Methodenartikel

Een fluorescentietest voor het evalueren van de permeabiliteit van een cardiale microvasculaire endotheliale barrière in een rattenmodel van ischemie/reperfusie

DOI:

10.3791/62746

⸱

30 juni 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode om de endotheelbarrière van cardiale microvaten na ischemie/reperfusieschade functioneel te beoordelen via de meting van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van geëxtravaseerd 70.000 Da FITC-dextran in vergelijking met Evans Blue.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Revascularisatietherapieën voor schuldige slagaders, ongeacht percutane coronaire interventie en coronaire bypasstransplantatie, worden beschouwd als de beste strategie om de klinische prognose van patiënten met acuut coronair syndroom (ACS) te verbeteren. Desalniettemin kan myocardiale reperfusie na effectieve revascularisatie leiden tot aanzienlijke sterfte van cardiomyocyten en coronaire endotheliale collaps, bekend als myocardiale ischemie/reperfusieschade (MIRI). Gewoonlijk behouden endotheelcellen en hun intercellulaire tight junctions samen de microvasculaire endotheelbarrière en de relatief lage permeabiliteit, maar falen ze in reperfusiegebieden.

Microvasculaire endotheliale hyperpermeabiliteit geïnduceerd door ischemie/reperfusie (IR) draagt bij aan myocardiaal oedeem, verhoogde infiltratie van pro-inflammatoire cellen en verergerde intramyocardiale bloeding, wat de prognose van ACS kan verslechteren. De tracer die in deze studie is gebruikt - 70.000 Da FITC-dextran, een vertakt glucosemolecuul gelabeld door fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) - lijkt te groot om onder normale omstandigheden in het cardiale microvasculaire endotheel te infiltreren. Het is echter in staat om na MIRI een gebroken barrière te infiltreren. Dus hoe hoger de endotheliale permeabiliteit is, hoe meer FITC-dextran zich ophoopt in de extravasculaire intercellulaire ruimte. De intensiteit van de fluorescentie van FITC kan dus de permeabiliteit van de microvasculaire endotheliale barrière aangeven. Dit protocol maakt gebruik van FITC-dextran om de cardiale microvasculaire endotheliale barrière functioneel te evalueren, wat wordt gedetecteerd door een geautomatiseerd kwantitatief pathologiebeeldvormingssysteem.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het feit dat een toenemend aantal patiënten met coronaire hartziekten al tientallen jaren baat heeft bij revascularisatietherapieën, doet niets af aan de fatale gevolgen van MIRI. Zoals beschreven door Yellon en Hausenloy, kan ongeveer 30% van de uiteindelijke infarctgrootte worden toegeschreven aan MIRI1. Cardiale microvasculaire endotheliale disfunctie is het kernmechanisme dat ten grondslag ligt aan MIRI en het "no-reflow"-fenomeen en is het doelwit van veel cardioprotectieve middelen en klassieke cardioprotectieve routes2. Bovendien kan endotheliale hyperpermeabiliteit van microvaten myocardiaal oedeemveroorzaken 3 en de overmatige infiltratie van pro-inflammatoire cellen, waaronder neutrofielen4, macrofagen en ertrocyten5.

MIRI-geïnduceerde oxidatieve stress en pro-inflammatoire cytokinen met overexpressie, zoals de leden van de tumornecrosefactorfamilie6 en de interleukinefamilie7, activeren signaalroutes van celapoptose om de dood van ischemisch myocardium te versnellen. Erytrocyten dringen de kwetsbare endotheelbarrière binnen en hopen zich op in de extracellulaire matrix (ECM) om intramyocardiaal hematoomte vormen 8. Van macrofagen en neutrofielen afgeleide matrixmetalloproteïnasen ontmantelen collageen in de ECM, wat het risico op mechanische complicaties en ventriculair aneurysma na een infarct verhoogt9. De permeabiliteit van de endotheelbarrière is dus een cruciaal teken voor de prognostische evaluatie van een acuut myocardinfarct en markeert tot op zekere hoogte de ernst van MIRI.

FITC-dextran is een reeks polysachariden die bestaat uit verschillende lengtes vertakte glucosemoleculen met een molecuulgewicht variërend van 4.000 Da tot 70.000 Da. Het wordt veel gebruikt als de standaardtracer om de permeabiliteit van celmembranen, functionele fysiologische barrières zoals de bloed-hersenbarrière10 en slijmvliezen11 aan te tonen onder specifieke behandelingen en pathologische omstandigheden. De permeabiliteit van een specifiek membraan varieert voor verschillende stoffen, afhankelijk van hun molecuulgewicht. Gewoonlijk is albumine beperkt tot hartmicrovaten; het kan echter in het vroege stadium van IR het endotheel binnendringen, waardoor myocardiaal oedeem ontstaat. Aangezien het molecuulgewicht van albumine ongeveer 68.000 Da is, zou 70.000 Da FITC-dextran een geschikt middel zijn om endotheliale hyperpermeabiliteit na IR aan te tonen. Bovendien wordt dextran op grote schaal gebruikt om het bloedvolume en de colloïde osmotische druk van shockpatiënten op peil te houden, en worden FITC-gelabelde tracers gebruikt in tal van in vivo of in vitro onderzoeken met weinig nadelige effecten.

Naast FITC-dextran is de endotheelpermeabiliteit gemeten met Evans Blue (EB)-kleuring. Na injectie in de bloedsomloop bindt EB zich stevig aan serumalbumine en vormt een complex12. Dit EB-albuminecomplex, en niet alleen EB, kan dus worden gebruikt voor het meten van de permeabiliteit, wat betekent dat de nauwkeurigheid van een dergelijke op EB gebaseerde methode kan worden beïnvloed door verschillende concentraties serumalbumine bij proefpersonen. Bovendien is gemeld dat EB de organen van proefdieren vergiftigt, met name het hart, de lever en de longen, via cellulaire degeneratie en verhoogde vasculaire permeabiliteit13. Endotheel dat ischemie/reperfusie ondergaat, zou gevoeliger zijn voor dergelijke schadelijke effecten dan normaal endotheel, wat het belang van experimentele resultaten kan verwarren.

