Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van totaal RNA van Pseudomonas aeruginosa in biofilms voor het meten van genexpressie

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62755

⸱

24 september 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode om RNA te isoleren uit Pseudomonas aeruginosa biofilms die in kamerglaasjes zijn gekweekt voor sequencing met hoge doorvoer.

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa is een opportunistische bacteriële ziekteverwekker die infecties in de luchtwegen van patiënten met cystische fibrose (CF) veroorzaakt. P. aeruginosa staat bekend om zijn vermogen om biofilms te vormen die worden beschermd door een matrix van exopolysachariden. Deze matrix zorgt ervoor dat de micro-organismen beter bestand zijn tegen externe factoren, waaronder antibioticabehandeling. Een van de meest gebruikelijke methoden voor biofilmgroei voor onderzoek is in microtiterplaten of objectglaasjes met kamers. Het voordeel van deze systemen is dat ze het mogelijk maken om meerdere groeicondities te testen, maar hun nadeel is dat ze beperkte hoeveelheden biofilm produceren voor RNA-extractie. Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd, stap voor stap protocol te bieden over hoe totaal RNA kan worden geëxtraheerd uit kleine hoeveelheden biofilm van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor sequencing met hoge doorvoer. Dit protocol maakt het mogelijk om genexpressie binnen deze biofilmsystemen te bestuderen.

Inleiding

De meeste chronische bacteriële infecties, zoals longinfecties bij patiënten met cystische fibrose (CF) en prothesegerelateerde infecties, worden gekenmerkt door de groei van organismen in biofilms. Biofilms1 zijn gemeenschappen van bacteriën ingekapseld in een matrix die voornamelijk bestaat uit polysacchariden2. Bacteriën in biofilms kunnen langzaam groeien, metabolisch slapend en in anaërobe, hypoxische omstandigheden zijn. Biofilms zijn resistenter tegen antibiotica vanwege factoren zoals verminderde penetratie van antibiotica, verhoogde expressie van medicijneffluxpompen en verminderde celdeling3. Om deze en andere redenen zijn ze van groot onderzoeksbelang.

Om persisterende infecties zoals chronische Pseudomonas aeruginosa-infecties bij CF-patiënten nauwkeurig te kunnen bestuderen, moeten de groeicondities die worden waargenomen bij biofilmvorming nauwkeurig in vitro worden weergegeven. Een veelgebruikte methode met hoge doorvoer is om ze in kamerglaasjes of microtiterplaten te laten groeien en de vorming van biofilm te controleren met confocale microscopie4. Het is bekend dat een belangrijke regulator in de overgang van een planktonische of vrij zwevende naar biofilm bacteriële levensstijl de secundaire boodschapper, cyclisch-di-GMP5, is. Verhoogde cyclische-di-GMP-niveaus verhogen de expressie van specifieke genen die de groei van biofilm bevorderen. Kleine niet-coderende regulerende RNA's en quorum sensing spelen ook een belangrijke rol bij de regulatie van biofilmvorming5. Het meten van biofilmgenexpressie door geëxtraheerd bacterieel RNA te sequencen, kan een uitdaging zijn. P. aeruginosa produceert bijvoorbeeld drie exopolysacchariden (Psl, Pel en alginaat), die in aanzienlijke hoeveelheden worden geproduceerd in biofilms 6,7. Deze polysacchariden kunnen de RNA-extractie en -zuivering verstoren, wat leidt tot onzuivere preparaten die lage niveaus van bacterieel mRNA8 bevatten. In de handel verkrijgbare RNA-extractiekits zijn in staat om RNA van hoge kwaliteit te produceren uit planktonische bacterieculturen, maar werken mogelijk niet zo goed met biofilmculturen 9,10,11. Er zijn een paar commerciële RNA-extractiekits die beweren te werken voor biofilms, waarvan we er een met deze methode gebruiken.

