Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Samenvatting

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Samenvatting

De structuur van het darmweefsel vergemakkelijkt nauwe en mutualistische interacties tussen de gastheer en de darmmicrobiota. Deze kruisbesprekingen zijn van cruciaal belang voor het behoud van lokale en systemische homeostase; veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota (dysbiose) associëren met een breed scala aan menselijke ziekten. Methoden voor het ontleden van gastheer-microbiota-interacties omvatten een inherente afweging tussen het behoud van fysiologische weefselstructuur (bij gebruik van in vivo diermodellen) en het niveau van controle over de experimentfactoren (zoals in eenvoudige in vitro celkweeksystemen). Om deze afweging aan te pakken, ontwikkelden Yissachar et al. onlangs een darmorgaancultuursysteem. Het systeem behoudt een naïeve colonweefselconstructie en cellulaire mechanismen en het maakt ook strakke experimentele controle mogelijk, waardoor experimenten mogelijk zijn die niet gemakkelijk in vivokunnen worden uitgevoerd . Het is optimaal voor het ontleden van kortetermijnreacties van verschillende darmcomponenten (zoals epitheliale, immunologische en neuronale elementen) op luminale verstoringen (waaronder anaerobe of aerobe microben, hele microbiotamonsters van muizen of mensen, geneesmiddelen en metabolieten). Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een geoptimaliseerd protocol voor orgaancultuur van meerdere darmfragmenten met behulp van een op maat gemaakt darmcultuurapparaat. Gastheerreacties op luminale verstoringen kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring van weefselsecties of weefselfragmenten met hele montering, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of time-lapse-beeldvorming. Dit systeem ondersteunt een breed scala aan uitlezingen, waaronder next-generation sequencing, flow cytometrie en verschillende cellulaire en biochemische assays. Over het algemeen ondersteunt dit driedimensionale orgaancultuursysteem de cultuur van grote, intacte darmweefsels en heeft het brede toepassingen voor hoge resolutie analyse en visualisatie van gastheer-microbiota interacties in de lokale darmomgeving.

Inleiding

De darm is een zeer complex orgaan dat een breed scala aan celtypen bevat (epitheelcellen, cellen van het immuunsysteem, neuronen en meer) georganiseerd in een bepaalde structuur die cellen in staat stelt om met elkaar en met het luminale gehalte (microbiota, voedsel, enz.) te communiceren en te communiceren. ¹. Momenteel omvat de onderzoekstoolbox die beschikbaar is voor het analyseren van gastheer-microbiota-interacties in vitro celculturen en in vivo diermodellen². In vivo diermodellen bieden een fysiologische weefselconstructie^3, maar met slechte experimentele controle en beperkt vermogen om de experimentomstandigheden te manipuleren. In vitro kweeksystemen daarentegen gebruiken primaire cellen of cellijnen die kunnen worden aangevuld met microben⁴, die strakke controle bieden over de experimentparameters, maar de cellulaire complexiteit en de weefselarchitectuur missen. Moderne in vitro assays maken het geavanceerde gebruik van gezonde en pathologische menselijke weefselmonsters mogelijk, zoals epitheliale organoïden afgeleid van muis of menselijke bronnen^5,6, en monsters die het mucosale micromilieu nabootsen⁷. Een ander voorbeeld is de 'gut on a chip'-test, die de menselijke colonische epitheelcellijn (Caco2), extracellulaire matrix en microfluïdische kanalen omvat om de fysiologische toestand van de darm invariant⁸na te bootsen . Hoe geavanceerd en innovatief in vitro monsters ook mogen zijn, ze behouden geen normale weefselarchitectuur of naïeve cellulaire samenstelling.