Vergeleken met EB-kleurstof is FITC-dextran exogeen en is de bindingsaffiniteit met albumine verwaarloosbaar. FITC-dextran blijft dus in de vrije toestand en wordt niet gebonden door macromoleculen, zoals albumine en weefseleiwitten. Indien FITC-dextran wordt toegediend op basis van het lichaamsgewicht, kan het dus werken bij een gelijke bloedconcentratie en wordt het niet beïnvloed door individuele verschillen in serumalbumineconcentratie en bloedvolume. Tongxinluo (TXL), een traditioneel Chinees medicijn, werd gebruikt om de diagnostische gevoeligheid van deze methode te testen. TXL vermindert MIRI door de endotheliale cellulaire ultrastructuur en de integriteit van de endotheliale barrière te behouden14. TXL wordt ook gebruikt om angina pectoris te genezen en myocardiale no-reflow na een infarct klinisch te verbeteren15. Het bevat Radix ginseng, Buthus martensi, Hirudo, Eupolyphaga seu steleophaga, Scolopendra subspinipes, Periostracum cicadae, Radix paeoniae rubra, Semen ziziphi spinosae, Lignum dalbergiae odoriferae, Lignum santali albi en Borneolum syntheticum. Van TXL is aangetoond dat het het microvasculaire endotheel beschermt via de MEK/ERK-route16 en endotheliale stikstofmonoxidesynthase-gemedieerde mechanismen 5,17 en ischemie/reperfusieschade (IRI) van organen18, vooral het hart, op een dosisafhankelijke manier verlicht. Hier werden ratten gevoed met 0,5 g/kg TXL-poeder (een equivalente dosis die klinisch bij mensen wordt gebruikt) zoals beschreven19. Dit artikel biedt een methode om de endotheelbarrière van cardiale microvaten na IR functioneel te beoordelen via de meting van de totale fluorescentie-intensiteit van geëxtravaseerd 70.000 Da FITC-dextran in vergelijking met EB.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", uitgegeven door de Amerikaanse National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA, NIH Publication No. 85-23, herzien in 1996) en de "Regulation to the Care and Use of Experimental Animals" van de Beijing Council on Animal Care (1996). Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de Care of Experimental Animals Committee van het Fuwai Hospital. Mannelijke SPF-klasse Sprague-Dawley-ratten (SD-ratten) met een gewicht van 150-180 g werden in deze studie gebruikt.

1. Bereiding van reagentia, materialen en apparatuur

  1. Bereid reagentia en oplossingen, waaronder 70% ethanol, FITC-dextran (70.000 Da, opgelost in ijskoude zoutoplossing om 10% w/v-oplossing voor gebruik te maken), ontharingscrème, montagemedium met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 0,5-10 μg/ml), 1% w/v EB/zoutoplossing en 5% w/v pentobarbital-natrium/zoutoplossing (bewaard bij 4 °C in het donker).
  2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten en materialen van tevoren, inclusief chirurgische tape; gaasjes; chirurgische handschoenen; 16 G endotracheale tube; insulinespuit; een werkende schaar; grote, gebogen ontleedtang; rechte ontleedtang; rechte muggentang; gebogen muggentang; oprolmechanismen (30 mm spreiding); 5 cm micronaald houders; 3-0 polypropyleen hechtdraad (taps toelopende naald); en 6-0 polypropyleen hechtdraad (ronde naald).
  3. Controleer en zorg ervoor dat alle apparatuur, inclusief het systeem voor constante temperatuuropwarming, het verlichtingssysteem, de ventilator, het geautomatiseerde kwantitatieve pathologiebeeldvormingssysteem en de ultraviolette vriessnijmachine, in goede staat verkeren.

2. De ratten voorbereiden op de chirurgische ingrepen

  1. Verdeel alle SD-ratten willekeurig in Sham-groep, IR-groep en TXL-groep (IR+TXL-groep).
    OPMERKING: In dit protocol werden zes ratten willekeurig toegewezen aan elke groep, n=6.
  2. Weeg elke SD-rat, noteer het gewicht en bereken de dosis TXL die voor elke rat moet worden toegediend.
  3. Dien ibuprofen in een dosis van 30 mg/kg via een maagsonde toe aan elke rat ten minste 12 uur voorafgaand aan de thoracotomie om preoperatieve pijn en angst te verlichten.
  4. Dien een superfijn poeder TXL in een dosis van 0,5 g/kg via een maagsonde 12 uur en 1 uur toe aan elke SD-rat in de IR+TXL-groep vóór verdoving, zoals beschreven19.
  5. Desinfecteer de operatietafel met 70% ethanol en plaats de gesteriliseerde chirurgische instrumenten en materialen op het gedesinfecteerde oppervlak.
  6. Pas de temperatuur van het verwarmingssysteem met constante temperatuur aan om de lichaamstemperatuur van de ratten op 37 ± 1 °C te houden.

