Een schaalbare methode om neuronale overleving in primaire neuronale cultuur te bestuderen met single-cell en real-time resolutie

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudige, krachtige en veelzijdige methodologie om neuronale overleving bij cytotoxische stress in primaire corticale neuronen te onderzoeken met cellulaire resolutie in realtime of in vast materiaal.

Samenvatting

Neuronaal verlies vormt de kern van veel neuropathologieën, waaronder beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson. Er werden verschillende methoden ontwikkeld om het proces van neuronale overleving bij cytotoxische stress te bestuderen. De meeste methoden zijn gebaseerd op biochemische benaderingen die geen resolutie van één cel toestaan of complexe en kostbare methodologieën omvatten. Hier wordt een veelzijdig, goedkoop en effectief experimenteel paradigma gepresenteerd om neuronale overleving te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van schaarse fluorescerende labeling van de neuronen, gevolgd door live beeldvorming en geautomatiseerde kwantificering. Daartoe worden de neuronen geëlektropoleerd om fluorescerende markers tot expressie te brengen en samen gekweekt met niet-geëlektroporeerde neuronen om de celdichtheid gemakkelijk te reguleren en de overleving te vergroten.

Schaarse etikettering door elektroporatie maakt een eenvoudige en robuuste geautomatiseerde kwantificering mogelijk. Bovendien kan fluorescerende labeling worden gecombineerd met de co-expressie van een gen van belang om specifieke moleculaire routes te bestuderen. Hier presenteren we een model van een beroerte als een neurotoxisch model, namelijk de zuurstof-glucosedeprivatie (OGD) -test, die werd uitgevoerd in een betaalbare en robuuste zelfgemaakte hypoxische kamer. Ten slotte worden twee verschillende workflows beschreven met behulp van IN Cell Analyzer 2200 of de open-source ImageJ voor beeldanalyse voor semi-automatische gegevensverwerking. Deze workflow kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende experimentele modellen van toxiciteit en worden opgeschaald voor high-throughput screening. Concluderend biedt het beschreven protocol een toegankelijk, betaalbaar en effectief in vitro model van neurotoxiciteit, dat geschikt kan zijn voor het testen van de rol van specifieke genen en routes in live beeldvorming en voor high-throughput screening van geneesmiddelen.

Inleiding

De studie van neuronale aandoeningen vereist experimentele modellen die vatbaar zijn voor genetische, moleculaire en cellulaire analyses. Primaire corticale neuronen zijn een zeer krachtig model voor het bestuderen van neuronale overleving en toxiciteit 1,2,3,4. Onder de juiste omstandigheden zullen primaire neuronen geleidelijk synaptische contacten ontwikkelen en kenmerken van volwassen neuronen vertonen. Daarom is dit model betrouwbaarder dan onsterfelijke cellijnen bij het modelleren van de fysiologie van de neuronen en meer vatbaar voor manipulaties dan diermodellen. In vergelijking met cellijnen zijn primaire corticale neuronen echter moeilijk te transfecteren en relatief kwetsbaar. Bovendien kan de ingewikkelde morfologie van corticale neuronen de beeldvorming en analyse in culturen met een hoge dichtheid bemoeilijken. Omgekeerd zijn primaire neuronale culturen met een lage dichtheid gemakkelijker te analyseren, maar zijn ze meestal kwetsbaarder.

Dit alles in aanmerking nemend, presenteert dit artikel een betaalbare, veelzijdige en schaalbare in vitro workflow om neuronale overleving te modelleren en te onderzoeken (Figuur 1). De belangrijkste punten van dit protocol zijn: i) de methode van in vitro elektroporatie van de neuronen met een fluorescerende marker om schaarse labeling en beeldvorming van levende cellen mogelijk te maken; ii) zijn veelzijdigheid in verschillende modellen van cytotoxiciteit; en iii) de semi-geautomatiseerde of geautomatiseerde analyse.

Het elektroporatiesysteem (zie de materiaaltabel) biedt een open en goedkope procedure waarbij geen kits en specifieke oplossingen betrokken zijn ^4,5,6. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om een optimale transformatie-efficiëntie en dichtheid van getransfecteerde neuronen te verkrijgen, waarbij geëlektroporeerde en niet-geëlektroporeerde cellen worden gemengd. De co-cultuur met naïeve (niet-geëlektroporeerde) neuronen verbetert de levensvatbaarheid van de geëlektroporeerde cellen aanzienlijk in vergelijking met culturen met een lage dichtheid. Bovendien maakt het schaarse labeling mogelijk met een instelbare dichtheid van de geëlektroporeerde neuronen, waardoor een consistent niveau van genexpressie behouden blijft. Het is belangrijk om te streven naar 3-5% van de geëlektrofionomieerde neuronen in overlevingstesten.

