Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca2 +-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62770

⸱

9 oktober 2021

 , 
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

In dit artikel

Samenvatting

ANS bindt aan het Ca2+-ATPase recombinant N-domein. Fluorescentiespectra vertonen een FRET-achtig patroon bij excitatie bij een golflengte van 295 nm. NBS-gemedieerde chemische modificatie van Trp dooft de fluorescentie van het N-domein, wat leidt tot de afwezigheid van energieoverdracht (FRET) tussen het Trp-residu en ANS.

Samenvatting

Het sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is een P-type ATPase dat in verschillende conformaties is gekristalliseerd. Gedetailleerde functionele informatie kan niettemin worden verkregen uit geïsoleerde recombinante domeinen. Het engineered (Trp552Leu en Tyr587Trp) recombinant nucleotide-binding domein (N-domein) geeft fluorescentie doven bij ligandbinding weer. Een extrinsieke fluorofoor, namelijk 8-anilino-1-naftaleensulfonaat (ANS), bindt aan de nucleotide-bindingsplaats via elektrostatische en hydrofobe interacties met Arg,His, Ala, Leu en Phe residuen. ANS-binding blijkt uit de toename van de fluorescentie-intensiteit bij aangeslagen bij een golflengte (λ) van 370 nm. Bij een geëxt excitedie bij λ van 295 nm lijkt de toename van de fluorescentie-intensiteit echter gekoppeld te zijn aan het uitdoven van de intrinsieke fluorescentie van het N-domein. Fluorescentiespectra vertonen een Föster resonantie energieoverdracht (FRET)-achtig patroon, wat de aanwezigheid van een Trp-ANS FRET-paar suggereert, dat lijkt te worden ondersteund door de korte afstand (~ 20 Å) tussen Tyr587Trp en ANS. Deze studie beschrijft een analyse van het Trp-ANS FRET-paar door Trp chemische modificatie (en fluorescentie doven) die wordt gemedieerd door N-bromosuccinimide (NBS). In het chemisch gemodificeerde N-domein nam de ANS-fluorescentie toe bij een λ van 295 nm, vergelijkbaar met bij een λ van 370 nm. Daarom kan de NBS-gemedieerde chemische modificatie van het Trp-residu worden gebruikt om de afwezigheid van FRET tussen Trp en ANS te onderzoeken. Bij afwezigheid van Trp-fluorescentie mag men geen toename van ANS-fluorescentie waarnemen. De chemische modificatie van Trp-residuen in eiwitten door NBS kan nuttig zijn voor het onderzoeken van FRET tussen Trp-residuen die dicht bij de gebonden ANS liggen. Deze test zal waarschijnlijk ook nuttig zijn bij het gebruik van andere fluoroforen.

Inleiding

Föster resonantie energieoverdracht (FRET) is een standaardtechniek geworden voor het bepalen van de afstand tussen moleculaire structuren na binding of interactie in eiwitstructuur en functiestudies1,2,3,4. In P-type ATPases is FRET gebruikt om de structuur en functie van het sarco-endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8te onderzoeken, bijvoorbeeld structurele fluctuaties tijdens de katalytische cyclus zijn geanalyseerd in het hele eiwit door FRET7.