3. Stel een rattenmodel op voor cardiale ischemie/reperfusie

  1. Injecteer 5% w/v pentobarbital natrium/fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een dosis van 50 mg/kg (0,1 ml/100 g lichaamsgewicht) in de buikholte om de rat te verdoven. Bereid de operatieplaats voor door de vacht voorzichtig van de nek naar de borst te verwijderen door te scheren of een ontharingscrème te gebruiken.
  2. Pas de positie van de tong indien nodig voorzichtig aan met een gesteriliseerd pincet en veeg de respiratoire secretie af met gesteriliseerde wattenbolletjes. Houd de glottis duidelijk in het zicht en breng voorzichtig een endotracheale tube in de luchtpijp.
  3. Sluit de endotracheale tube aan op een beademingsapparaat dat met 65-80 ademhalingen per minuut rondcirkelt en pas het ademvolume aan op 4-5 ml door het hoofd en de ledematen van de rat vast te zetten.
  4. Leg een steriel laken over de rat, desinfecteer het operatiegebied met jodiumtinctuur gevolgd door 70% ethanol en herhaal deze procedure drie keer.
  5. Maak een linker parasternale incisie ter hoogte van de vierde intercostale ruimte om de linker musculus pectoralis major en pectoralis minor bloot te leggen.
  6. Ontleed de fascia tussen de musculus pectoralis major en pectoralis minor met behulp van een stompe dissectietechniek om de linker vierde intercostale ruimte bloot te leggen.
    OPMERKING: Vermijd overmatige weefselbeschadiging en vaatletsel dat ernstige bloedingen en postoperatieve dood kan veroorzaken.
  7. Ontleed de intercostale spieren, plaats een borstretractor in de vierde intercostale ruimte en spreid vervolgens de ribben.
  8. Scheur het hartzakje en verwijder het aangehechte vetweefsel.
    OPMERKING: Vermijd beschadiging van andere organen met scherpe chirurgische instrumenten, vooral de longen. Schade aan de longen kan leiden tot de ontwikkeling van pneumothorax en hemopneumothorax tijdens de operatie, met gevolgen voor de caco-ethiek, variërend van hemodynamische stoornissen tot verminderde overleving van dieren.
  9. Manipuleer de positie van de thymus en leg de opgaande aorta en de linker boezems voorzichtig bloot. Identificeer en ligate de proximale linker voorste dalende (LAD) slagader tijdelijk gedurende 45 minuten met een 6-0 polypropyleen hechtdraad (zie figuur 1 A-D).
    OPMERKING: Deze procedure is identiek voor schijncontroleratten, behalve dat de LAD niet is geligeerd.
  10. Verwijder het borstretractor en trek de ribben samen in een onderbroken hechtpatroon met een 3-0 polypropyleen hechtdraad.
  11. Herstel de negatieve intrathoracale druk om een effectieve ademhaling te garanderen.
    OPMERKING: Er kunnen twee methoden worden gebruikt om de negatieve intrathoracale druk te herstellen: i) voordat de borstholte wordt gesloten, kunnen onderzoekers de luchtuitlaat van de ventilator gedurende 2 cycli afsluiten om de longen op te blazen. ii) De lucht die in de borstholte achterblijft, kan met een spuit worden weggezogen nadat de intercostale ruimte is gesloten.
  12. Maak na het ontharen en desinfecteren een incisie in de rechter onderste ledematen en ontleed de oppervlakkige fascia van de rechter dijbeenader.
  13. Maak de ligatie los en controleer de ademhalings- en bloedsomloopomstandigheden na het induceren van myocardischemie gedurende 45 minuten.
  14. Injecteer 10% (m/v) FITC-dextran/zoutoplossing in de dijbeenader in een dosis van 0,15 ml/100 g lichaamsgewicht en druk gedurende 1 minuut met steriele wattenbolletjes op de dijbeenader om het bloeden te stelpen (Figuur 2A,B).
    OPMERKING: Als alternatief kunt u 1% w/v EB/zoutoplossing in de dijbeenader injecteren in een dosis van 0,5 ml/100 g lichaamsgewicht.
  15. Naai de incisies dicht met een 3-0 polypropyleen hechtdraad en desinfecteer de incisies, gevolgd door postoperatieve analgesie met ibuprofen, zoals hierboven beschreven.

4. Voorbereiding van bevroren weefselschijfjes voor fluorescentiemeting

  1. Injecteer 5% w/v pentobarbital-natrium/PBS-oplossing in een dosis van 150 mg/kg (0,3 ml/100 g lichaamsgewicht) intraperitoneaal om de ratten diep te verdoven na 3 uur myocardiale reperfusie.
  2. Snijd de buikholte door en leg de aorta abdominalis en vena cava bloot (zie figuur 3A).
  3. Injecteer gestaag 50 ml ijskoude PBS in de vena cava, snijd de aorta abdominalis door om het bloed uit het myocardium te spoelen en oogst het hart.
    OPMERKING: Observeer veranderingen in de longen en lever. Een zwetende lever suggereert dat zoutoplossing nauwkeurig in de vena cava wordt geïnjecteerd (zie in figuur 3C), en een bleke long wordt beschouwd als een teken van een goed doorbloed myocardium (zie in figuur 3B).
  4. Spoel het hart in een donkere kamer voorzichtig af met ijskoude zoutoplossing of PBS om eventueel achtergebleven bloed en FITC-dextran (of EB) uit de kamers van het hart te verwijderen.
  5. Snijd het hart af van de ligatie en gooi het myocardium boven de ligatie weg.
  6. Veranker het hart in mallen met inbeddingsmassa, gevolgd door opslag bij -80 °C.
  7. Laad de bevroren tissues uit de inbeddingsmallen en laad ze op monsterhouders in een voorgekoelde -20 °C kamer van een vriessnijmachine.
  8. Pas de dikte van een enkele plak aan op 5-8 μm en snijd het weefsel ongeveer in het midden van de bas-apex-as (bijv. het midden van de ischemie).
  9. Laad het gesneden weefsel op zelfklevende microscoopglaasjes en sluit elk plakje af met één druppel (ongeveer 40 μL) fluorescerend montagemedium dat DAPI bevat.
  10. Bewaar de dia's in een droge en donkere doos.
    OPMERKING: Als de objectglaasjes niet onmiddellijk kunnen worden gescand, bewaar ze dan op een droge, koele en donkere plaats om de vorming van condenswater en fluorescentie-afschrikking te voorkomen.