Het hebben van schaarse labeling vergemakkelijkt in wezen de automatisering van de beeldanalyse, omdat de cellen goed gescheiden en gemakkelijk te onderscheiden zijn. Dit experimentele paradigma kan met name worden aangepast om meerdere interessante genen te testen door gelijktijdig neuronen te co-kweken die zijn geco-geëlektropoleerd met verschillende cytosolische fluorescerende markers (bijv. cyaan fluorescerend eiwit, rood fluorescerend eiwit (RFP), groen fluorescerend eiwit (GFP)) in dezelfde put. Net als bij andere cytotoxiciteitstesten (bijv. propidiumjodide of lactaatdehydrogenase), is de hierin beschreven test gebaseerd op het feit dat neuronale dood gepaard gaat met het scheuren van het celmembraan. Dit veroorzaakt de afgifte van cytosolische eiwitten door diffusie en bijgevolg het verlies van GFP-fluorescentie.

Een in vitro model van een beroerte, namelijk het OGD-model, wordt gepresenteerd als een voorbeeld van neurotoxiciteit ^7,8,9. Dit protocol houdt in dat de primaire neuronen worden blootgesteld aan een zoutbuffer die lijkt op een kunstmatig hersenvocht, maar verstoken is van zuurstof en glucose. Hoewel dit model is gepresenteerd als een voorbeeld van neurotoxische stress, kunnen verschillende cytotoxische aandoeningen worden getest met dezelfde workflow ^8,9. Ten slotte maakt schaarse etikettering gemakkelijk de ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvormingsanalyse mogelijk. Hier werd een protocol opgesteld op basis van standaard immunofluorescentie en ImageJ-analyse in een kleinere opstelling. Vervolgens werd deze workflow aangepast en opgeschaald met behulp van een celbeeldvormingssysteem dat een geautomatiseerde analyse in live beeldvorming in mid- en high-throughput-modi mogelijk maakt. Concluderend presenteert dit artikel een flexibele, betaalbare en schaalbare methodologie om neuronale overleving te bestuderen in verschillende experimentele toxiciteitsmodellen met behulp van live beeldvorming en geautomatiseerde kwantificering.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, moeten onder toezicht staan van het bio-ethische dierencomité van het instituut en worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale regelgeving. De hierin gepresenteerde procedures zijn goedgekeurd door de gedelegeerde autoriteit en voldoen aan de regelgeving in Spanje en Europa.

1. Primaire neuronale cultuur

OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd in de kweekkap, met behulp van steriele materialen en oplossingen om steriele omstandigheden te behouden.

1. Poly-L-lysine (PLL) coating
   1. Was de dekglaasjes (CV's, 15 mm) een nacht (o/n) in 70% ethanol in een orbitale schudder.
      OPMERKING: De snelheid van de orbitale schudder moet voldoende zijn om de CV voorzichtig te verplaatsen, maar niet te snel om beschadiging of krassen van de CV's te voorkomen. Het specifieke toerental is afhankelijk van het model van de shaker. CV's kunnen gedurende lange perioden (maanden) in ethanol worden bewaard.
   2. Verwijder de ethanol en was twee keer met gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten elk.
   3. Laat de CV's drogen bij kamertemperatuur (RT) in een petrischaaltje van 100 mm (ongeveer 13 CV's/plaat). Zorg ervoor dat de cv's elkaar of de randen van de plaat niet raken.
      OPMERKING: Droge cv's kunnen gedurende lange perioden (maanden) bij RT worden bewaard.
   4. Bereid de 5 mg/ml PLL-stockoplossing in water, maak aliquots en bewaar ze bij -20 °C. Verdun de stockoplossing in 1x PBS tot een werkconcentratie van 0,1 mg/ml.
      OPMERKING: Hogere concentraties tot 1 mg/ml PLL kunnen worden getest.
   5. Voeg het minimale volume PLL toe om het oppervlak van de cv's te bedekken (zie optimale volumes PLL in tabel 1). Voeg de PLL-oplossing druppelsgewijs toe om de vorming van een druppel te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Het plateren van neuronen op CV's is vereist voor immunofluorescentie. Voor time-lapse-beeldvorming (bijv. voor de IN-cel) worden cellen direct boven de put geplateerd zonder CV's, omdat de CV's tijdens de time-lapse kunnen bewegen. Voeg in dat geval het minimale volume PLL toe om het oppervlak van elke put te bedekken.

Oppervlak	PLL-volume (ml)
Dekglaasjes 15 mm	0.2
Dekglaasjes 13 mm	0.18
Plaat met 96 putjes	0.07
Plaat met 24 putjes	0.3
Plaat met 6 putjes	2
60 mm plaat	4.5

Tabel 1: Optimale hoeveelheden poly-L-lysine in functie van de oppervlakte.

