Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Samenvatting

Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope zelfdiagnose en zijn efficiënt toegepast op toxine-, fysiologische index- en klinische biomarkerdetectie. In dit protocol geven we een gedetailleerde beschrijving van de stappen om een snelle, gevoelige en kwantitatieve laterale-flow immunoassay te ontwikkelen (met AuNPs als marker en mAbs als probe). De procedure beschrijft de bereiding en karakterisering van colloïdaal goud, synthese van het AuNP-mAb-conjugaat, assemblage van de immunochromatografische strip en methodologisch onderzoek van de test. De resultaten toonden aan dat de laatste strips verder kunnen worden gebruikt voor de snelle en gemakkelijke zelfdiagnose van een klein molecuul, wat een alternatief hulpmiddel kan bieden bij de snelle en nauwkeurige analyse van fysiologische en biologische indices.

Inleiding

Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope en snelle detectie. Het nitrocellulosemembraan als drager en colloïdaal goud als markers van immuunchromatografie snelle diagnostische reagentia zijn de meest gebruikte POCT-methode (point of care testing) en de testomvang van het project is breder. Van hun oorspronkelijke toepassing bij monitoring tijdens de zwangerschap, is hun gebruik uitgebreid tot het controleren van de bloedstollingstoestand^1,2,myocardiale verwonding^3,diergeneeskunde^4,residuen van bestrijdingsmiddelen^5,infectieziekten⁶ en medicijnconcentraties. Meer soorten monsters kunnen worden beoordeeld, waaronder urine, speeksel, volbloed, serum en andere lichaamsvloeistoffen^7,8,9.

In de afgelopen jaren zijn tal van nieuwe assays ontwikkeld voor het detecteren van biomarkers bij de diagnose van aandoeningen, waaronder HPLC, UPLC, LC-MS en ELISA, die gevoelig en nauwkeurig, geloofwaardig en specifiek zijn. Deze methoden vereisen echter geavanceerde instrumentatie, complexe voorbewerking en tijdrovende behandelingen⁹. Daarom is het ontwikkelen van een snellere en handigere point-of-care diagnostische strategie voor de zelf- en real-time detectie van medicinale actieve verbindingen dringend^10,11.

De populariteit van ICS'en, vooral voor veel voorkomende tests, wordt gedreven door hun gebruiksgemak, omdat ze geen professionals of uitgebreide instrumentale opstellingen vereisen¹². Met andere woorden, mensen die geen speciale training hebben, kunnen strips of zelftests bedienen¹³. De resultaten van de test kunnen in 5 minuten worden verkregen, wat betekent dat deze kan worden gebruikt voor inspecties ter plaatse¹⁴. Bovendien kunnen volgens onze berekeningen de kosten van strips lager zijn dan 1 RMB¹⁵, wat betekent dat de tests goedkoop zijn om¹⁶te promoten . Vandaar dat de ICS een relatief nauwkeurig, eenvoudig en goedkoop wegwerpapparaat is. ICS'en op basis van colloïdaal goud^17,18 worden ook toegepast bij snelle COVID-19-detectie.

Het principe van ICS is onder te verdelen in sandwich ICS en competitive ICS. Figuur 1A is een schematisch diagram van de sandwich ICS, die voornamelijk wordt gebruikt voor het detecteren van macromoleculaire stoffen zoals eiwitten, waaronder tumormarkers, ontstekingsfactoren en humaan choriongonadotrofine (HCG, antigeen in de vroege zwangerschap). Bij deze methode worden gepaarde antilichamen gericht op verschillende epitopen van het antigeen gebruikt en wordt het vanvangantilichaam als testlijn op het NC-membraan gedroogd. Gelabeld antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad en secundair antilichaam wordt gebruikt als controlelijn.

Figuur 1B is een schematisch diagram van concurrerende ICS, dat voornamelijk wordt gebruikt om stoffen met kleine moleculen te detecteren (MWCO < 2000 Da). Het coatingantigeen wordt als testlijn op het NC-membraan gefixeerd en het gelabelde antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad. Tijdens de detectie stromen het monster en het gelabelde antilichaam onder capillaire werking door de detectielijn en bindt het gecoate antigeen concurrerend vrij antigeen in het monster en ontwikkelt een rode kleur op de detectielijn.

Onlangs beschreven we de procedure van monoklonale antilichaamgeneratie tegen natuurlijke producten¹⁹. In dit werk ontwikkelden we een nieuwe laterale flow immunoassay op basis van de voorbereide anti-SSD mA²⁰ voor snelle, on-site detectie. De resultaten geven aan dat de immunochromatografietest een onmisbaar en handig hulpmiddel is voor het detecteren van van natuurlijke producten afgeleide verbindingen.

Figuur 1 Schematisch diagram van de immunochromatografietest (A) Sandwich immunochromatografische teststrips. B)Indirect concurrerende immuunchromatografische teststrips. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,2018²¹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Ethics Review Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer 2017BZYYL00120).