FRET-donoren zijn divers en variëren van kleine fluorescerende (extrinsieke) moleculen tot fluorescerende eiwitten9,10. Tryptofaan (Trp) residuen (vanwege hun fluorescentie) zijn nuttig voor het identificeren van structurele veranderingen in eiwit aminozuursequenties11,12. De fluorescentie-intensiteit van Trp hangt sterk af van de polariteit van zijn omgeving13,14. Ligandbinding genereert meestal structurele herschikkingen in eiwitten /enzymen15,16. Indien Trp aanwezig is op of zich dicht bij de eiwitbindende plaats bevindt, hebben structurele fluctuaties vaak invloed op de mate van blootstelling van Trp aan waterige media13,14; de verandering in polariteit resulteert dus in het doven van de Trp-fluorescentie-intensiteit13,14. Daarom is de fluorescerende eigenschap van Trp nuttig voor het uitvoeren van ligandbindende studies voor enzymen. Andere fysische verschijnselen kunnen ook leiden tot Trp-fluorescentie die17,18,19,20dooft, bijvoorbeeld FRET en veranderingen in mediumpolariteit. Energieoverdracht van de aangeslagen toestand van Trp naar een fluorofoor heeft ook potentiële toepassingen, bijvoorbeeld affiniteitsbepaling van kleine liganden in eiwitten21. Trp is inderdaad voornamelijk gebruikt als fluorescentiedonor in FRET-studies in eiwitten22,23,24,bijvoorbeeld in terbium (Tb3+) FRET-studies wordt een Trp-residu vaak gebruikt als antenne voor energieoverdracht naar Tb3+25,26,27. Trp vertoont verschillende voordelen ten opzichte van andere FRET-donoren vanwege het inherente constitutieve karakter in de eiwitstructuur, waardoor de noodzaak voor preparatieve processen die de functie / structuur van het bestudeerde eiwit kunnen beïnvloeden, wordt weggestemd24. De identificatie van stralingsverval (energieoverdracht en veranderingen in de mediumpolariteit die worden geïnduceerd door eiwit structurele herschikkingen) is dus belangrijk voor het trekken van nauwkeurige conclusies met betrekking tot ligandbinding in eiwitconstructiestudies13,14,19,28.

In eiwit structurele studies, een extrinsieke fluorofoor, namelijk, 8-anilino-1-naftaleensulfonaat (ANS), is voornamelijk gebruikt in experimenten met betrekking tot eiwitvouwing / ontvouwen28,29. ANS bindt aan eiwitten/enzymen in de oorspronkelijke toestand, meestal op de bindingsplaatsen van substraten31,32,33; een toename van de ANS-fluorescentie kwantumopbrengst (ΦF) (namelijk een toename van de fluorescentie-intensiteit) wordt geïnduceerd door het eiwit te excitingn bij λ = 370 nm wanneer geschikte interacties van ANS met Arg en zijn residuen in hydrofobe pockets optreden34,35,36,37. In verschillende studies is het voorkomen van FRET (bij opwinding bij λ binnen 280-295 nm) tussen Trp-residuen (donoren) en ANS (acceptor) gemeld, wat gebaseerd is op het volgende: 1) overlap van het fluorescentie-emissiespectrum van Trp en excitatiespectrum van ANS, 2) identificatie van een geschikte afstand tussen een of meer Trp-residu('s) en ANS voor energieoverdracht, 3) hoge ANS-kwantumopbrengst bij gebonden in eiwitzakken, en 4) karakteristiek FRET-patroon in de fluorescentiespectra van het eiwit in aanwezigheid van ANS3,17,27,37,38.

Onlangs is ligandbinding aan het nucleotide-bindende domein (N-domein) in SERCA en andere P-type ATPasen onderzocht met behulp van engineered recombinantN-domeinen 40,41,42,43,44,45,46. Moleculaire engineering van het SERCA N-domein is gebruikt om het enige Trp-residu (Trp552Leu) te verplaatsen naar een meer dynamische structuur (Tyr587Trp) die dicht bij de nucleotide-bindingsplaats ligt, waar fluorescentievariaties (blussen) kunnen worden gebruikt om structurele veranderingen bij ligandbinding te volgen34. Experimentele resultaten hebben aangetoond dat ANS bindt (als ATP) aan de nucleotide-bindingsplaats in het gezuiverde recombinante SERCA N-domein34. Interessant is dat de ANS-fluorescentie toeneemt bij binding aan het N-domein bij excitatie bij een λ van 295 nm, terwijl de intrinsieke fluorescentie van het N-domeinafneemt 34, waardoor een FRET-patroon ontstaat dat de vorming van een Trp-ANS FRET-paar suggereert.

Het gebruik van NBS is voorgesteld om het gehalte aan Trp-residuen in eiwitten47 te bepalen door middel van absorptietest van gemodificeerde eiwitten. NBS wijzigt de sterk absorberende indoolgroep van Trp naar de minder absorberende oxindole47,48. Dit resulteert in het verlies (doven) van de Trp fluorescerende eigenschap40. Daarom kan NBS-gemedieerde chemische modificatie van Trp-residuen worden gebruikt als een test om de rol van Trp (als donor) te definiëren wanneer FRET wordt verondersteld.