6. Incubeer gedurende minimaal 1 uur bij 37 °C.
   OPMERKING: De incubatietijd kan zo lang zijn als o/n.
7. Verwijder de PLL van de CV's. Was de CV's twee keer met gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten elk. Laat de cv's drogen bij RT.
   OPMERKING: De PLL-oplossing kan worden bewaard bij 4 °C voor hergebruik (maximaal 3 keer).
8. Bewaar de gedroogde CV's in een petrischaaltje bij 4 °C (gedurende maximaal 7-10 dagen) of plaats ze in de putjes met plating medium (zie samenstelling in tabel 2 en werkvolumes in tabel 3). Voeg het platingmedium rechtstreeks toe aan de putjes van de platen met 12 putjes (tabel 3).
   OPMERKING: Neuronen zijn erg gevoelig voor de kwaliteit van het foetaal runderserum (FBS). Verschillende batches FBS moeten worden getest om de batch te identificeren waarin de cellen er gezonder uitzien. Zodra een goede hoeveelheid FBS is geïdentificeerd, is het aan te raden om een grote hoeveelheid te verkrijgen en deze bij -80 °C te bewaren. Dit protocol zou kunnen worden aangepast voor andere soorten cv's en platen (zie de verschillende werkvolumes in tabel 3).

Plating Medium
MEM		42.5	Ml
10% Paardenserum of FBS*		5	Ml
30% glucose (0,6% eindconcentratie)		1	Ml
PS (penicilline, 10000 E/ml; streptomycine, 10 mg/ml);		0.5	Ml
Elektroporatie medium
Opti-MEM
Neuronaal medium
Neurobasaal medium		48.5	Ml
B-27		1	Ml
Glutamax 200 mM		0.125	Ml
PS (penicilline, 10000 E/ml; streptomycine, 10 mg/ml);		0.5	Ml
OGD Medium (Tasca, et al. 2014)
CaCl2		1	Mm
Kcl		5	Mm
NaCl		137	Mm
KH2PO4		0.4	Mm
Na2HPO4		0.3	Mm
MgCl2		0.5	Mm
MgSO4		0.4	Mm
HEPES		25	Mm
NaHCO3		4	Mm

Tabel 2: Samenstelling van de verschillende gebruikte media.

Oppervlakte van putten en platen			Werkvolume
Plaat met 96 putjes	0.32	cm2	0.1	Ml
Plaat met 24 putjes	1.9	cm2	0.5	Ml
Plaat met 12 putjes	3.8	cm2	1	Ml
Plaat met 6 putjes	9.5	cm2	2.5	Ml
60 mm plaat	21.5	cm2	6	Ml

Tabel 3: Oppervlakte van de verschillende soorten platen en de werkvolumes.

2. Voorbereiding van de neuronale cultuur
   1. Verwarm (37 °C) en breng het platingmedium, het neuronale medium en het elektroporatiemedium (zie samenstelling in tabel 2) voor (37 °C) en breng het in evenwicht (in een atmosfeer van 5% CO₂) in een gedeeltelijk geopende fles in de celincubator gedurende minimaal 2 uur. Laat de trypsine opwarmen bij RT. Verwarm de 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) voor op 37 °C in een waterbad.
   2. Stel de elektroporatieparameters vooraf in (tabel 4).

ELEKTROPORATIE OMSTANDIGHEDEN: Poring Puls
Lengte	V	Interval	N	D. Tarief	Polariteit
2 ms	175	50	2	10	plus
ELEKTROPORATIE VOORWAARDEN: Overdracht Puls
Lengte	V	Interval	N	D. Tarief	Polariteit
50	20	50	5	40	plus/min

Tabel 4: Instellingen voor elektroporatie voor NEPA21.