5. Fluorescentiemeting en gegevensanalyse

  1. Stel het beeldvormingssysteem in en controleer de software die op de scanner is aangesloten.
  2. Plaats de dia's in de diaplanken en plaats ze in de scanner.
  3. Open de diascannersoftware (zie de materiaaltabel) en stel een nieuw belichtingsprotocol in door te klikken op Protocol bewerken | Nieuw....
    OPMERKING: Als de scanner of de bijbehorende software niet beschikbaar is, kan een confocale lasermicroscoop (zie de materiaaltabel) of andere gewone diascanners met de fluorescentiemodus (zie de materiaaltabel) een alternatief zijn voor de geautomatiseerde kwantitatieve fluorescentiescanner.
  4. Wijzig de naam van het protocol en het onderzoek en selecteer de fluorescentiemodus .
  5. Hele diascan definiëren | Pixelresolutie en multispectrale gebieden | Pixelresolutie als respectievelijk 0,25 μm (40x).
  6. Klik op Filters en banden bewerken... om de kolom Filters voor hele diascan en de kolom Multispectrale regiobanden te selecteren.
    OPMERKING: Als EB wordt gebruikt, selecteert u Filters voor hele dia's | DAPI en Texas Rood of AF495. Als FITC-dextran wordt gebruikt, selecteert u Multispectrale regiobanden | DAPI en FITC of AF488.
  7. Klik op Belichtingen bewerken... en laad de drager.
  8. Selecteer het doelslot en klik op Overzicht nemen.
    OPMERKING: Hiermee wordt een helderveldscan van elk hartgedeelte gemaakt. Selecteer het myocardium om scherp te stellen of selecteer het gebied blindelings.
  9. Selecteer de doeldia, stel de stagehoogte in op ongeveer -50 μm en klik op Autofocus.
  10. Klik op Hele scan Belichting(ms)-DAPI | Automatisch blootstellen.
    OPMERKING: De belichtingstijd van DAPI voor elk glaasje hoeft niet hetzelfde te zijn, omdat afbeeldingen met DAPI worden gebruikt om dwarsdoorsneden van het hart te illustreren, wat handig is om het gebied van het myocardium te schetsen, maar niet om de fluorescentiedichtheid te berekenen.
  11. Klik op Hele scan Belichting(ms)-FITC | Automatisch blootstellen.
    OPMERKING: Klik op Hele scan Belichting(ms)-Texas Rood | Autoexpose bij gebruik van EB. Het is belangrijk om te onthouden en ervoor te zorgen dat de belichtingstijd van FITC of Texas Red in alle diascans hetzelfde is.
  12. Klik nogmaals op Autofocus en zorg ervoor dat de dia scherp is.
  13. Klik op Terug en sla het protocol op.
  14. Herhaal stap 5.7-5.14 voor elke dia.
  15. Keer terug naar de startpagina en klik op Dia's scannen.
  16. Selecteer een sleuf, wijzig de naam van alle dia's en selecteer het bijbehorende belichtingsprotocol voor elke dia.
  17. Scan de dia's en leg de afbeeldingen vast.
  18. Open de afbeeldingen met diaviewer software voor de scans (zie de Materiaaltabel).
  19. Vergroot alle afbeeldingen in relatief gelijke mate.
  20. Maak een momentopname en sla afbeeldingen op als .tiff.
    OPMERKING: Het is beter om de afbeeldingen met en zonder schaalbalken tegelijkertijd op te slaan. Afbeeldingen met schaalbalken kunnen worden gebruikt voor publicatie, terwijl afbeeldingen zonder schaalbalken kunnen worden gebruikt voor statistische analyse.
  21. Open de ImageJ-software, klik op Analyseren en selecteer Meting instellen.
  22. Selecteer gebied | Geïntegreerde dichtheid.
  23. Open de afbeelding in het FITC-kanaal met afbeelding J.
  24. Klik nogmaals op Analyseren en noteer de numerieke waarde van geïntegreerde dichtheid (IntDen) die verschijnt.
    OPMERKING: Aangezien schaalbalken in de afbeeldingen door computers kunnen worden aangezien voor grijstinten van fluorescentie, gebruikt u afbeeldingen zonder schaalbalken om IntDen te meten.
  25. Sluit de FITC-afbeelding en open de afbeelding in het DAPI-kanaal.
  26. Schets een dwarsdoorsnede van het myocardium.
  27. Klik op Gebiedsgegevens analyseren en verzamelen.
  28. Bereken de verhoudingen van IntDen/Area (gemiddelde van fluorescentie) voor elk hart.
  29. Voer alle verhoudingen in in statistische analysesoftware.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alvorens de FITC-dextran-test uit te voeren om de veranderingen in cardiale endotheliale permeabiliteit na IR te evalueren, raden we ten zeerste aan om experimenten uit te voeren door dezelfde onderzoeker die gespecialiseerd is in het opstellen van een myocardiaal IR-model bij ratten om te bevestigen dat de kransslagaders met succes in dezelfde positie zijn afgesloten, en de verhoudingen van ischemisch gebied/totale gebied zijn constant bij alle ratten. Zoals te zien is in figuur 1A,B, werd het hart (aangegeven met een gele pijl) blootgelegd en werd een lus (aangegeven met een groene pijl) gevormd in het myocardium in de voorwand van de linker hartkamer, ongeveer 2 mm onder de rand van het linker atriumaanhangsel met een capillaire siliconenbuis van 0,5 mm (binnendiameter) en 6-0 hechtdraad. Zoals te zien is in figuur 1C, veranderde het ischemische myocardium onmiddellijk van roze naar grijsroze (aangegeven door de witte pijl).

Bovendien hererfde het myocardium en herstelde het zijn roze kleur onmiddellijk nadat de lus was losgemaakt, zoals geïllustreerd in figuur 1D. Na het losmaken van de lus werd een incisie gemaakt evenwijdig aan de lange as van het dijbeen aan de binnenkant van de dij. De dijbeenader werd blootgelegd en doorboord met een insulinespuit, zoals weergegeven in figuur 2A,B. Na een reperfusie van 3 uur werd een "V"-incisie gemaakt in de onderbuik en werden de aorta abdominalis en vena cava uit het peritoneum ontleed (Figuur 3A). Koude zoutoplossing werd voorzichtig in de vena cava geïnjecteerd en de aorta abdominalis werd doorgesneden om te voorkomen dat de ventriculaire wand te veel zou worden uitgerekt als gevolg van de intraventriculaire druk die de histopathologische structuur zou aantasten. Gebleekte longen (rode pijl in figuur 3B) en lever in figuur 3C geven aan dat het weefsel goed was hersteld met zoutoplossing.