In dit manuscript beschrijven we de procedures voor het kweken van P. aeruginosa biofilms in kamerglaasjes en het extraheren van bacterieel mRNA voor high-throughput sequencing12,13. Door gebruik te maken van klinische isolaten verzameld uit sputummonsters van CF-patiënten, tonen we aan dat deze methoden kunnen worden gebruikt voor isolaten met verschillende groeikenmerken. In vergelijking met eerdere publicaties wordt dit protocol in detail beschreven om meer succes mogelijk te maken bij het bestuderen van genexpressie van bacteriële biofilm 11,14,15,16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Research Ethics Board (REB) is nodig voor het verzamelen en verwerken van sputummonsters van menselijke proefpersonen. Deze studie werd goedgekeurd door het Hospital for Sick Children (REB#1000019444). De Research Ethics Board (REB) is verplicht om sputummonsters van menselijke proefpersonen te verzamelen en op te slaan. Deze studies werden goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB#1000058579.

1. Vorming van biofilm

  1. Kweek Pseudomonas aeruginosa-isolaten verkregen uit de sputummonsters van CF-patiënten die in dit onderzoek zijn gebruikt op Luria Broth (LB) agarplaten in een incubator van 37 °C 's nachts.
    OPMERKING: De juiste streeptechniek is belangrijk voor het verkrijgen van enkelvoudige bacteriekolonies. Door te strepen tijdens het draaien van de plaat worden de bacteriecellen voldoende verdund zodat er enkele kolonies kunnen groeien.
    1. Streep bacteriën met behulp van een inoculatielus in een zigzagpatroon aan de bovenkant van een verse LB-plaat totdat ongeveer 1/4 van de plaat bedekt is.
    2. Draai de plaat ongeveer 60°. Neem een nieuwe inoculatielus en haal deze eenmaal door het gestreepte gebied en in een tweede, schoon deel van de plaat, waarbij u het zigzagpatroon herhaalt.
    3. Herhaal stap 1.1.2 met een nieuwe lus in een derde gebied van de plaat. Plaats het deksel terug en keer de plaat om wanneer u deze in de broedmachine plaatst.
  2. Gebruik een steriele inoculatielus om een enkele bacteriekolonie van een agarplaat (met een enkele bacteriestam) te plukken en een kweekbuis te inoculeren gevuld met 5 ml steriele LB-media. Inoculeer met behulp van elke keer een nieuwe lus twee extra kweekbuisjes gevuld met 5 ml LB-media van dezelfde plaat.
  3. Herhaal dezelfde inoculatieprocedure voor de verschillende bacteriestammen. Kweek de culturen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 220 RPM.
    OPMERKING: Elke agarplaat die een enkele bacteriestam bevat, wordt gebruikt om 3 onafhankelijke kweekbuisjes te inoculeren. De drie buisjes vertegenwoordigen biologische replicaten in drievoud voor één stam en worden behandeld als afzonderlijke monsters. Dit is anders dan technische replicaten, waarbij RNA 3 keer uit een enkele kweekbuis wordt geëxtraheerd.
  4. Bereid 1:100 verdunningen van de nachtculturen door 50 μl van een nachtcultuur over te brengen in een nieuwe kweekbuis met 4,95 ml nieuwe LB-media.
  5. Laat de verdunde culturen nog 3 uur groeien bij 37 °C met schudden bij 220 RPM of tot de OD600 0,1 of hoger is. Meet de celdichtheden op een spectrofotometer bij OD600.
  6. Stel in een nieuwe microfuge-buis van 1.7 ml de OD600 in op 0.1 (vroege logfase) in een totaal volume van 1.5 ml met verse LB.
  7. Meng voorzichtig door inversie. Breng 300 μL van elke aangepaste cultuur over in 4 putjes van een 8-putjes kamerglaasje om te eindigen met 2 verschillende monsters per objectglaasje (Figuur 1).
  8. Plaats de glaasjes 's nachts gedurende 24 uur ongestoord in een broedmachine van 37 °C. Om verdamping te voorkomen, plaatst u de dia's op de bovenkant van een vochtige papieren handdoek in een klein plastic bakje.