3. Hersendissectie en oogsten CD-1 muis embryos op E15 post-coitum
   1. Offer de zwangere vrouw door cervicale dislocatie zonder sedatie. Steriliseer de buik met 70% ethanol; Knip en open de buik met een scherpe schaar.
   2. Pak de baarmoeder uit en plaats deze in een petrischaaltje met koude 1x HBSS. Laat het met een gewone tang op ijs in de celkweekkap liggen.
   3. Haal een embryo uit de baarmoeder met behulp van een tang en een schaar en onthoofd het met een enkele snede met een schaar.
   4. Houd het hoofd vast en breng een tang (bijv. Dumont fijne pincet) in de oogbaan.
   5. Gebruik de naald (naaldspuit van 30 G) als mes, snijd het bregma door en breek door het achterste deel van het hoofd.
   6. Breng een scherpe tang door de incisie verticaal in de bregma en breek de dunne huidlaag van het voorste gebied. Trek aan de tang om de longitudinale spleet tussen de twee hemisferen te volgen zonder de cortex te beschadigen.
   7. Gebruik de kleine tang in een hoek van 45°, van het voorste naar het achterste deel, om de hersenen van het hoofd te verwijderen.
   8. Verplaats de hersenen naar een petrischaaltje van 3,5 cm met ijskoude 1x HBSS onder een stereomicroscoop.
4. Dissectie van cortex
   OPMERKING: Het protocol voor neuronale cultuur is aangepast van de procedure beschreven door Dotti en Banker¹⁰.
   1. Gebruik de Dumont-tang (11 cm) om de thalamus vast te houden en een naald die in een hoek van 45° wordt gekanteld om de cortex van elke hersenhelft van de middenhersenen te scheiden. Zorg ervoor dat de cortex geen sporen van andere weefsels vertoont; Gebruik een scherpe tang om de hersenvliezen te verwijderen.
      OPMERKING: De hersenvliezen vormen een dun elastisch membraan dat de hersenen omhult en zijn gemakkelijk te herkennen aan hun rode kleur. Het maken van zachte bewegingen in zigzag helpt de hersenvliezen te verwijderen. Zorg ervoor dat alle hersenvliezen zijn verwijderd, want ze zijn giftig voor de cultuur.
   2. Verplaats de schone cortex naar een schoon petrischaaltje van 3,5 cm met ijskoud 1x HBSS en plaats het op ijs.
5. Uitsplitsing
   1. Snijd elke cortex in twee helften en gebruik een tang of een scherpe naald (30 G) om het effect van trypsine in de volgende stap te vergemakkelijken.
   2. Breng de stukjes over op 7 ml trypsine-EDTA-buffer bij kamertemperatuur in een buisje van 15 ml met behulp van een P1000-pipet (snijd 3-4 mm van de punt af). Wacht tot ze naar de bodem van de punt zinken voordat u ze van de pipetpunt loslaat. Mengen door te kantelen.
   3. Incubeer gedurende 12 minuten bij 37 °C in een waterbad. Meng door elke 4-5 minuten te kantelen.
      OPMERKING: De incubatietijd kan variëren van 12 tot 15 minuten.
   4. Laat het weefsel door de zwaartekracht zinken en verwijder voorzichtig de trypsine. Was de tissue twee keer met 8 ml 1x HBSS en schud voorzichtig door te kantelen. Verwijder de 1x HBSS voorzichtig met een P1000 pipet, maar met een ongesneden pipetpunt.
   5. Was de tissue een keer met 5 ml plating medium. Agiteer door te kantelen. Verwijder het platingmedium voorzichtig met behulp van een P1000-pipet.
   6. Voeg 1,5 ml plating medium toe. Ontschandig het mengsel mechanisch met behulp van een P1000-pipet door het medium vanaf de bodem van de buis op te zuigen en het voorzichtig over de wanden los te laten voor maximaal 8-12 keer.
   7. Filtreer door een steriele celzeef (70 μm) die op een buis van 50 ml is geplaatst. Voeg 10 ml of een ander gewenst volume platingmedium toe aan de buis.
   8. Breng 5 μL van de celsuspensie in de celtelkamer, voeg 5 μL trypanblauw toe (0,4% w/v) en tel de cellen.
   9. Plaats de cellen (zie punt 1.6) door een voldoende volume van de celsuspensie over te brengen om het gewenste aantal cellen voor elektroporatie te hebben (bv. 10⁶ cellen) in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 min. Ga verder naar paragraaf 1.6.
6. Cellen uitplaten
   1. Plaats de gewenste dichtheid van de niet-gecentrifugeerde celsuspensie uit stap 1.5.7 in elk putje met het platingmedium.