Bijgevolg was er geen significant verschil in de dwarsdoorsnede tussen de drie groepen: 1,00 ± 0,08 in de Sham-groep versus 0,97 ± 0,08 in de IR-groep versus 1,02 ± 0,04 in de IR+TXL-groep (Figuur 4A, n = 6 in elke groep, p > 0,05 tussen twee groepen). Zoals te zien is in figuur 4B,C, was de gemiddelde intensiteit van groene fluorescentie in de hele secties van Sham-ratten extreem laag. Daarentegen nam de fluorescentie die werd uitgezonden door geëxtravaseerd FITC-dextran aanzienlijk toe in de IR-groep, genormaliseerd naar de Sham-groep (5,52 ± 0,85 in de IR-groep versus 1,00 ± 0,19 in de Sham-groep, n = 6, p < 0,05). Bovendien keerde TXL superfijn poeder, waarvan bekend is dat het het cardiale microvasculaire endotheelbeschermt 14,16, opmerkelijk de hogere fluorescentie-intensiteit geïnduceerd door IR om (2,87 ± 0,52 in de IR+TXL-groep vs. 5,52 ± 0,85 in de IR-groep, n = 6, p < 0,05). De beelden van het regionale myocardium gaven aan dat FITC-dextran zich overweldigend ophoopte in de extracellulaire matrix, maar niet in de microvaten, en dat TXL de endotheliale barrièrefunctie verbeterde (Figuur 5).

Vergeleken met FITC-dextran kan EB een suboptimaal alternatief zijn, omdat EB inferieur is aan 70.000 Da FITC-dextran in zowel beeldkwaliteit als gevoeligheid. Evenzo was er geen significant verschil in de dwarsdoorsnede tussen de drie groepen: 1,00 ± 0,08 in de Sham-groep versus 0,97 ± 0,08 in de IR-groep versus 0,98 ± 0,05 in de IR+TXL-groep (aanvullende figuur S1A, n = 6 in elke groep, p > 0,05 tussen twee groepen). Zoals te zien is in aanvullende figuur S1B,C, was de gemiddelde intensiteit van rode fluorescentie in hele doorsneden van schijnratten relatief hoger, vooral in het endocardium en epicardium. Hoewel de rode fluorescentie die door EB werd uitgezonden sterk toenam in de IR-groep (4,41 ± 0,66 in de IR-groep versus 1,00 ± 0,22 in de Sham-groep, n = 6, p < 0,05), was het verschil tussen de IR+TXL- en IR-groepen niet significant (3,73 ± 0,47 in de IR+TXL-groep versus 4,41 ± 0,66 in de IR-groep, n = 6, p = 0,0956).

Bovendien werd deze methode getest in een myocardinfarct (MI) model (Supplemental Figuur S2). In de Myocardiale Injection Injection first (MII) groep werd FITC-dextran-oplossing (in dezelfde concentratie als eerder vermeld) 5 minuten voor LAD-ligatie in de bloedsomloop geïnjecteerd. Dit in tegenstelling tot de FITC-dextran-oplossing die onmiddellijk na ligatie bij de MIL-ratten werd geïnjecteerd (Myocardiale Infarction Ligatie eerst) die eerder in dit protocol werd beschreven. Interessant is dat slechts lage hoeveelheden FITC-dextran werden geëxtraseerd in de ECM van het gewonde myocardium bij MI-ratten van beide groepen, aangegeven door een zwakke groene fluorescentie-intensiteit in aanvullende figuur S2.