1. Bereiding en karakterisering van colloïdaal goud

OPMERKING: Voor colloïdaal goudsynthese, aangezien colloïdaal goud gemakkelijk wordt geadsorbeerd aan de binnenwand van het vat en gevoelig is voor neerslag door onzuiverheden, moet het vat voor synthese en opslag van colloïdaal goud grondig worden gereinigd en gedrenkt in zuur (40 ml gedestilleerd water, 360 ml geconcentreerd zwavelzuur, 20 g kaliumdichromaat) of worden onderworpen aan oppervlaktepassiveringsbehandeling. Een citroenzuurreductiemethode werd gebruikt om colloïdaal goud te synthetiseren.

1. Zet de magneetroerder aan en plaats de kolf (250 ml) op de mixer.
2. Bereid respectievelijk 4% goudchloridezuuroplossing en 1% natriumcitraatoplossing.
3. Voeg 120 ml gedestilleerd water toe aan een kolf met ronde bodem en verwarm het op een thermostatische magneetroerder tot de kook.
4. Blijf koken en voeg snel 0,5 ml 4% chlooraurinezuur en 5 ml 1% natriumcitraat toe.
5. Observeer de kleur van de oplossing. De lichtgele chlooraurinezuuroplossing kleurt wijn binnen enkele minuten rood.
6. Blijf 10 minuten verwarmen, totdat de oplossing verandert van kleurloos naar transparant wijnrood.
7. Schakel de stroom van de thermostatische magneetmenger uit, koel af tot kamertemperatuur en verplaats het mengsel naar een schone fles. Bewaren bij 4 °C.
8. Bepaal de grootte en morfologie van de AuNP's door ultraviolette spectroscopie en TEM-beeldvorming.
   OPMERKING: Verschillende maten colloïde gouddeeltjes voor verschillende toepassingen kunnen worden verkregen door het aandeel citraatnatrium en chlooraurinezuur te veranderen.

2. Synthese van AuNPs-mAb-conjugaat

OPMERKING: Aangezien antilichamen binden aan colloïdaal goud door elektrostatische adsorptie, hebben ladingen op het oppervlak van eiwitten en colloïdaal goud direct invloed op de bindingsintensiteit; daarom is de pH-waarde van de buffer een belangrijke factor die de stabiliteit van het antilichaam-colloïdaal goudconjugaat beïnvloedt. SSD en anti-SSD mAbs worden als voorbeelden gebruikt in dit protocol.

1. Evaluatie van de pH van de koppeling
   1. Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe in acht buisjes.
   2. Stel de AuNP-oplossingen in bij pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 en 12 met 0,1 M K₂CO₃.
   3. Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing (pH aangepast 5-12) toe aan acht buisjes die NaCl bevatten.
   4. Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.
   5. Kies de pH-waarde met de minste toevoeging van K₂CO₃ en stabiele oplossingskleur als de optimale pH-waarde voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten.
      OPMERKING: Gebruik geen pH-meter omdat de sonde kan worden vernietigd door AuNPs.
2. Evaluatie van de hoeveelheid antilichamen
   1. Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe aan acht buisjes.
   2. Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing met optimale pH toe aan elke buis.
   3. Voeg de monoklonale antilichaamoplossingen (eiwitconcentratie 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) toe aan de bovengenoemde acht buisjes.
   4. Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.
   5. Kies de hoeveelheid antilichamen met de laagste concentratie mAb en stabiele oplossingskleur als de optimale hoeveelheid mAb voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten.
3. Bereid de resuspensiebuffer voor: voeg 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 en 1% (v/v) PEG 20000 toe en meng goed.
4. Synthese van AuNP-mAb-conjugaat
   1. Neem 10 ml colloïdaal goudoplossing en gebruik 0,1 M K₂CO₃ om de oplossing aan te passen aan de optimale pH-waarde.
   2. Voeg langzaam SSD mAbs toe in de juiste concentraties en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Centrifugeer het mengsel bij 83 x g (1.000 tpm) gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het neerslag, dat onzuiverheden of neergeslagen colloïdaal goud bevat.
   4. Centrifugeer het mengsel bij 8.330 x g (10.000 tpm) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke en het neerslag is het colloïdaal goud-mAb-conjugaat.
   5. Voeg de resuspensiebuffer toe om de neerslag te dissociëren.

3. Montage van de Strip

OPMERKING: Voor latere flow-immunoassays zal de selectie en voorbehandeling van membraanmateriaal rechtstreeks van invloed zijn op de test, die moet worden onderzocht. De immunochromatografische strip bestaat uit een sample pad, een conjugaat pad, een nitrocellulose (NC) membraan, een absorberende pad en een PVC board(Figuur 1). Het membraanmateriaal moet worden gecontroleerd en geëvalueerd door stereomicroscopie om inhomogeniteit te elimineren.