      OPMERKING: In dit protocol werden 100.000 tot 200.000 cellen/putje gezaaid in een plaat met 12 putjes. Registreer ter referentie ten minste 3 CV's per experimentele conditie om rekening te houden met experimentele variabiliteit. Een typische experimentele setting kan het afbeelden van 4-5 velden per CV inhouden (bijv. bij gebruik van een 20x objectief zou elk veld naar verwachting ~1,3 mm² breed zijn).
   2. Beweeg de plaat in de celkweekkap in alle windrichtingen om de cellen gelijkmatig te verdelen.
7. Elektroporatie
   OPMERKING: Andere transfectiesystemen kunnen worden gebruikt. Het NEPA21-systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, heeft het voordeel dat het een "open systeem" is. Het protocol kan door de gebruiker worden gewijzigd en vereist geen specifieke reagentia voor de transfectie van speciale cuvetten die worden gebruikt voor de elektroporatie. Dit protocol is gewijzigd van ⁵.
   1. Ga verder vanaf stap 1.5.9. Resuspendeer de celpellet met 5 ml elektroporatiemedium in een buis van 15 ml. Centrifugeer de buis bij 250 × g gedurende 5 minuten.
   2. Herhaal stap 1.7.1. Resuspendeer met elektroporatiemedium om een concentratie van 10 tot⁶ cellen/ml in elk van de elektroporatiecuvetten te verkrijgen. Meng de cellen met de gewenste hoeveelheid DNA in de cuvet.
      OPMERKING: Voor GFP-expressie werd 3 μg plasmide per miljoen cellen gebruikt. Vanwege de hoge variabiliteit wordt aanbevolen om de optimale concentratie voor elk plasmide te testen. Er is tussen de 2 en 24 μg plasmide per miljoen cellen getest. Diverse plasmiden kunnen in dezelfde cuvet worden gecombineerd om een dubbele transfectie uit te voeren. In het geval van co-transfectie, transfecteert het gen van belang in overmaat in vergelijking met GFP (bijv. 3:1 is een optimale verhouding die moet worden getest) om ervoor te zorgen dat de meeste GFP-expressiecellen het gen van belang tot co-expressie brengen.
   3. Plaats de cuvet in de kuvettenkamer (Figuur 2). Druk op de Start-knop om het vooraf ingestelde programma uit te voeren (zie elektroporatievoorwaarden in Tabel 4). Noteer de waarden van stromen en joules die worden weergegeven in het kader Metingen .
      OPMERKING: De gebruiker kan specifieke voorwaarden wijzigen. Bijvoorbeeld, het verminderen van de spanning kan de efficiency van transfectie verminderen maar neuronale overleving verhogen.
   4. Haal de cuvet uit de kamer. Voeg direct na de elektroporatie 500 μl van het platingmedium toe aan de cuvet en breng het monster van de cuvet over in een centrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een pipet.
      OPMERKING: Hoe sneller het medium wordt toegevoegd, hoe beter de overleving na elektroporatie, omdat het celbeschadiging helpt voorkomen.
   5. Plaats het gewenste aantal geëlektroporeerde cellen in elk putje.
      OPMERKING: Plaat van 20.000 tot 100.000 cellen in een plaat met 12 putjes. Afhankelijk van de omstandigheden kan slechts 5-10% van de geëlektroporeerde cellen overleven. Het exacte aantal moet door de gebruiker worden getest en aangepast.
   6. Incubeer gedurende 2-4 uur onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO₂, verzadigde vochtigheid).
      OPMERKING: Bekijk de cellen na de incubatietijd onder de microscoop. Als de cultuur gezond is, zouden de meeste cellen zich aan het oppervlak hebben gehecht en zichtbare neurietextensies zijn gaan ontkiemen.
   7. Verander het platingmedium in neuronaal medium (volumes en samenstelling in respectievelijk Tabel 1 en Tabel 2).
8. Cellen onderhouden
   1. Om het medium te verversen, verwijdert u de helft van het medium en voegt u na 7 dagen cultuur een gelijke hoeveelheid vers voorgebalanceerd medium toe.
   2. Vervang op dag 10 van de kweek de helft van het volume door vers neuronaal medium zonder het glutaminesupplement (zie de tabel met materialen). Herhaal deze stap om de dag na dag 10.
      OPMERKING: Na 10 dagen kweek produceren cellen zelf glutamaat.