figure-results-1
Figuur 1: Gezichtsveld van thoracotomie en vaststelling van ischemie/reperfusie in een rattenmodel. (A) Het blootleggen van het hart van de rat (aangegeven met een gele pijl); (B) het vormen van een lus om de kransslagader te omringen (aangegeven met een groene pijl); (C) het vastmaken van de lus en het induceren van myocardischemie gedurende 45 minuten (aangegeven met een witte pijl); (D) het losmaken van de lus en het toestaan van myocardiale reperfusie gedurende 3 uur (aangegeven door de blauwe pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Dissectie van de dijbeenader en intraveneuze injectie. (A) Het blootleggen van de dijbeenader (de dijbeenzenuw wordt aangegeven door de pijl aan de linkerkant; de dijbeenslagader wordt aangegeven door de pijl in het midden; de dijbeenader wordt aangegeven door de pijl aan de rechterkant). (B) Injectie van FITC-dextran oplossing in de dijbeenader met een insulinespuit. Afkorting: FITC = fluoresceïne isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Weefselperfusie en symptomen van efficiënte perfusie. (A) Ontleden van de abdominale aorta en de vena cava (de abdominale aorta wordt aangegeven door de witte pijl; de vena cava wordt aangegeven door de zwarte pijl). (B) Gebleekte longen zijn een symptoom van voldoende perfusie; (C) gebleekt slijmvlies, gebleekte nier en zwetende lever zijn allemaal symptomen van voldoende perfusie (rode pijl: slijmvlies; witte pijl: lever; zwarte pijl: nier). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve beelden en analyse van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit door FITC-dextran-kleuring. (A) Relatieve dwarsdoorsnede van elke groep genormaliseerd naar die van de Sham-groep (p > 0,05); (B) relatieve fluorescentie-intensiteit in het FITC-kanaal van elke groep, genormaliseerd naar die van de Sham-groep; (C) representatieve beelden met een vergroting van 9,5x in elke groep. Schaal balken = 800 μm. One-way ANOVA met Tukey's post-hoc vergelijkingen met meerdere groepen. * vs. Sham-groep, p < 0.05; # vs. IR-groep, p < 0,05. Staafdiagrammen tonen het groepsgemiddelde ± SD. Afkortingen: IR = ischemie/reperfusie; TXL = Tongxinluo; FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; ANOVA = variantieanalyse; SD = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve beelden van interessegebieden bij een vergroting van 200x van elke groep na FITC-dextran-kleuring. Schaal balken = 50 μm. Afkortingen: FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Representatieve beelden en analyse van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit door Evans Blue-kleuring. (A) Relatieve dwarsdoorsnede van elke groep genormaliseerd naar die van de Sham-groep (p > 0,05); (B) relatieve fluorescentie-intensiteit in het rode kanaal van Texas van elke groep, genormaliseerd naar die van de Sham-groep; (C) representatieve afbeeldingen in elke groep. One-way ANOVA met Tukey's post-hoc vergelijkingen met meerdere groepen. Schaalbalken = 800 μm. * vs. Sham-groep, p < 0,05. Staafdiagrammen tonen het groepsgemiddelde ± SD. Afkortingen: IR = ischemie/reperfusie; TXL = Tongxinluo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; ANOVA = variantieanalyse; SD = standaarddeviatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Representatieve beelden met een vergroting van 9,5x van FITC-dextran-kleuring in een myocardinfarctmodel. Schaal balken = 800 μm. Afkortingen: MII = myocardinfarct injectie eerst (FITC-dextran injecteren vóór myocardinfarct); MIL = myocardinfarct eerst afbinden (FITC-dextran onmiddellijk na een hartinfarct injecteren); FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol om de disfunctie van de cardiale endotheelbarrière te beoordelen na blootstelling aan MIRI. Opgemerkt moet worden dat er verschillende cruciale stappen in dit protocol zijn die de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de resultaten bepalen. Alle stappen met FITC-dextran moeten worden uitgevoerd in een donkere kamer. De FITC-dextranen/zoutoplossingen moeten bij 4 °C worden bewaard en met aluminiumfolie worden omwikkeld. Bovendien moeten kransslagaders worden afgebonden, zoals geïllustreerd in figuur 1, zodat het myocardium onmiddellijk kan worden hersteld nadat de lus is losgemaakt. Onderzoekers kunnen kiezen voor 5-0 of 6-0 polyethyleen hechtingen, omdat dunnere snaren onder 7-0 meer kans hebben om myocardiale vezels en bloedvaten te snijden. Belangrijk is dat de traceroplossing in de dijbeenaders moet worden geïnjecteerd en niet in de staartaders. Elk hart moet goed doorbloed zijn en goed gespoeld met ijskoude zoutoplossing voor en na respectievelijk het offeren.

Veel onderzoekers die gespecialiseerd zijn in MIRI zijn geneigd om de verstoorde subcellulaire structuur van het endotheel in het vroege stadium van myocardiale reperfusie te bestuderen - de vorming van apoptotische lichamen, zwellende mitochondriën en abnormale intercellulaire juncties - om de hyperpermeabiliteit van het endotheel te bewijzen via elektronenmicroscopisch onderzoek. Immunoblotting is ook gebruikt om de microvasculaire permeabiliteit te meten, omdat de afname van de niveaus van tight junction-eiwitten wordt beschouwd als het kernmechanisme van endotheelbeschadiging en storing van de endotheelbarrière in de loop van de tijd. VE-cadherine20 en β-catenine21 zijn bijvoorbeeld sleutelelementen van endotheelcel-tot-cel adhesieverbindingen, en deze verbindingen dragen bij aan het behoud van de vasculaire integriteit22. Tight junctions, zoals JAM-A23,24 en occludin25, nemen ook samen mee aan de constructie van de endotheliale barrière in de bloedsomloop.

Momenteel suggereren een toenemend aantal onderzoeken dat de mitochondriale functie en mitochondriale homeostase belangrijke doelen kunnen zijn van beschermende routes tegen reperfusieschade. Zoals gerapporteerd in pathofysiologische en farmacologische studies, kan mitofagie een belangrijke rol spelen bij de cellulaire dood van het endotheel en myocardium geïnduceerd door IR26. Bovendien kunnen mitochondriale splijting, mitochondriale proteostase en mitochondriale kwaliteitscontrole het myocardium met een hoog risico beschermen in hererfde gebieden27,28. De bovenstaande methoden richten zich meer op het aantonen van verschillende mechanismen of oorzaken van hyperpermeabiliteit dan op het direct en visueel weergeven van endotheliale permeabiliteit. Bovendien is de voorbereiding van monsters voor elektronenmicroscopisch onderzoek ingewikkeld en gevaarlijk. Glutaaraldehyde-, aceton- en osmische zuuroplossingen die in elektronenmicroscopie worden gebruikt, vervluchtigen en eroderen waarschijnlijk het slijmvlies, het bindvlies en de huid, en bedreigen zelfs levens als ze in ongecontroleerde omgevingen worden gebruikt.

Vergeleken met deze indirecte en levensbedreigende methoden is deze methode, die de fluorescentie-intensiteit meet die wordt uitgezonden door extravasatie van FITC-dextran, ideaal voor het beoordelen van de microvasculaire permeabiliteit van het hart. Ten eerste kan 70.000 Da FITC-dextran onder normale fysiologische omstandigheden niet door het endotheel dringen, maar kan het onder IR de myocardiale interstitiële ruimte binnendringen, wat een duidelijk onderscheid tussen ratten onder verschillende behandelingen mogelijk maakt. Bovendien wordt de FITC-dextran-oplossing via de dijbeenaders in het bloed geïnjecteerd, wat garandeert dat alle vloeistof in de bloedsomloop van de rat wordt geïnjecteerd. Daarentegen is injectie van de staartader moeilijker bij ratten omdat de staartader onduidelijk is en bedekt met een dikke laag. Verder wordt, in tegenstelling tot reguliere paraformaldehydefixatie en paraffine-inbedding, de behandeling van myocardweefsel vereenvoudigd en geoptimaliseerd met behulp van de snelvries pathologische sectietechniek die in deze studie wordt gebruikt. Korte opslagtijd, lichtdichte omgeving en cryopreservatie kunnen samen de fluorescentie-afschrikking van FITC verlichten.