Dit protocol beschrijft de chemische modificatie van het enige Trp-residu door NBS in het engineered recombinant N-domein van SERCA als eiwitmodel. Experimentele resultaten tonen aan dat de ANS-fluorescentie-intensiteit nog steeds toeneemt in het chemisch NBS-gemodificeerde N-domein34, dat intrinsieke fluorescentie mist. Daarom is de test nuttig om de afwezigheid van FRET tussen het Trp-residu en ANS aan te tonen wanneer deze gebonden is aan het N-domein34,40,49. Vandaar dat deze test (NBS chemische modificatie van Trp) nuttig is bij het bewijzen van de aanwezigheid van het Trp-ANS FRET-paar in eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bepaling (in silico) van de ANS en SERCA N-domein interactie

  1. Genereer een driedimensionale (3D) structuur van het eiwit (SERCA N-domein) door moleculaire modellering met behulp van de voorkeurs eiwitmodelleringssoftware50.
  2. Identificeer de aminozuurresiduen die de nucleotide-bindende site vormen met behulp van de voorkeursmoleculaire structuursoftware51en bepaal de aanwezigheid van Arg- en Lys-residuen35; deze zijn nodig voor ANS-binding en om de fluorescentie-intensiteit (quantum yield) te verhogen.
  3. Voer moleculaire docking uit (met behulp van de voorkeursdockingsoftware)52,53,54 om de interacties van ATP, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (dat een covalente binding vormt met Lys515 die de nucleotide-bindende site labelt) en ANS met aminozuurresiduen in de nucleotide-bindingsplaats te bepalen ( Figuur1).
  4. Bereken de moleculaire afstand (Å) tussen Trp-residu en gebonden ANS met behulp van het meetinstrument in de gewenste software.
  5. Uitvoeren van moleculaire dynamica simulatie van ANS-N-domein complex om de stabiliteit van de interactie te bepalen52,54. Voer vervolgens de in vitro experimenten uit wanneer de stabiliteit van het complex is bevestigd.

2. Expressie en zuivering van het recombinante N-domein

  1. Synthetiseer het gen dat codeert voor N-domein40.
  2. Ontwerp en construeer het plasmide dat het synthetische gen bevat dat codeert voor het N-domein40.
  3. Uitdrukken en zuiveren door affiniteitschromatografie (Ni-NTA), het gemanipuleerde recombinante N-domein. Voer een SDS-PAGE uit van het gezuiverde eiwit om de zuiverheid te bepalen (Figuur 2)40.
  4. Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij λ van 280 nm te bestuderen met de N-domein extinctiecoëfficiënt (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.