2. Constructie van de hypoxische kamer

1. Gebruik hiervoor een hermetische container met een schroefdeksel of een gelijkwaardig afdichtingssysteem (Figuur 3A). Boor twee gaten in de wand van de plastic container en plaats er een plastic buis in. Sluit ze af met siliconen zodat de container hermetisch afgesloten is (Figuur 3).
   OPMERKING: Hier werd een cilindrische plastic container (afmeting 1 liter) met een schroefdeksel gebruikt om de kamer te bouwen. Zorg ervoor dat de container groot genoeg is voor de CV's die nodig zijn voor het experiment. Om meer CV's in dezelfde ruimte te behandelen, kunnen kunststof platformen op elkaar worden gestapeld (Figuur 3A).
2. Voor de voorbereiding van de borrelkamer (zie punt 3.2) boort u een gat in de dop van een kolf met een standaard mechanische boor waarvan de boor iets kleiner is dan de buis, en steekt u een plastic buis door het gat in de kolf. Dicht het gat af met parafilm om de hermetische afdichting te behouden (Figuur 3B).
3. Steriliseer de container en de kolf met 70% ethanol en bestraal ze gedurende één cyclus met ultraviolet licht voordat u ze gebruikt.

3. Zuurstof-glucosetekort (OGD)

OPMERKING: Het protocol voor OGD is een bewerking van Tasca et ^al.7

1. Bereid de OGD-oplossing met fosfaatoplossing (tabel 2) die eerder is aangevuld met antibiotica.
   OPMERKING: Gebruik voor elke plaat van 35 mm 5 ml; Gebruik voor een plaat van 100 mm 10 ml.
2. Voeg de OGD-oplossing toe aan de borrelkamer (figuur 3B) en plaats deze in een waterbad (al voorverwarmd bij 37 °C). Sluit de kolf aan op de stikstofbron (N₂, 100%).
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat, omdat de OGD-oplossing HEPES als buffer bevat, er geen CO₂ nodig is. Als de OGD-oplossing is gebaseerd op een bicarbonaatbuffersysteem, gebruik dan 5% CO₂ en 95% N₂ om de hypoxische oplossing en kamer te verzadigen.
3. Verzadig de OGD-oplossing met zacht borrelende stikstof. Laat de oplossing 20-30 minuten in een licht borrelende toestand staan.
4. Breng de kolf onmiddellijk over naar de celkweekkap en voeg 5 ml OGD-oplossing zonder zuurstof toe in platen van 35 mm of 10 ml in kweekplaten van 100 mm.
5. Verplaats de CV's met de gekweekte cellen naar de platen met OGD. Zonder de platen af te dekken, verplaats ze naar de hypoxiekamer en sluit ze stevig maar voorzichtig.
   OPMERKING: Stap 3.4 en 3.5 moeten zo snel mogelijk worden voltooid. Onderhoud de controle-CV's (Neuronal Medium in normoxie) in de putplaten in de incubator. Als alternatief kunnen de controleneuronen worden blootgesteld aan het normoxische OGD-medium aangevuld met glucose (10 mM) om de effecten van hypoxie en glucosedeprivatie selectiever te onderzoeken.
6. Sluit het stikstofsysteem aan op de hypoxiekamer en controleer of de buisjes open zijn. Verzadig de kamer met N₂ gedurende een paar minuten bij een druk van 2-3 bar (bijv. 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) (Figuur 3C).
   OPMERKING: Vergeet niet om de OGD-oplossing opnieuw 15 minuten te bubbelen tussen meerdere tijdstippen.
7. Verlaag de stikstofdruk tot 1,3-1,5 bar en sluit beide buizen van de hypoxiekamer (Figuur 3C). Laat de kamer gedurende de vereiste tijd (bijv. 60 min) bij 37 °C in de broedmachine staan, 5% CO₂.
   OPMERKING: De duur van OGD moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de experimentele omstandigheden en de onderzoeksdoelen. Een korte incubatietijd (bijv. 30 minuten) zou milde hypoxie simuleren. Twee uur OGD is meestal erg hard voor de neuronen. Het wordt aanbevolen om een OGD-duur van 45 tot 90 minuten te testen voordat met het onderzoek wordt begonnen. Natuurlijk zal de duur van de OGD van invloed zijn op de totale overleving en het relatieve begin van neuronale dood na herstel van OGD. Als het doel is om neuronale dood in realtime te analyseren, streef dan naar OGD-condities die een paar uur na herstel van OGD celdood zouden veroorzaken voor een effectievere analyse.
8. Open de kamer en verplaats de CV's naar hun originele multiwell-plaat voor herstel. Overweeg na deze stap twee alternatieven: 1) ga voor kleinschalige experimenten verder naar sectie 4 voor immunofluorescentie en beeldanalyse; 2) Ga voor screening met een hoog gehalte naar sectie 5 voor de analyse in de celanalysator (of een gelijkwaardig platform).
   OPMERKING: Live beeldvorming biedt een flexibelere aanpak omdat het real-time monitoring van de verschillende experimentele punten mogelijk maakt.

4. Analyse door standaard immunofluorescentie en ImageJ

OPMERKING: De hersteltijd kan variëren van 1 tot 24 uur, afhankelijk van de omstandigheden.