Wat nog belangrijker is, deze methode kan selectiebias tijdens statistische analyse minimaliseren. We voeren voldoende hartperfusie uit met zoutoplossing om ervoor te zorgen dat bijna al het bloed vermengd met FITC-dextran uit het myocardium en de hartkamers wordt gedospendeerd, waardoor de fluorescentie die wordt uitgezonden door eventuele FITC die in de bloedvaten achterblijft, kan worden geëlimineerd. Als dit niet het geval is, moet fluorescentie die is samengevoegd met haarvaten worden uitgesloten en kunstmatig worden bijgesneden. Bij het verzamelen van weefsel uit interessegebieden werd geen visuele grens waargenomen tussen het ischemische myocardium en het myocardium op afstand, vooral na kleuring met EB-kleurstof. Dit belemmerde het verzamelen van monsters uit deze representatieve gebieden. Met behulp van de hierin beschreven methode kunnen onderzoekers afbeeldingen van hele secties verkrijgen en de fluorescentie-intensiteit analyseren met behulp van een kwantitatieve schuifscanner.

Interessant is dat EB-kleurstof een alternatief kan zijn, zij het suboptimaal, voor FITC-dextran. Vergeleken met de relatief zware opslagomstandigheden van FITC-dextran, kan EB-poeder of zijn oplossing lange tijd stabiel blijven bij kamertemperatuur. Bovendien is EB voor de meeste instellingen relatief goedkoop. Niettemin kunnen bepaalde nadelen de toepassing ervan beperken. Ten eerste vertoont EB-kleuring een lagere gevoeligheid dan FITC-dextran, wat de verschillen tussen groepen kan onderschatten en de steekproefomvang van elke groep kan vergroten. Bovendien vertoont EB een sterkere hechting aan eiwitten. Het endocardium en epicardium worden gemakkelijker gekleurd door EB, wat de resultaten van de fluorescentiedichtheid kan beïnvloeden. Verder verminderen duidelijke opvulfouten in het reperfusiegebied de beeldkwaliteit opmerkelijk, wat het gebruik van EB kan beperken.

Om de toepassing van deze methode in een MI-model uit te breiden, is de methode getest in een MI-model. Eerst werd FITC-dextran in de bloedvaten geïnjecteerd na LAD-ligatie. Zoals verwacht werd een laag fluorescentieniveau uitgezonden door de plak omdat FITC-dextran in de bloedstroom niet door de geligeerde plaats kan gaan en er geen FITC-dextran in het ischemische gebied terechtkwam. FITC-dextran werd ook 5 minuten voor het afbinden aangebracht om de doorgang van FITC-dextran in alle organen te garanderen. Bijgevolg kon FITC-dextran het microvasculaire endotheel niet binnendringen, waarschijnlijk omdat geen perfusiedruk in geligeerde bloedvaten FITC-dextran door het endotheel kan drijven. Over het algemeen vereist deze methode waarschijnlijk aanzienlijk meer aanpassingen om te voldoen aan de toepassing ervan in het MI-model.

Ondanks de bovenstaande voordelen zijn er beperkingen aan deze methode. Ten eerste is dit protocol niet getest in IR-modellen van andere dieren, wat de toepassing ervan in preklinische en klinische onderzoeken kan beperken. Ten tweede zijn kleurstoffen met FITC-label duurder dan andere gangbare kleurstoffen zoals EB. In tegenstelling tot EB, aangezien 10% g/v FITC-dextraanoplossing, verdund met serum, zelden de kleur van het myocardium verandert, kan FITC-dextrankleuring en EB/2,3,5-trifenyltetrazolchloride (TTC) dubbele kleuring in hetzelfde hart worden uitgevoerd, wat het budget kan verminderen met betrekking tot het aantal dieren en de gebruikte kleurstoffen. Ten slotte is de diascanner die in dit onderzoek is gebruikt - de Quantitative Slide Scanner en soortgelijke instrumenten - mogelijk niet beschikbaar in sommige laboratoria. Samenvattend presenteert dit protocol een vereenvoudigde, betrouwbare en visuele methode voor de detectie van cardiale microvasculaire endotheliale permeabiliteit in een IR-model bij ratten met behulp van een fluorescentietest op basis van een geautomatiseerd kwantitatief pathologiebeeldvormingssysteem. Dit protocol toont aan dat 70.000 Da FITC-dextran beter presteert dan EB bij de functionele beoordeling van de endotheelbarrière van cardiale microvaten na IR-letsel.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (nr. 2017YFC1700503) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 81874461 en nr. 81774292).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 G AngiocatherBecton Dickinson, USA2089312
3-0 polypropyleen naald, toelopendeEthicon, USAKGP693
4’,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Invitrogen, USAD3571Alternatief voor Montage medium met DAPI
6-0 polypropyleen naald, rondeEthicon, USAKGJ656
Klevende MicroscoopglazenCITOTEST, China188105
ALC-V8S VentilatorShanghai Alcott Biotech, ChinaALC-V8S
Constant temperatuur verwarmingssysteemShanghai Alcott Biotech, ChinaALC-HTP203
Dissectietang-Grote CvdRWD life Science, ChinaF12007-10
Dissectietang-StrRWD life Science, ChinaF12005-10
FITC-dextran, 70.000DaSigma-Aldrich, USA53471
HaarverwijderingscrèmeNair, USAN/A
Insuline-Spuit,1mlBecton Dickinson, USA8155672
MicronaaldhoudersRWD life Science, ChinaF31047-12
Mosquitotang-CvdRWD life Science, ChinaF22007-12
Montage medium met DAPIZSGB-BIO, ChinaZLI-9557
Multi-positie vezel optische verlichtingssysteemRWD life Science, China76301
Operatie schaarRWD life Science, ChinaS14014-12
Pannoramic SCAN3DHISTECH, Budapest, HongarijeSC150-211305Alternatief dia scan voor Vectra Polaris
Phenochart 1.0.8PerkinElmer, USAN/ADia viewer software
Fosfaat gebufferde zoutoplossingHyClone,USASH30256.01
Retractoren,30mm Breed,5cmRWD life Science, ChinaF22005-45
SP8 Confocal microscoopLeica, DuitslandTCS-SP8 SRAlternatief voor Vectra Polaris
Chirurgisch tape3M, USA1527C-0
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSAKURA,Japan0822-00
Tongxinluo superfijn poederYiling, ChinaZ19980015
Ultraviolette vriessnijderLeica, DuitslandCM1950
Vectra Polaris 1.0.7 softwarePerkinElmer, USAN/ADia scan software
Vectra Polaris Kwantitatieve Dia ScannerPerkinElmer, USAVP1814N1068