2. Herstel van biofilm

OPMERKING: Elke glasplaat bevat acht afzonderlijke putjes. Een enkel monster bestaat uit vier putten met biofilms die zullen worden samengevoegd17. Dit extractieprotocol is voor 1 monster (4 putjes) waarbij de biofilms uit 2 putjes tegelijk worden teruggewonnen. RNA-extracties worden uitgevoerd met behulp van een commerciële RNA-extractiekit die een druppelklopstap en een kolomgebaseerde opruiming bevat, met aanpassingen. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding van reagens.

  1. Verwijder in een laminaire stromingskap langzaam de media uit 2 van de 4 putjes met behulp van een pipetpunt. Kantel de schuif in een hoek van 45° en pipetteer het medium uit de benedenhoek van de putjes om te voorkomen dat de biofilms losraken.
  2. Houd de schuif schuin en spoel de planktoncellen af door voorzichtig 300 μL RNasevrij water in de benedenhoek van de twee geleegde putjes te pipetteren. Verwijder het water door het voorzichtig uit te pipetteren, zoals beschreven in stap 2.1. Herhaal de wasstap en verwijder zoveel mogelijk water.
  3. Voeg 300 μL van een RNA-beschermingsreagens (zie Materiaaltabel) toe aan elk van de twee geleegde putjes met biofilms aan de basis. Plaats de kamerdia op een glasplaat om te voorkomen dat de putjes breken, en schraap vervolgens de biofilms in de 2 putjes met een kleine, nucleasevrije, steriele metalen spatel om de biofilmbacteriën opnieuw in suspensie te brengen. Laat zitten totdat de biofilms zijn teruggewonnen uit de 2 resterende onaangeroerde putjes uit hetzelfde monster.
    OPMERKING: De toevoeging van een RNA-beschermingsreagens zorgt voor de stabiliteit van de biofilmmonsters in de geschraapte putjes bij omgevingstemperatuur tijdens het verwerken van de resterende twee putjes van hetzelfde monster. Het RNA-beschermingsreagens lyseert cellen en inactiveert nucleasen en infectieuze agentia, wat resulteert in behoud van het RNA.
  4. Om biofilms terug te winnen uit de resterende 2 putjes voor een monster (ter herinnering: één monster bestaat uit 4 putjes), verwijdert u de LB-media uit de 2 resterende nieuwe putjes op dezelfde manier als beschreven in stap 2.1. Herhaal stap 2.2 om de planktoncellen af te spoelen met RNase-vrij water uit beide nieuwe putjes, zoals eerder.
  5. Ga terug naar de eerste 2 putjes met geschraapte biofilms in beschermingsreagens, gegenereerd aan het einde van stap 2.3, en pipetteer langzaam om de 300 μL opnieuw gesuspendeerde biofilm uit een geschraapt putje te mengen, in een poging niet te veel bubbels te creëren.
    1. Breng de hele inhoud van de put over in een van de pas gewassen, geleegde putjes. Meng en breng 300 μL opnieuw gesuspendeerde biofilm over van de tweede geschraapte put in de restige, pas gewassen, geleegde put.
      OPMERKING: In plaats van nieuw RNA-beschermingsreagens toe te voegen aan de 2 pas gewassen putjes met biofilms, brengt u de eerder geschraapte biofilms die al in het beschermingsreagens zitten over naar deze vers gewassen putjes. Dit houdt het gecombineerde monstervolume laag genoeg om te voldoen aan de invoervereisten voor de commerciële RNA-extractiekit. Zie Figuur 1 voor een schema.
  6. Herhaal het schrapen van de biofilms in de nieuwe putjes zoals in stap 2.3, door het kamerglaasje op een glasplaat te plaatsen en de biofilms in de 2 nieuwe putjes te schrapen met een kleine, nucleasevrije, steriele metalen spatel om de biofilmbacteriën opnieuw in suspenie te brengen.
  7. Combineer alle opnieuw gesuspendeerde biofilm van de 2 nieuwe putten in een enkele RNase-vrije, low-bindende, 1,5 ml microcentrifugebuis. Meet het volume, dat in totaal ~500 - 600 μL moet zijn.
    OPMERKING: De gecombineerde biofilmsuspensie van dit tweede paar nieuwe putjes bevat al het biofilmmateriaal van de originele 4 putjes van een monster.