1. Was de neuronen met 1x PBS gedurende 10 minuten.
   OPMERKING: Deze stap is optioneel omdat er verschillende manieren zijn om verder te gaan en de afbeeldingen te analyseren.
2. Fixeer de neuronen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij RT. Was ze drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt.
   OPMERKING: Aangezien paraformaldehyde giftig is, moet u onder een chemische kap werken.
3. Permeabiliseer de neuronen door 1x PBS met 0,1% Triton X-100 toe te voegen gedurende 10 minuten. Was de cellen snel met 1x PBS. Herhaal de wasstap twee keer gedurende 10 minuten per wasbeurt.
4. Voeg 350 μL blokkeeroplossing (1x PBS met 2% runderserumalbumine) toe aan de CV's en laat ze minstens 30 minuten intrekken. Draai de primaire antilichaamvoorraad (AB) (5 × g gedurende 30 s) en meng deze met de blokkeeroplossing in de vereiste verdunning, bijv. anti-GFP bij 1:600.
   1. Breng de dekglaasjes over op parafilm in een bevochtigde kamer (een doos met met water doordrenkte tissue om de vochtigheid op peil te houden en verdamping te voorkomen). Afhankelijk van de grootte van de CV's, voeg je voorzichtig 60 of 80 μL van de primaire antilichaamverdunning toe aan elke CV en zorg je ervoor dat de cellen in contact komen met het antilichaam. Incubeer de CV's o/n bij 4 °C.
      OPMERKING: Er moet zich een druppel op het CV-oppervlak vormen die het hele CV-oppervlak bedekt. Vermijd het verstoren van de cellen tijdens het pipetteren van de antilichaamoplossing op de CV's. De incubatietijd kan worden verkort tot 2 uur bij RT.
5. Was de CV's met 1x PBS gedurende 10 minuten over de parafilm. Herhaal de wasstap twee keer.
6. Verdun de secundaire AB, bijv. Alexa 488 (1:500) en 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:2,000) in blokkeeroplossing. Afhankelijk van de grootte van de CV's, voeg je een druppel van 60-80 μL van de secundaire AB-oplossing toe aan de cellen. Incubeer de CV's gedurende 1 uur in het donker bij RT. Was de secundaire AB en DAPI van de neuronen met 1x PBS gedurende 10 minuten en herhaal deze stap twee keer.
7. Monteer de CV's in montagemedium (zie de materiaaltabel) voor immunofluorescentieanalyse en bewaar ze na droging in het donker bij 4 °C.
8. Beeldopname en -analyse.
   OPMERKING: Een omgekeerde microscoop werd gebruikt om de beelden op 20x te maken (Figuur 4A, zie de Materiaaltabel).
   1. Gebruik de open-source ImageJ-software om de afbeeldingen te analyseren en het masker voor het GFP-kanaal te verkrijgen (Afbeelding 4C).
      OPMERKING: Er zijn verschillende manieren om de neuronen in beeld te brengen en te analyseren, afhankelijk van de beschikbaarheid van apparatuur en het experimentele formaat. De volgende workflow wordt gegeven als een basisvoorbeeld waarbij het doel is om de soma van individuele GFP-expressie neuronen in de afbeelding te identificeren. De specifieke waarden die hier worden gepresenteerd, zoals de drempelwaarde en deeltjesgrootte, moeten door de gebruiker worden getest op basis van hun specifieke experimentele omstandigheden. Daarnaast kunnen er verschillende filters en verwerkingsstappen worden toegevoegd. De ImageJ-filters Achtergrond aftrekken en Spikkels helpen bijvoorbeeld vaak bij het opschonen van de afbeelding aan het begin van de verwerking. Optimalisatie van de workflow voor specifieke experimentele omstandigheden vereist eerdere ervaring in beeldanalyse en de kennis van de basisconcepten van kwantitatieve beeldanalyse. Aangezien een uitgebreide gids over beeldanalyse buiten het bereik van het huidige protocol valt, raden we de volgende bronnen aan: ImageJ-gebruikershandleiding, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Voor voorbeelden en tutorials kunt u https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; MBF ImageJ-bundel, https://imagej.net/mbf/index.htm.
   2. Selecteer voor segmentatie de intensiteitssegmentatie met de nodige parameters om de soma te isoleren, het helderste gebied van de neuronen.: Menu | Afbeelding | Aanpassen | Drempel | Stel min-drempel in (bijvoorbeeld 100) | klik op Toepassen.
   3. Herhaal de drempel uit 4.8.2. naar alle afbeeldingen om het masker (d.w.z. de gesegmenteerde afbeelding) te zien voor de soma's van de neuronen (Figuur 4E).
   4. Als u het aantal overgebleven cellen in elke afbeelding wilt ophalen en de resultaten wilt exporteren naar een werkblad om berekeningen uit te voeren, selecteert u Menu | Analyseren | Analyseer deeltjes en voer de benodigde parameterwaarden in (bijv. Grootte: 50-oneindig pixel; Circulariteit: 0,5-1,00). Bedenk dat bij t = 0 uur het aantal getelde cellen het totale aantal geïdentificeerde cellen is, en bereken het percentage cellen dat op de verschillende tijdstippen heeft overleefd.
      OPMERKING: Een lagere groottedrempel is handig voor het uitfilteren van kleinere objecten dan de soma (bijv. 60-80 μm²).
   5. Gebruik de functie Macro opnemen van ImageJ om de analyse te automatiseren en te herhalen: Menu | Plug-ins | Macro's | Verslag | klik op Maken om de macro te genereren.