Om dat aan te pakken, ontwikkelden Yissachar et al. onlangs een ex vivo orgaankweeksysteem⁹ (figuur 1) dat intacte darmfragmenten ex vivobehoudt , profiterend van de voordelen van zowel in vivo als in vitro modellen. Dit ex vivo darmorgaankweeksysteem is gebaseerd op een op maat gemaakt kweekapparaat dat een multiplexed kweek van zes darmweefsels ondersteunt, waardoor experimentele ingangen onder vergelijkbare omstandigheden kunnen worden onderzocht terwijl de in- en uitgangen van het systeem worden gecontroleerd. Recente werken hebben aangetoond dat dit systeem waardevol is voor het analyseren van darmreacties op individuele darmbacteriën⁹, hele menselijke microbiotamonsters¹⁰ en microbiële metabolieten¹¹. Dit systeem maakt voor het eerst de studie mogelijk van deze vroege gastheer-microbiota interacties met een hoog niveau van controle over de gastheer, microbiële en omgevingscomponenten. Bovendien maakt het het mogelijk om het systeem gedurende het hele experiment in realtime te volgen en te manipuleren.

Figuur 1: Schema's van het darmkweekapparaat. Een heel darmweefselfragment wordt bevestigd aan de output- en ingangspoorten van de kamer (boven), met pompen die de gemiddelde stroom in het lumen en in de externe middelgrote kamer regelen. Het hele apparaat (onder) bevat 6 van dergelijke kamers. Dit cijfer is aangepast van Yissachar et al. 2017. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging die zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenwelzijn.

1. Voorbereiding van experimenten

1. Fabricage van het darmorgaancultuurapparaat (3 dagen)
   1. Print met een 3D-printer de herbruikbare plastic mallen voor het orgaancultuurapparaat (het apparaat heeft 6 putten, met 24 kleine en grote gaten en voor het deksel van het apparaatdeksel) (3D-bestanden bevestigd).
      OPMERKING: Deze plastic mallen kunnen worden gebruikt voor de vervaardiging van tal van apparaten.
   2. Plaats de stompe naalden (22 G & 18 G) in de juiste positie in de vorm van het apparaat en giet ongeveer 20 g polydimethylsiloxaan (PDMS) mix (1:10 gewichtsverhouding, basis tot katalysator) voor één set van het apparaat en deksel.
   3. Plaats de mallen gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen uit de PDMS-mix te verwijderen.
   4. Incubeer de mallen 's nachts bij 55 °C om PDMS-polymerisatie te voltooien.
   5. Wanneer het PDMS is ingesteld, trekt u de naalden uit de mal en laat u het kweekapparaat en deksel voorzichtig los van de plastic mallen.
   6. Verwijder PDMS-residuen uit de putcontour met behulp van een chirurgisch mes. Bevestig het PDMS-apparaat en de deksel van het apparaat op een afdekglas (75 mm x 50 mm microglijbanen) met behulp van niet-giftige siliconenlijm en laat de onderdelen 's nachts instellen (breng de lijm aan op de gladde kant van het apparaat).
   7. Plaats twaalf naalden van 22 G voor het lumen en twaalf naalden van 18 G voor de put. Bevestig alle naalden op hun plaats met siliconen en laat het 's nachts inzetten. Steek twee naalden van 18 G in het deksel van het deksel voor een goede luchtstroom in en uit het darmorgaankweekapparaat.
   8. Controleer alle naalden op lekkages met een met water gevulde spuit. Controleer of er geen lekkage is uit de putten door de putten met water te vullen.
   9. Leg twee chirurgische knopen op elke 22 G naald die verbonden zal zijn met de dikke darm. Plaats het apparaat en het deksel in een papieren zak van de autoclaaf en steriliseer in een autoclaaf.
2. Cultuurmedium (0,5 uur)
   1. Meng in een biologische kap het volgende (in 50 ml buis): 37 ml Gemodificeerd Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml KSR-serumvervanging, 1 ml B27-supplement, 0,5 ml N2-supplement, 0,5 ml hepes-buffer van 1 M EN 0,5 ml niet-essentiële aminozuren.
   2. Filter en bewaar het volledige medium op 4 °C.
3. Tubing en chirurgische gereedschapsvoorbereiding
   1. Snijd de juiste lengte buizen voor het ingangslumen, de ingangsput, het uitgangslumen en de uitvoerput (12 korte buizen en 12 lange buizen). Sluit een geschikte adapter aan op elke kant van de buis.
   2. Bereid de chirurgische hulpmiddelen voor: rechte schaar, 4x dunne tang en 2x scherpe tang.
   3. Plaats de buizen en het chirurgische gereedschap in een papieren zak van de autoclaaf en steriliseer ze met behulp van een autoclaaf.
4. Bereid de luminale input voor (gewenste stimulatie - bacteriën, ontlasting, medicijnen, enz.).
   1. Bepaal vóór het experiment de bacteriële belasting van de bacteriecultuur, door seriële verdunningen^12,en kweek onder aerobe en/of anaerobe omstandigheden.
   2. Verdun na het berekenen van de bacteriële belasting de bacteriële culturen in steriel weefselkweekmedium om de vereiste bacteriële concentratie te verkrijgen. Filter voor fecale monsters met een zeef van 100 μm.
      OPMERKING: Verdun de stof voor niet-bacteriële stimulatie (geneesmiddelen, metabolieten, enz.) tot de vereiste concentratie met behulp van het darmkweekmedium.