3. Totale RNA-isolatie en kwaliteitsbeoordeling

OPMERKING: RNA-extractie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële RNA-extractiekit die beweert te werken op biofilms. De afzonderlijke componenten zijn, indien mogelijk, opgenomen in de materiaaltabel. Waar mogelijk wordt uitleg gegeven over de mechanismen achter elke zuiveringsstap.

  1. Voeg voldoende RNA-beschermingsreagens toe tot in totaal 750 μL in de buis. Breng het volledige volume over naar een lysisbuis van 2 ml die kralen van 0,1 en 0,5 mm bevat (zie materiaaltabel). Klop gedurende 2 1/2 minuut in een kralenklopper op maximale snelheid.
    OPMERKING: De combinatie van korrels met een hoge dichtheid van 0,1 mm en 0,5 mm plus snel mengen op een kralenklopper zorgt voor een grondige homogenisatie van microbiële celwanden.
  2. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 1 minuut om de korrels te pelleteren. Breng het bovenstaande over naar een nieuwe microcentrifugebuis, waardoor de overdracht van eventuele kralen tot een minimum wordt beperkt, wat stap 3.3 gemakkelijker maakt. Meet het volume.
  3. Voeg een gelijk volume RNA-lysisbuffer (~450 μL) toe en meng goed. Breng tot 800 μL monster over, vermijd het overbrengen van parels, naar een silicakolom in een verzamelbuis en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 s. Sla de doorstroom op omdat deze het RNA bevat, terwijl het DNA aan de kolom is gebonden.
    OPMERKING: De RNA-lysisbuffer bevat guanidiniumthiocyanaat en het wasmiddel N-lauroylsarcosine om cellen te lyseren. Guanidiniumthiocyanaat is een chaotrope stof die ook nucleasen inactiveert en, in aanwezigheid van silica, gevonden in de spinkolom, de binding van DNA aan het silicabevordert 18. De afwezigheid van ethanol zorgt voor een preferentiële binding van DNA en niet RNA aan de silica-spinkolom19. Het doel van stap 3.3 is het binden en verwijderen van genomisch DNA. We willen het RNA, dat in het doorstroomgedeelte zit, behouden.
  4. Als er meer monster overblijft, brengt u de kolom over naar een nieuwe verzamelbuis en laadt u deze opnieuw met de rest van het monster. Centrifugeren op 16.000 x g gedurende 30 s. Houd de doorstroming met het RNA en combineer met het eerste aliquot.
  5. Meet het gecombineerde doorstroomvolume af en voeg een gelijk volume van 100 % ethanol toe en meng goed. Breng tot 800 μL van de oplossing over naar een nieuwe, tweede silica-spinkolom in een verzamelbuis en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
    OPMERKING: De toevoeging van ethanol aan de chaotropische zoutoplossing die het RNA bevat, verbetert de binding van RNA aan de silica-spinkolom19.
  6. Voor oplossingen > 800 μl vult u de spinkolom opnieuw en centrifugeert u totdat de hele oplossing is doorgesponnen. Gooi de doorstroom na elke draai weg.
  7. Voeg 400 μL wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 s om een deel van de zouten te verwijderen. Gooi de doorstroom weg.
  8. Bereid het DNase I-reactiemengsel voor volgens de instructies van de fabrikant en voer de DNase-behandeling in de kolom uit om eventueel achtergebleven DNA te verwijderen.
  9. Resuspendeer het gevriesdroogde DNase I in 275 μL RNasevrij water om een 1 E/μL oplossing te maken. Meng door zachte inversie.
  10. Combineer 5 μL verdunde DNase I met 75 μL van de meegeleverde DNase-digestiebuffer. Meng voorzichtig door inversie.
  11. Voeg 80 μl van de bereide oplossing rechtstreeks toe aan de kolommatrix. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Voeg 400 μL RNA-prepbuffer toe aan de kolom en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
  13. Voeg 700 μL RNA-wasbuffer toe aan de kolom en herhaal de centrifugatie. Gooi de doorstroom weg.
  14. Voeg 400 μL RNA-wasbuffer toe en centrifugeer de kolom gedurende 2 minuten om eventuele resterende buffer volledig te verwijderen.
    OPMERKING: Er zijn 2 verschillende wasstappen om onzuiverheden op de kolom te verwijderen. De prep-buffer bevat een zwak chaotroop zout gemengd met ethanol om resterende eiwitten te verwijderen. Vervolgens wordt de wasbuffer gebruikt om ethanolwasbeurten uit te voeren om zouten te verwijderen. Eventuele resterende ethanol moet worden verwijderd om een efficiënte elutie van het RNA mogelijk te maken19,20.
  15. Breng de kolom voorzichtig over naar een nieuwe, weinig bindende microcentrifugebuis.
  16. Voeg 50 μL RNasevrij water rechtstreeks toe aan de kolommatrix en incubeer gedurende 5 minuten. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g om het RNA te elueren.
  17. Voor extra opruiming om PCR-remmers te verwijderen, plaatst u een PCR-remmerfilter in een nieuw opvangbuisje. Voeg 600 μL van de meegeleverde inhibitor prep oplossing toe (zie Tabel met materialen).
  18. Centrifugeer op 8.000 x g gedurende 3 minuten om het filter te wassen. Breng het gewassen filter over in een nieuwe microcentrifugebuis met een lage binding.
  19. Breng het geëlueerde RNA uit stap 3.13 over in het gewassen filter en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.000 x g.
    OPMERKING: Het RNA kan onmiddellijk worden gebruikt of worden bewaard bij -80 °C.
  20. Bepaal de concentratie van het RNA met behulp van een zeer gevoelig fluorometrisch systeem21.
    OPMERKING: Deze systemen maken een gevoelige kwantificering mogelijk van een kleine hoeveelheid RNA in oplossing die specifiek is voor het betreffende doelwit.
    1. Beoordeel de kwaliteit van het RNA met behulp van een geautomatiseerd elektroforesesysteem dat een RIN (RNA-integriteitsnummer) kan leveren, een maat voor de RNA-kwaliteit22,23.