5. Real-time analyse met IN Cell Analyzer 2200

1. Plaats de plaat met 12 putjes in de celanalysator, sluit het CO₂ -systeem aan en stel de temperatuur in op 37 °C.
   OPMERKING: Deze stap kan eenvoudig worden opgeschaald in dit platform, door een soortgelijk experiment uit te voeren met neuronen die zijn geplateerd in een plaat met 96 putjes.
2. Selecteer het 20x-objectief, selecteer willekeurig 5 velden per putje (die in dit voorbeeld 2,33% van het putje beslaan) en stel ze automatisch scherp voor elk fluorescentiekanaal (fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC] in dit geval). Selecteer de parameters van de acquisitie (30 min time-lapse gedurende 16 uur). Druk op Start en wacht.
   OPMERKING: Het aantal beeldvormingsvelden moet worden bepaald door de onderzoeker en moet voldoende zijn om rekening te houden met de variabiliteit in een enkele put.
3. Gebruik IN Cell Developertoolbox v1.9 om de juiste werkstroom voor analyse in te stellen.
4. Analyseer de neuronbeelden (FITC-kanaal) om een masker te genereren voor de soma van de neuronen (Figuur 4).
   OPMERKING: Het doel is om de soma van individuele neuronen in de afbeelding te identificeren. Deze analyse volgt stappen die gelijkwaardig zijn aan de stappen die worden beschreven in sectie 4 voor ImageJ. Raadpleeg sectie 4 voor de workflow en algemene overwegingen. De intensiteitsdrempel wordt bepaald om de soma te selecteren, het helderste gebied van de neuronen.
   1. Selecteer voor segmentatie de Intensiteitssegmentatie met de nodige parameters (in dit geval een minimumdrempel van 20005,40).
   2. Selecteer voor nabewerking de optie Zeef , waarbij u doelen behoudt met een gebied dat groter is dan een vooraf bepaalde waarde (hier 189 pixels (~80 μm²)).
   3. Selecteer de parameter Som om om alle neuronen te tellen en op te tellen die in het masker zijn geïdentificeerd (overlevende neuronen) voor elk veld en voor alle velden van een put op elk tijdstip van het tijdsverloop.
   4. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet. Bereken bij t = 0 uur dat het aantal getelde cellen het totale aantal geïdentificeerde cellen is en bereken het percentage cellen dat op de verschillende tijdstippen heeft overleefd. Bereken de tijd waarop 50% van de cellen dood zijn om de vergelijking tussen de omstandigheden te vergemakkelijken.
      OPMERKING: De parameters voor de segmentatie- en nabewerkingsstappen moeten door de gebruiker worden aangepast voor verschillende fluorescerende kanalen, afhankelijk van de te identificeren structuren.

Resultaten

Dit protocol heeft tot doel een in vitro model van een beroerte op te stellen. Het is belangrijk om een adequate neuronale dichtheid te verkrijgen, waardoor individuele geëlektropoleerde neuronen kunnen worden herkend om ze afzonderlijk te analyseren. Het stadium van de neuronale cultuur na het plateren is ook cruciaal. De rijping van neuronen in cultuur is progressief. De afhankelijkheid van groeifactoren, neurietuitgroei, connectiviteit en elektrofysiologische activiteit zal s...

Discussie

Dit protocol toont een effectieve manier om een streek in vitro te modelleren. Om dit doel te bereiken, hebben we voorgesteld om corticale neuronen schaars te labelen met behulp van het elektroporatiesysteem NEPA21⁵. Dit is een open systeem dat het mogelijk maakt om het protocol aan te passen met minimale operationele kosten in vergelijking met andere systemen die kits of specifieke apparaten gebruiken. Gemengde cultuur van naïeve en geëlektroporeerde neu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 cm petrischalen	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
3.5 cm petrischalen	Sterilin
75 cm2 kolf	Corning	430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
Celcultuur platen	Corning incorporation Costar®	3513
Cel-incubator	Thermo Electron Corporation	Model 371
Cel zeef 70 µm	Falcon	352350
Koudlichtlampen	Schott	223488	KL 1500 LCD
Dekglasjes (15 mm)	Marienfeld	111530
CU500 Cuvet Kamer	Nepa Gene
CU600 Cuvet Standaardhouder	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Dumont Fijne Pincetten	FST	11254-20
Dumont Fijne Pincetten	FST	11252-00
EC-002S NEPA Elektroporatie Cuvettes, 2mm gap	Nepa Gene
Filter zeef	Falcon	352350
Fijne schaar-scherp-blunts	FST	14028-10
Fijne schaar-ToughCut r	FST	14058-09
GFP kippen IgY	Aves Labs	GFP-1010	1:600
Glucose	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I Supplement 200 mM 100 mL	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
Paarden Serum	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Microscoopglaasje (polilysine)	VWR	631-0107	Afmeting: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	81381-250G
Naalden geel, 30 gauge	BD Microlance™ 3	304000
NEPA21 elektroporator	Nepa Gene
Neubauer kamer	Blau Brand	717805
Neurobasal Medium	ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Paraformaldehyde (PFA), 95%	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	158127-500G	Gebruik oplossing: 4%
PEI	Polysciences	23966-1
Plasmid voor GFP			pCMV-GFP-ires-Cre, beschreven in Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-Lysine	SIGMA	P2636
PS ( Penicilline, Streptomycine)	ThermoFisher	15140122
Gekartelde pincetten	FST	11152-10
Stereomicroscoop	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
Spuiten	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	MDL number: MFCD00128254	Non-ionisch
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25300054
Buizen 15 mL	Fisher	05-539-4
Buizen 50 mL	VWR	21008-242
Tupperware	-	-	Hermetische Tupperware met schroefdop. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Elke gelijkwaardige hermetische Tupperware kan in een supermarkt worden gekocht.
Waterbad	SHELDON LABORATORY MODEL 1224	1641951