1. Plak het NC-membraan op een PVC-plaat op 2 cm van de rand van het zuigeinde van het bord.
2. Voeg SSD-BSA (2 mg/ml) druppelsgewijs toe aan het NC-membraan (2 cm van de bovenrand) als testlijn (1 mm breed) en voeg geit-antimuis IgG (1,5 mg/ml) druppelsgewijs toe op het NC-membraan (2 cm van de onderrand) als controlelijn (1 mm breed). Controleer de hoeveelheid toegevoegd eiwit.
3. Bevestig de absorberende pad aan de PVC-plaat boven het NC-membraan en overlap deze met het NC-membraan met 2 mm.
4. Dompel het glasvezelmembraan onder in de AuNPs-mAb-geconjugeerde oplossing. Droog het natte membraan in een incubator bij 37 °C.
5. Knip het glasvezelmembraan af tot 5 cm lang en 2 cm breed en gebruik het als een geconjugeerde pad.
6. Plak de voorbehandelde geconjugeerde pad onder het NC-membraan. De lengte van overlap met het NC-membraan moet 0,1 cm zijn.
   OPMERKING: Het glasvezelmembraan heeft een sterk vermogen om eiwitten te binden en vrij te geven.
7. Trim het fusion 3 membraan tot 1,8 cm lang en 3,5 cm breed en gebruik het als monsterpad.
8. Plak het monsterkussen op het PVC-bord en overlap het met het geconjugeerde pad met 2 mm.
9. Snijd de geassembleerde karton met behulp van een snijmachine in stroken van 3,5 mm breed en compact met behulp van een batch-lamineersysteem.
10. Plaats ten slotte de teststrips in de schaal, verzegel ze in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar ze uit de buurt van licht. De ICS'en zijn nu geassembleerd.
    OPMERKING: Het bovenstaande is de laboratoriumprocedure. In de productie worden goudspuitapparatuur en cross-membraaninstrumenten gebruikt om goud te spuiten en de T- en C-lijnen te maken.

4. Kwantitatieve detectie

1. Laat 50 μL monsteroplossing op het monstergat vallen om het chromatografieproces te observeren.
   OPMERKING: Als gevolg van de capillaire werking die door het absorberende pad wordt aangedreven, migreert de monsteroplossing naar het andere uiteinde van de strip. Wanneer de monsteroplossing het geconjugeerde pad bereikt, reageert de SSD (antigeen) in het monster met de AuNPs-mAb die vooraf op de pad is geladen. Wanneer de oplossing migreert en de T-lijn bereikt, kan de AuNPs-mAb zonder SSD selectief worden vastgelegd door SSD-BSA (antigeen-carrier eiwitconjugaat), weergegeven als een rode kleur op de T-lijn. Vervolgens migreert de oplossing naar de C-lijn, waar de AuNPs-mAb worden gevangen door geiten-anti-muis IgG in de regio, waardoor ze als een rode kleur op de C-lijn worden weergegeven.
2. Analyseer de strips met een draagbare striplezer. De machine kan de verhouding van de testlijn tot de besturingslijn (T/C) leveren.
3. Evalueer de specificiteit, gevoeligheid, herhaalbaarheid en stabiliteit van de ICS-test.
   OPMERKING: Bij kwalitatieve detectie geeft één rode lijn een positief resultaat aan (controlelijn). Twee rode lijnen geven een negatief resultaat aan (test- en controlelijnen). Als de controlelijn niet aanwezig is, wordt de test als ongeldig beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van colloïdaal goud
De bereide colloïdaal goudoplossingen waren claret rood. TEM-analyses werden gebruikt om de morfologie en vorm van AuNPs te bepalen (Figuur 2A-D). Figuur 2A en figuur 2B laten zien dat de deeltjes veelvlakkvormig zijn en gelijkmatig verdeeld. De gemiddelde diameter van AuNP's bleek ongeveer 14 nm te zijn(figuur 2C). Een hoge resolu...

Discussie

In dit werk presenteren we een protocol voor de bereiding van mAbs tegen van natuurlijke producten afgeleide kleine moleculen. De essentiële stappen en de zaken die aandacht nodig hebben in de procedure zijn geschetst en we hebben het nut van dit protocol aangetoond met behulp van het kleine molecuul SSD als voorbeeld. Voorbeeldspectra, TEM-beelden, kwantitatieve resultaten en methodologisch onderzoek worden weergegeven in representatieve gegevens. Daarom hebben we aangetoond dat de colloïdaal goudproductie, AuNP-mAb-con...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chloorgouwzuuroplossing (HAuCl4)	Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory	JY-SJ102
runderen serum albumine	AMRESCO	332
centrifugebuis 15 mL	Corning	430645
centrifugebuis 50 mL	Corning	430828
ELISA platen, 96 putjes	NUNC	655101
Filterpapier	Sinopharm	H5072
Glasvezelmembranen	Jieyi	XQ-Y6
geit-anti-muis IgG antilichaam	applygen	C1308
Nitrocellulose membranen	Millipore	millipore 180
ovaalbumine	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
Pipet 10mL	COSTAR	4488
Pipet 25mL	FALCON	357525
semi-stijve PVC platen	Jieyi	JY-C104
Natriumcitraat	Beijing Chemical Works	C1034
natriumperiodaat	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne tips 1.000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5