3. Monitor de vorming van het ANS-N-domeincomplex op basis van ANS- en N-domein fluorescentie-intensiteitsveranderingen.

  1. Bereid een ANS-stamoplossing in N,N-dimethylformamide.
    1. Weeg een kleine hoeveelheid (1-5 mg) ANS af en los deze op in 1 ml van het uiteindelijke volume N, N-dimethylformamide, bijvoorbeeld 3,2 mg (10,69 mM eindconcentratie).
    2. Bereid een 100 μM ANS-waterige stamoplossing met behulp van de ANS-oplossing in N,N-dimethylformamide, voeg bijvoorbeeld 9,4 μL van de 10,69 mM ANS-oplossing toe aan 990,6 μL van 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
    3. Meng de oplossingen door 3 - 5 keer gedurende 15 s te vortexen.
      OPMERKING: Gebruik in het volgende experiment alleen de ANS-waterige stamoplossing. Bereid de ANS-waterige stamoplossing vers voordat u de experimenten start.
  2. Bereid de NBS-stamoplossing in N,N-dimethylformamide.
    1. Weeg een kleine hoeveelheid (1-5 mg) NBS af en los deze op in 1 ml N,N-dimethylformamide, bijvoorbeeld 5,3 mg in 1 ml (29,78 mM eindconcentratie).
    2. Bereid een NBS-waterige stamoplossing van 1 mM met behulp van de NBS-oplossing in N,N-dimethylformamide, voeg bijvoorbeeld 3,36 μL van de NBS-oplossing van 29,78 mM toe aan 96,64 μL 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 om een eindvolume van 0,1 ml te verkrijgen.
    3. Meng de oplossingen door 3 - 5 keer gedurende 15 s te vortexen.
      OPMERKING: Bereid de NBS-waterige stamoplossing vers voordat u met de experimenten begint.
  3. Titreer het N-domein met ANS en noteer de fluorescentiespectra door excitatie bij λ=295 nm bij 25 °C.
    1. Verkrijg de basislijn van het fluorescentiespectrum.
      1. Plaats 1 ml 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 in een fluorescentiekwartscuvette van 1 ml.
      2. Plaats de cel in de thermo-aangegeven celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.
      3. Registreer het fluorescentiespectrum (305 - 550 nm).
        OPMERKING: Het fluorescentiespectrum van de 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0, die als blancomonster dient, wordt afgetrokken van alle verkregen fluorescentiespectra.
    2. Verkrijg het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein.
      1. Plaats 900 μL 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 in een fluorescentiekwartscuvet.
      2. Voeg 100 μL N-domein (10 μM) suspensie toe om een eindconcentratie van 1 μM N-domein te verkrijgen in een eindvolume van 1 ml.
      3. Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette 20 keer om de homogeniteit van de oplossing te garanderen.
        OPMERKING: Het eiwit moet vers worden gezuiverd om hoogwaardige intrinsieke fluorescentiespectra te verkrijgen, bijvoorbeeld het gezuiverde recombinante N-domein mag slechts een week na zuivering worden gebruikt.
      4. Plaats de cel in de thermo-aangegeven celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.
      5. Registreer het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein (305-550 nm).
    3. Voeg ANS toe en verkrijg het fluorescentiespectrum door excitatie bij λ=295 nm.
      1. Voeg een aliquot van 2 μL van 100 μM ANS-waterige stamoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein (1 μM) om een ANS-eindconcentratie van 0,2 μM te verkrijgen.
      2. Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette 20 keer om de homogeniteit van de oplossing te garanderen.
      3. Plaats de cel in de thermostabiele celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.
      4. Registreer het fluorescentiespectrum (305-550 nm).
      5. Herhaal de ANS-toevoegingen en fluorescentiespectra-registratie boven 1:1 molaire relatie ANS:N-domein.
      6. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.
      7. Zet alle spectra in één grafiek.
      8. Bepaal of de spectra een FRET-achtig patroon vormen. De ANS-N-domein fluorescentiespectra vormen een FRET-achtig patroon (Figuur 3A).

4. Intrinsieke fluorescentietitratie van het N-domein door chemische modificatie van Trp met NBS.

  1. Herhaal stap 3.3.1 en 3.3.2.
  2. Voeg een aliquot van 1 μL van 1 mM NBS-waterige stamoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein (1 μM) om een eindconcentratie van 1 μM NBS te verkrijgen.
  3. Homogeniseren voorzichtig door 20 keer een micropipette te gebruiken om de homogeniteit van de oplossing te garanderen.
  4. Plaats de cel in de thermostabiele celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.
  5. Registreer het fluorescentiespectrum (305-550 nm) (figuur 3B).
  6. Herhaal de NBS-additie en fluorescentiespectraregistratie totdat minimale intrinsieke fluorescentie-uiting van het N-domein wordt waargenomen40. In het N-domein gebeurt dit meestal bij een molaire verhouding van 5-6 NBS/N-domein40.
    OPMERKING: NBS dooft snel (<5 s) de intrinsieke fluorescentie van het N-domein; een afname van de fluorescentie-intensiteit wordt waargenomen. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap, omdat NBS ook kan reageren met andere aminozuurresiduen47.
  7. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.
  8. Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3B).

5. Titreer het NBS-gemodificeerde N-domein met ANS door fluorescentiespectra bij 25 °C te registreren.

  1. Voer stap 3.3.3 uit met het door NBS gewijzigde N-domein dat is gegenereerd in stap 4.
  2. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.
  3. Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3C).
  4. De gegenereerde fluorescentiespectra (figuur 3C) ondersteunen of weerleggen het optreden van FRET, d.w.z. wanneer FRET optreedt, neemt de ANS-fluorescentie niet toe en vice versa.