2. Voorbereiding van de experimentopstelling

1. Schakel in de couveuse van de orgelcultuur de verwarmingseenheid in en zet deze op 37 °C.
2. Stel de pompen en de in- en uitgangsspuiten in.
3. Weefselkweek medium input
   1. Vul in een biologische of laminaire stromingskap de spuitspuiten van de ingangsput met een compleet kweekmedium. Het uiteindelijke volume is afhankelijk van de duur van het experiment en het debiet; meestal 1 ml/h plus extra medium voor zuivering.
   2. Sluit de buizen aan op de spuiten met behulp van de Luer-lock adapter. Plaats de gevulde spuiten in de spuitpompen.
   3. Reinig de invoerspuiten. Zorg ervoor dat het putmedium uit alle buizen in een afvalglas stroomt.
4. Luminal-ingang
   1. Vul de luminale ingangsspuiten met stimulatiebehandeling (bacteriën, medicijnen, enz.). Het volume is afhankelijk van de duur van het experiment en het debiet (meestal 30 μL/h plus extra medium voor zuivering).
   2. Sluit de buizen aan op de spuiten met behulp van de Luer-lock adapter. Plaats de gevulde spuiten in de spuitpompen.
   3. Zuiveringsspuiten. Zorg ervoor dat de stimulatie uit alle buizen in een afvalglas stroomt. Pas op dat u de verschillende stimulaties niet vervuilt.
5. Uitgangen
   1. Plaats de lege spuiten in de pomppompen van de uitgangsspuit (zet de pompmodus op 'terugtrekken').
6. Apparaat instellen
   1. Stel de regelaar in die het gasmengsel (95% O₂ + 5% CO₂₎regelt voor een zacht, minimaal debiet.
   2. Onderzoek het apparaat in een laminaire kap.
   3. Spoel de naalden van het apparaat door met steriel IMDM om de naalden te wassen.
   4. Voeg 500 μL steriel kweekmedium toe aan elke put van het apparaat.
7. Voorbereiding op weefseldissectie
   1. Doe het steriele chirurgische gereedschap in de laminaire kap.
   2. Vul een spuit van 10 ml met steriel IMDM en sluit een steriele (autoclaaf) 22 G stompe naald aan voor het doorspoelen van de dikke darm.