4. Ribosomale RNA-depletie en sequencing met hoge doorvoer

  1. Dien RNA's in bij het genoomcentrum van het Centre for the Analysis of Genome Evolution and Function (CAGEF) van de Universiteit van Toronto (Toronto, Canada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) voor bacteriële rRNA-depletie en RNA-directionele bibliotheekvoorbereiding (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Bacteriële rRNA-depletie richt zich op de 5S, 16S en 23S rRNA's voor verwijdering24.
  2. Breek rRNA's uit met behulp van een commerciële rRNA-kit voor bacteriële uitputting. Volg het protocol voor het invoeren van 10 ng - 1 μg intact of gedeeltelijk gedegradeerd totaal RNA.
  3. Bouw RNA-sequencingbibliotheken met behulp van een RNA-directionele bibliotheekvoorbereidingskit met verschillende indexen die aan elke bibliotheek zijn gekoppeld.
  4. Verzamel equivalente hoeveelheden van elke RNA-bibliotheek en voer sequencing met hoge doorvoer uit met 100-base paired-end reads25.

5. Kwaliteitsbeoordeling van sequencing-lezingen

OPMERKING: Controleer de kwaliteit van de sequencing-lezingen met behulp van het gratis beschikbare programma, FastQC26, beschikbaar via het gratis, open-source platform, Galaxy27.