6. Bewijs van ANS-binding aan het chemisch gemodificeerde N-domein door excitatie bij λ=370 nm.

  1. Voer stap 3.3.3 uit met behulp van het nbs-gewijzigde N-domein dat is gegenereerd in stap 4, maar wijzig de excitatie λ in 370 nm.
  2. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.
  3. Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3D).
  4. Bevestig de ANS-binding aan het N-domein door de toename van de ANS-fluorescentie-intensiteit te observeren. ANS-binding aan het N-domein toont een fluorescentietoename bij aantname bij λ=370 nm (Figuur 3D). Ter controle werd het fluorescentiespectrum van ANS (alleen) in 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 opwindend verkregen bij λ van 295 en 370 nm(figuur 4, niet weergegeven in video).
    OPMERKING: De stoichiometrische relatie van NBS:Trp die nodig is voor chemische modificatie is afhankelijk van de mate van begraven van de Trp-residu(en) in het onderzochte eiwit46,47,55,56. Daarom wordt aanbevolen om vooraf de NBS:eiwit/(Trp) molaire verhouding te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Moleculaire docking toont de binding van ANS aan de nucleotide-bindingsplaats van het N-domein via elektrostatische en hydrofobe interacties (Figuur 1). Moleculaire afstand (20 Å) tussen het Trp-residu en ANS (gebonden aan de nucleotide-bindingsplaats) ondersteunt het optreden van FRET(figuur 1). Het ontworpen (engineered) recombinante N-domein werd bij hoge zuiverheid verkregen door affiniteitschromatografie (figuur 2) en was gesch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Fluorescentiespectra van het ANS-N-domeincomplex vertonen een FRET-achtig patroon wanneer ze worden geëxtteerd bij een λ van 295 nm, terwijl de moleculaire afstand (20 Å) tussen het Trp-residu en ANS het optreden van FRET lijkt te ondersteunen (figuur 1). Trp chemische modificatie door NBS resulteert in een minder fluorescerend N-domein (Figuur 3B, Spectrum f); daarom is energieoverdracht niet mogelijk. De ANS-fluorescentiespectra zijn vergelijkbaar met die van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door FAI-UASLP-subsidienummer C19-FAI-05-89.89 en CONACYT-subsidienummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). De auteurs bedanken de technische assistentie van Julian E. Mata-Morales in video-editie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcrylamideBio-Rad1610107SDS-PAGE
AmmoniumpersulfaatBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naftaleensulfonzuurSigma-AldrichA1028Fluorofoor
Bis-acrylamideBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemische modificatie
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker9213-12Stockoplossingvoorbereiding
Fluoresceïne-isothiocyanaatSigma-AldrichF7250Chemische fluorescentielabel
FluorescentiecuvetHellmaZ801291Fluorescentietest
FluorescentiespectrofluorometerShimadzuRF 5301PCFluorescentietest
HisTrap® FFGE Healtcare11-0004-59Eiwitzuivering
IPTG, vrij van dioxaanAmerican BionalyticalAB00841-00010Eiwitexpressie
ImidazoolSigma-AldrichI5513-25GEiwitzuivering
LB-mediumFisher Scientific10000713Celcultuur
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescentietest
Pipetman L P100LGilsonFA10004MFluorescentietest
Pipetman L P200LGilsonFA10005MFluorescentietest
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MFluorescentietest
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Fluorescentietest
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
NatriumdodecylsulfaatBio-Rad1610302SDS-PAGE
Natriumfosfaat dibasischJ.T. Baker3828-19Buffervoorbereiding
Natriumfosfaat monobasischJ.T. Baker3818-01Buffervoorbereiding
Spuitfilter 0,2 µmMilliporeGVWP04700Oplossingsfiltratie
TemedBio-Rad1610801SDS-PAGE
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE
```

Referenties

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

TryptofaanmodificatieANS bindingFRET assayN broomsuccinimide quenchingSERCA N domeinfluorescentiespectroscopieeiwitfluorescentie quenchingmoleculaire dockingATP bindingsplaatszuivering van recombinant eiwit
Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca2 +-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.