3. Orgelculturen

1. Muizenoffer en weefseldissectie
   1. Offer in een laminaire kap 12-14 dagen oude muizen op door onthoofding. Besproei de muizen met 70% ethanol en leg de muizen op een plastic plaat.
   2. Ontleed met een scherpe schaar en tang de muis en haal het spijsverteringskanaal van de maag naar de anus door al het vet- en bindweefsel te snijden. Snijd de dikke darm door en leg deze op een nieuw bord.
      OPMERKING: Minimaliseer het contact met het darmweefsel. Raak het middelste deel van het darmweefsel niet aan. Houd het weefsel voorzichtig en alleen aan de randen van het weefsel.
2. Colon flush en wassen
   1. Spoel onder een dissectiemicroscoop het colongehalte voorzichtig door met steriel IMDM (in de proximale zijde) met de voorbereide spuit van 10 ml (stap 2.7.2). Na het verwijderen van de uitwerpselen uit het darmweefsel, plaatst u de dikke darm in een nieuwe 6-putplaat gevuld met 0,5 ml steriel IMDM.
3. De dubbele punt op het apparaat aansluiten
   1. Neem het weefsel en sluit het voorzichtig aan op de 22 G naald en maak een strakke band met de twee draden. Op dit punt is het noodzakelijk om de juiste oriëntatie van de dubbele punt op de lumenstroom te behouden (proximaal = input, distaal = output). Herhaal stap 3.2-3.3 voor alle 6 weefsels.
   2. Controleer of de luervergrendelingen van de invoernaald leeg zijn vanaf het medium. Zo niet, maak ze dan leeg. Voeg stimulaties toe aan de ingangsnaald Luer lock (om te voorkomen dat luchtbellen in het lumen komen). Herhaal deze stap voor elke dikke darm met de juiste stimulatie.
   3. Controleer of alle weefsels met elkaar verbonden zijn en plaats het deksel op het apparaat.
4. Aansluiten van het orgaancultuurapparaat op de pompen
   1. Plaats het apparaat in de voorverwarmde temperatuurgeregelde kamer (37 °C).
5. Gasstroom aansluiten
   1. Sluit de gasadapter aan op het deksel met behulp van de juiste invoernaald.
   2. Sluit de in- en uitvoerbuizen aan op het apparaat.
      OPMERKING: Sluit de proximale dikke darmzijde aan op de invoerbaden.
6. Reinig het lumen met de stimulatie-ingangen.
   1. Vloei voorzichtig luminale stimulatie door de darm en controleer de gemiddelde stroom in de uitgangsbuizen.
   2. Was het externe medium.
   3. Was het externe medium 3 keer (zet de pompen op een snelheid van 600 μL/min voor zowel de in- als de uitgangsput). Elke wasbeurt duurt 1 minuut (te beginnen met het legen van de put).
7. Start het experiment.
   1. Start de pompen met de volgende tarieven:
      Debiet: lumen: input- 30 μL/h, output- 35 μL/h
      Extern medium: ingang- 1000 μL/h, output- 950 μL/h
      OPMERKING: De experimenteertijd kan variëren van 30 minuten tot 24 uur.
8. Einde experiment (tot 24 uur voor colon orgaanculturen)
   1. Koppel alle buizen los van het apparaat.
   2. Koppel de weefsels los van de naalden en ga verder met de gewenste uitlezingen.

Resultaten

Het darmorgaankweeksysteem behoudt de levensvatbaarheid van het weefsel ex vivo. De evaluatie van de levensvatbaarheid van het weefsel werd gedurende de hele kweekperiode uitgevoerd. Colonweefselfragmenten werden geïncubeerd in het darmorgaankweeksysteem en vastgesteld na 2/12/24 uur cultuur. De integriteit van de intestinale epitheelcel (IEC)-laag werd gevalideerd door immunofluorescentiekleuring met behulp van E-cadherine en cytokeratine-18 antilichamen. Evenzo werden met slijm gevulde bokaalcellen in het col...

Discussie

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor ex vivo darmorgaanculturen die Yissachar et al. onlangs hebben ontwikkeld (gepubliceerde⁹ en niet-gepubliceerde gegevens). Het darmorgaankweeksysteem ondersteunt multiplexed cultuur van intacte darmfragmenten met behoud van de luminale stroom. Het biedt volledige controle over de intra- en extra-luminale omgeving (inclusief stimulatiedosis, belichtingstijd en debiet) en behoudt de naïeve darmweefselstructuur en de cellulaire complex...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparaat
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxaan, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Chirurgische gereedschappen
Grote schaar	Aseltech	11-00-10
Scherpe pincet	F.S.T	11297-10
Zijde gevlochten chirurgisch draad	SMI	8010G
Rechte schaar	F.S.T	14091-09
Dunne pincet	F.S.T	11051-10
Orgaansysteem
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Spuitpomp	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em