  1. Ga naar https://usegalaxy.org/. Klik op het menu Inloggen of Registreren en log in met inloggegevens of maak een account aan.
  2. Klik op de link Gegevens uploaden linksboven op de pagina, onder het menu Extra, en upload de fastq.gz volgordebestanden. Wacht tot de bestandsnamen aan de rechterkant van de pagina verschijnen, onder het deelvenster Geschiedenis.
  3. Selecteer FASTQ-kwaliteitscontrole onder het menu Extra om een lijst met programma's weer te geven. Selecteer FastQC, waarmee het middelste paneel van het scherm wordt ingevuld.
  4. Selecteer onder Kort gelezen gegevens uit uw huidige geschiedenis de geüploade fastq.gz bestanden in het vervolgkeuzemenu.
  5. Selecteer Uitvoeren om het programma uit te voeren.
  6. Bekijk de resultaten onder het deelvenster Geschiedenis (Tabel 2).
    OPMERKING: Ga voor meer gedetailleerde instructies over het gebruik van Galaxy naar de ondersteuningspagina op https://galaxyproject.org/support/.

6. In kaart brengen van sequencing-lezingen

OPMERKING : Vermeld is een basispijplijn voor het bijsnijden van adapters en het in kaart brengen van RNA-seq-gegevens. Adaptersequenties worden bijgesneden uit de lezingen met behulp van Trimmomatic28. De bijgesneden lezingen worden in kaart gebracht op het P. aeruginosa PAO1-referentiegenoom (NC_002516.2), verkregen van NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29met behulp van BWA30 en Samtools31. Voor de eenvoud worden een paar leesbewerkingen PA_1.fq en PA_2.fq genoemd; Het leesbestand van de adapter dat moet worden bijgesneden, wordt adapter.fa genoemd; en de PAO1-referentiesequentie wordt PAO1.fasta genoemd. Alle tools zijn open source en draaien in een UNIX/LINUX omgeving. Het wordt sterk aangeraden om vertrouwd te raken met de basisprincipes van UNIX/LINUX om deze commando's uit te voeren.

  1. Open een venster in UNIX/LINUX.
  2. Installeer Java, Trimmomatic, BWA en Samtools.
  3. Navigeer naar de map waarin het bestand zich trimmomatic-0.39.jar bevindt.
  4. Knip eventuele adaptersequenties van de reads af door de opdracht te typen:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    OPMERKING: Alleen adaptersequenties worden verwijderd. Lezingen zijn niet bijgesneden voor kwaliteit32.
  5. Verplaats het PAO1.fasta-referentiebestand naar dezelfde map.
  6. Indexeer de verwijzing met behulp van BWA met de opdracht:
    Bwa index PA01.fasta
  7. Wijs de gepaarde lezingen toe aan het referentiegenoom door de volgende 4 opdrachten te typen. Typ elke opdracht nadat de vorige is voltooid.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools weergave -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sorteren PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Samtools index PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Bekijk de toewijzingsstatistieken door de opdracht te typen:
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    OPMERKING: De 3eregel van de statistieken geeft het aandeel van de lezingen weer dat overeenkomt met het referentiegenoom.
  9. Bereken de gemiddelde leesdiepte en -breedte van de dekking met respectievelijk de volgende 2 commando's33:
    Samtools Diepte -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
    Samtools Diepte -Een PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het algemene overzicht van de methode is weergegeven in figuur 1. Eerder gebruikten we 8-putjes kamerglaasjes om P. aeruginosa biofilms te laten groeien en ze bloot te stellen aan antibiotica voordat we ze vervolgens onderzochten via confocale microscopie op verschillende tijdstippen12,13. Deze methode kan worden gebruikt om totaal RNA rechtstreeks te extraheren uit biofilms die in dit syste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Totaal RNA wordt met succes geëxtraheerd uit 17 verschillende bacteriële biofilmmonsters in drievoud, wat een totaal van 51 monsters oplevert. De negenenveertig RNA-bibliotheken worden samengevoegd en met succes gesequenced. Over het algemeen valideert dit onze kwaliteitscriteria met een slagingspercentage van 96%, hoewel meer dan de helft van de monsters wordt beschouwd als een lage abundantie en van suboptimale kwaliteit 34,35,36,37....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen onthullingen te verklaren.

Dankbetuigingen

Bijdragen van de auteur: P.W., Y.Y. en V.W waren betrokken bij het conceptualiseren van de studie. K.G., L.J., A.M. en P.W. optimaliseerden de labprotocollen. De financiering voor K.G. werd ondersteund door de subsidie van het Student Work Placement Program via BioTalent Canada.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BAGeautomatiseerde elektroforese van biomoleculen
Agilent RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513Hoge gevoeligheid RNA elektroforese chip voor het genereren van een RIN
DNA/RNA Lysis BufferZymo ResearchD7001-1-50Een op guanidiniumthiocyanaat en N-Lauroylsarcosine gebaseerde lysis buffer, verkocht als onderdeel van een nucleïnezuurzuiveringskit
DNA/RNA Prep BufferZymo ResearchD7010-2-10Een guanidine HCl en ethanol buffer, gebruikt voor de zuivering van DNA en RNA
DNA/RNA ShieldZymo ResearchR1100-50DNA en RNA conserverings-/beschermingsreagens
DNA/RNA Wash BufferZymo ResearchD7010-3-6Een zout- en ethanolbuffer, gebruikt voor de zuivering van DNA en RNA
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSHoge doorvoer sequentieerder
MGIEasy RNA Directional Library Prep SetMGI1000006386Genereer bibliotheken voor MGI hoog-doorvoer sequencing platforms uit totaal RNA.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001Een hoge energie, hoge doorvoer celdisrupter
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria)New England BiolabsE7850XEfficiënte en specifieke depletie van bacterieel rRNA (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II chamber slide systemThermo Fisher Scientific1545348-wel kamerslide met verwisselbare putjes
Qubit FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238Fluorometer voor DNA, RNA en eiwitten
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32852Hoge gevoeligheid fluorimetrische test om RNA concentratie te meten
Spin-Away FiltersZymo ResearchC1006-50-FSilica-gebaseerde spin kolom, voornamelijk gebruikt om genomisch DNA te binden of te verwijderen
Steriele inoculatielussen, 1 uLSarstedt86.1567.050Steriele, wegwerp inoculatielussen voor manipulatie van micro-organismen
ZR BashingBead Lysis tubesZymo ResearchS6003-502 mL buizen bevattend 0.1 en 0.5 mm kraal lysis matrix voor het homogeniseren van biologische monsters
Zymo Spin IIICG ColumnsZymo ResearchC1006-50-GSilica-gebaseerde spin kolom voor zuivering van DNA en RNA
Zymo-Spin III-HRC FiltersZymo ResearchC1058-50Verwijdering van remmers zoals polyfenolaire verbindingen, humuszuren/fulvumzuren, tanninen, melanine, etc.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kitZymo ResearchR2002DNA en RNA dubbele extractie kit
Zymobiomics HRC Prep solutionZymo ResearchD4300-7-30Te gebruiken met Zymo-Spin III-HRC Filters om PCR remmers te verwijderen

Referenties

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 791-808 (2013).
  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
  8. Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Analytical Biochemistry. 365 (2), 208-214 (2007).
  9. Francavilla, M., et al. Extraction, characterization and in vivo neuromodulatory activity of phytosterols from microalga Dunaliella tertiolecta. Current Medicinal Chemistry. 19 (18), 3058-3067 (2012).
  10. Atshan, S. S., et al. Improved method for the isolation of RNA from bacteria refractory to disruption, including S. aureus producing biofilm. Gene. 494 (2), 219-224 (2012).
  11. Franca, A., Melo, L. D., Cerca, N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes. 4, 572(2011).
  12. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. The Journal of Visusalized Experiments. (47), e2481(2011).
  13. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. The Journal of Visusalized Experiments. (118), e54819(2016).
  14. Cockeran, R., et al. Biofilm formation and induction of stress response genes is a common response of several serotypes of the pneumococcus to cigarette smoke condensate. The Journal of Infection. 80 (2), 204-209 (2020).
  15. Bisht, K., Moore, J. L., Caprioli, R. M., Skaar, E. P., Wakeman, C. A. Impact of temperature-dependent phage expression on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. npj Biofilmsand Microbiomes. 7 (22), (2021).
  16. Harrison, A., et al. Reprioritization of biofilm metabolism is associated with nutrient adaptation and long-term survival of Haemophilus influenzae. NPJ Biofilms and Microbiomes. 5 (1), 33(2019).
  17. Sousa, C., Franca, A., Cerca, N. Assessing and reducing sources of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms. BioTechniques. 57, 295-301 (2014).
  18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  19. Coppin, C. Re: How do silica based RNA spin columns only bind RNA and not DNA. , Available from: https://www.researchgate.net/post/How_do_silica_based_RNA_spin_columns_only_bind_RNA_and_not_DNA/60b017bffa5c4151cac1c/citation/download (2021).
  20. Kennedy, S. A complete guide to how nucleic extraction kits work. , Available from: https://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ (2021).
  21. Qubit RNA HS Assay Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FQubit_RNA_HS_Assay_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogUXViaXQgUk5BIEhTIEFzc2F5IEtpdHM (2015).
  22. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control (Application report # 5989-1165EN). , Available from: https://www.agilent.com/cd/library/applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  23. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  24. Culviner, P. H., Guegler, C. K., Laub, M. T. A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies. mBio. 11 (2), (2020).
  25. MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual verA2. MGI Tech Co. , Available from: https://en.mgi-tech.com/products/reagents_info/14/ (2020).
  26. Andrews, S. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  27. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. , (2014).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), (2016).
  30. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  31. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), (2009).
  32. Liao, Y., Shi, W. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads at the gene level. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  33. Penir, S. Calculating Mapping Statistics from a SAM/BAM file using SAMtools and awk. , Available from: https://sarahpenir.github.io/bioinformatics/awk/calculating-mapping-stats-from-a-bam-file-using-samtools-and-awk/ (2019).
  34. Haile, S., et al. Evaluation of protocols for rRNA depletion based RNA sequencing of nanogram inputs of mammalian total RNA. PLoS ONE. 14 (10), 0224578(2019).
  35. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (442), (2017).
  36. Shanker, S., et al. Evaluation of Commercially Available RNA Amplification Kits for RNA Sequencing Using Very Low Input Amounts of Total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), (2015).
  37. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10, 623-629 (2013).
  38. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17 (13), (2016).
  39. Illumina, Inc. Coverage depth recommendations. , Available from: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html (2021).
  40. What is a good sequencing depth for bulk RNA-Seq. ECSEQ Bioinformatics. , Available from: https://www.ecseq.com/support/ngs/what-is-a-good-sequencing-death-for-bulk-rna-seq (2019).
  41. Bedre, R. Sequencing coverage and breadth of coverage. , Available from: https://www.reneshbedre.com/blog/sequencing-coverage.html (2021).
  42. Dotsch, A., et al. The Pseudomonas aeruginosa transcriptome in planktonic cultures and static biofilms using RNA sequencing. PLoS One. 7 (2), 31092(2012).
  43. Chen, Y., et al. Population dynamics and transcriptomic responses of Pseudomonas aeruginosa in a complex laboratory microbial community. npj Biofilms and Microbiomes. 5 (1), (2019).
  44. Thoming, J. G., et al. Parallel evolutionary paths to produce more than one Pseudomonas aeruginosa biofilm phenotype. NPJ Biofilms and Microbiomes. 6, 2(2020).
  45. Soares, A., et al. Understanding ciprofloxacin failure in Pseudomonas aeruginosa biofilm: persister cells survive matrix disruption. Frontiers in Microbiology. 10, 2603(2019).
  46. Whiteley, M., et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, (2001).
  47. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1, (2006).
  48. Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication. Bioinformatics. 30 (3), (2014).
  49. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van biofilm-RNAextractie van totaal RNAbiofilmvormingexopolysacharide-matrixmicrotiterplaatbiofilmshigh-throughput sequencingbacteriële pathogeencystische fibrose

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.