuffer, extract en RCA-sjabloon te combineren. Een typische celvrije reactie met behulp van de PANOx-SP energiebuffer bestaat uit 1,2 mM ATP, 0,85 mM elk van GMP, UMP en CMP, 30 mM fosfoenolpyruvaat, 130 mM kaliumglutamaat, 10 mM ammoniumglutamaat, 12 mM magnesiumglutamaat, 1,5 mM spermidine, 1 mM putrescine, 34 μg/ml folinezuur, 171 μg/ml E. coli tRNA-mengsel, 2 mM elk van 20 ongelabelde aminozuren, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Co-enzym A (CoA), 4 mM kaliumoxalaat, 57 mM HEPES-KOH buffer (pH 7,5), 0,24% volume van het E. coli-extract en variabele hoeveelheden DNA23,49. Het reactievolume kan variëren, maar 15 μL reacties kunnen besparen op reagensgebruik en zijn klein genoeg voor gebruik in een 384 zwartwandige microplaat49,50.

  1. Als u een fluorescerend eiwit zoals sfGFP tot expressie brengt, bereidt u een plaatlezer voor om te lezen bij de gewenste excitatie / emissie, temperatuur en agitatie.
  2. Als u een plaat met 384 putten gebruikt, steekt u 60 μL H2O in de putten die grenzen aan een lege monsterput om de luchtvochtigheid te handhaven en het randeffect te verminderen.
  3. Voeg de verschillende benodigde componenten toe aan een buis voor elk monster. Voeg voldoende toe om drievoud uit te voeren. Replicaties in de plaat kunnen helpen bij het identificeren van oorzaken van variabiliteit.
    1. Voeg het extract, de energiebuffer en vervolgens het DNA toe.
    2. Verdun tot het uiteindelijke gewenste volume met ddH2O.
  4. Meng deze oplossing grondig door de helft van het oplossingsvolume 10-20 keer op en neer te pipetteren.
  5. Breng het reactiemengsel in 15 μL aliquots over in de gewenste putjes in de microtiterplaat.
  6. Sluit de plaat af met een kleurloze afdichtingsfolie om de luchtvochtigheid te behouden en verdamping te voorkomen.
  7. Plaats de verzegelde plaat in de plaatlezer en laat de reactie voltooien.
    1. Als u een eiwit tot expressie brengt dat niet live kan worden gecontroleerd, gebruikt u een ander temperatuurgeregeld apparaat zoals een thermoblok om de plaat te incuberen.

7. Subtilisine assay

OPMERKING: Als u het subtilisine BPN'-gen (SBT(n)) tot expressie brengt in aanvullende sequentie #2,volg dan dit protocol om de activiteit te testen.

  1. Bereid een 10 μM stamoplossing van N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide in dimethylformamide (DMF).
  2. Stel een plaatlezer in om de absorptie te meten bij 410 nm om de 20 s gedurende 10 minuten met behoud van een temperatuur van 25 °C.
  3. In een vlakke bodem, kleurloze 96-well plaat, aliquot 94 μL ddH2O en 1 μL N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide uit stap 7.1.
  4. Voeg 5 μL van de voltooide celvrije reactie uit stap 6.7 toe en lees af met behulp van een plaatlezer die is ingesteld op het protocol dat is beschreven in stap 7.2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expressie van sfGFP uit RCA-sjablonen was vergelijkbaar met die van het pJL1-plasmide bij gebruik van slechts 0,30 μL ongezuiverd RCA-DNA in een reactie van 15 μL(figuur 2A). In feite lijkt het verdubbelen en verdrievoudigen van de hoeveelheid sjabloon geen voordeel te bieden in BL21 DE3 Star-extract, wat suggereert dat de sjabloon al verzadigd is met 0,30 μL per reactie. Omgekeerd lijkt er een voordeel te zijn aan het verhogen van de hoeveelheid RCA-sjabloon wanneer deze wordt toegevoegd aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gen van belang kan elk gewenst eiwit zijn, maar het is het beste om te beginnen met een fluorescerend eiwit als een handige verslaggever voor real-time of eindpuntuitlezing op een putplaatlezer voor nieuwe gebruikers van deze methode. Voor nieuwe eiwitsequenties kopieert u de aminozuursequentie van het gewenste eiwit en plakt u deze in de gewenste codonoptimalisatietool61,62. Er zijn meestal veel beschikbare organismen en stammen van E. coli in de co...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nigel Reuel is lid van de wetenschappelijke adviesraad van BigHat Biosciences Inc., een bedrijf dat celvrije systemen gebruikt voor het ontwerp van antilichamen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen NIH 1R35GM138265-01 en NSF 2029532 voor gedeeltelijke ondersteuning van dit project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SVoorzien van HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Gebazig voor het zuiveren van DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SVoorzien van T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Gebazig voor RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978(2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772(2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173(2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079(2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33(2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790(2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24(2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762(2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
  56. IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279(2020).
  58. New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062(2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882(2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celvrije expressieRolling Circle Amplificatieminimaal DNA sjabloonPCR amplificatieDNA circularisatiehigh throughput screeningsynthetische genfragmentenworkflow voor eiwitexpressieenzymatische DNA amplificatie

Gerelateerde artikelen