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
  2. Hausenloy, D. J., et al. The coronary circulation in acute myocardial ischaemia/reperfusion injury: a target for cardioprotection. Cardiovascular Research. 115 (7), 1143-1155 (2019).
  3. Tada, Y., Yang, P. C. Myocardial edema on T2-weighted MRI: new marker of ischemia reperfusion injury and adverse myocardial remodeling. Circulation Research. 121 (4), 326-328 (2017).
  4. Chandrasekar, B., Smith, J. B., Freeman, G. L. Ischemia-reperfusion of rat myocardium activates nuclear factor-KappaB and induces neutrophil infiltration via lipopolysaccharide-induced CXC chemokine. Circulation. 103 (18), 2296-2302 (2001).
  5. Li, X. -D., et al. Tongxinluo reduces myocardial no-reflow and ischemia-reperfusion injury by stimulating the phosphorylation of eNOS via the PKA pathway. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 299 (4), 1255-1261 (2010).
  6. Pei, H., et al. TNF-α inhibitor protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via Notch1-mediated suppression of oxidative/nitrative stress. Free Radical Biology & Medicine. 82, 114-121 (2015).
  7. Liao, Y. -H., et al. Interleukin-17A contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating cardiomyocyte apoptosis and neutrophil infiltration. Journal of the American College of Cardiology. 59 (4), 420-429 (2012).
  8. Pedersen, S. F., et al. Assessment of intramyocardial hemorrhage by T1-weighted cardiovascular magnetic resonance in reperfused acute myocardial infarction. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 14 (1), 59(2012).
  9. Fang, L., et al. Differences in inflammation, MMP activation and collagen damage account for gender difference in murine cardiac rupture following myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (5), 535-544 (2007).
  10. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of evans blue and high molecular weight FITC-Dextran. Journal of Neuroscience Methods. 325, 108349(2019).
  11. Li, B. -R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  12. Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans Blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, 7628037(2018).
  13. Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Canadian Medical Association Journal. 71 (5), 489-491 (1954).
  14. Qi, K., et al. Tongxinluo attenuates reperfusion injury in diabetic hearts by angiopoietin-like 4-mediated protection of endothelial barrier integrity via PPAR-α pathway. PLoS One. 13 (6), 0198403(2018).
  15. Zhang, H. -T., et al. No-reflow protection and long-term efficacy for acute myocardial infarction with Tongxinluo: a randomized double-blind placebo-controlled multicenter clinical trial (ENLEAT Trial). Chinese Medical Journal (English). 123 (20), 2858-2864 (2010).
  16. Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
  17. Chen, G. -H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo protects human cardiomyocytes from ischemia/reperfusion injury via upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).
  18. Yu, Z. -H., et al. PI3K/Akt pathway contributes to neuroprotective effect of Tongxinluo against focal cerebral ischemia and reperfusion injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 181, 8-19 (2016).
  19. Yang, H. -X., Wang, P., Wang, N. -N., Li, S. -D., Yang, M. -H. Tongxinluo ameliorates myocardial ischemia-reperfusion injury mainly via activating Parkin-mediated mitophagy and downregulating ubiquitin-proteasome system. Chinese Journal of Integrative Medicine. , (2019).
  20. Pulous, F. E., Grimsley-Myers, C. M., Kansal, S., Kowalczyk, A. P., Petrich, B. G. Talin-dependent integrin activation regulates VE-cadherin localization and endothelial cell barrier function. Circulation Research. 124 (6), 891-903 (2019).
  21. Cong, X., Kong, W. Endothelial tight junctions and their regulatory signaling pathways in vascular homeostasis and disease. Cellular Signaling. 66, 109485(2020).
  22. Giannotta, M., Trani, M., Dejana, E. VE-cadherin and endothelial adherens junctions: active guardians of vascular integrity. Developmental Cell. 26 (5), 441-454 (2013).
  23. Monteiro, A. C., Parkos, C. A. Intracellular mediators of JAM-A-dependent epithelial barrier function. Annals of the New York Academy of Sciences. 1257, 115-124 (2012).
  24. Kakogiannos, N., et al. JAM-A acts via C/EBP-α to promote Claudin-5 expression and enhance endothelial barrier function. Circulation Research. 127 (8), 1056-1073 (2020).
  25. Feldman, G. J., Mullin, J. M., Ryan, M. P. Occludin: structure, function and regulation. Advanced Drug Delivery Reviews. 57 (6), 883-917 (2005).
  26. Zhou, H., et al. NR4A1 aggravates the cardiac microvascular ischemia reperfusion injury through suppressing FUNDC1-mediated mitophagy and promoting Mff-required mitochondrial fission by CK2α. Basic Research in Cardiology. 113 (4), 23(2018).
  27. Wang, J., Toan, S., Zhou, H. Mitochondrial quality control in cardiac microvascular ischemia-reperfusion injury: New insights into the mechanisms and therapeutic potentials. Pharmacological Research. , 156(2020).
  28. Zhu, H., et al. Phosphoglycerate mutase 5 exacerbates cardiac ischemia-reperfusion injury through disrupting mitochondrial quality control. Redox Biology. 38, 101777(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

endotheelpermeabiliteitcardiale microvasculaire barri reFITC dextranmyocardoedeemendotheelcellentight junctionspathologische beeldvorming
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen