Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62780

⸱

4 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.

Samenvatting

Extracellulaire blaasjes (EV's) worden in verschillende onderzoeken gebruikt om hun potentieel als celvrije behandeling te bewijzen vanwege hun lading afgeleid van hun cellulaire bron, zoals bloedplaatjeslysaat (PL). Bij gebruik als behandeling wordt verwacht dat EV's de doelcellen binnendringen en een reactie hiervan bewerkstelligen. In dit onderzoek zijn PL-afgeleide EV's bestudeerd als een celvrije behandeling voor artrose (OA). Zo werd een methode opgezet om EV's te labelen en hun opname op kraakbeenexplantaten te testen. PL-afgeleide EV's worden gelabeld met de lipofiele kleurstof PKH26, tweemaal door een kolom gewassen en vervolgens getest in een in vitro ontstekingsgestuurd OA-model gedurende 5 uur na deeltjeskwantificering door nanodeeltjesvolganalyse (NTA). Elk uur worden kraakbeenexplantaten gefixeerd, geparaffined, in secties van 6 μm gesneden om op dia's te monteren en waargenomen onder een confocale microscoop. Dit maakt het mogelijk om te verifiëren of EV's tijdens deze periode de doelcellen (chondrocyten) binnendringen en hun directe effect analyseren.

Inleiding

Artrose (OA) is een articulaire degeneratieve ziekte die een progressieve en onomkeerbare ontsteking en vernietiging van de extracellulaire matrix van het gewrichtskraakbeen impliceert1. Hoewel verschillende vormen van artritis tal van behandelingenhebben 2,3,4,worden deze beperkt door hun bijwerkingen en beperkte werkzaamheid. Tissue engineering technieken met behulp van autologe chondrocyten implantatie worden routinematig toegepast voor de regeneratieve behandeling van gewond kraakbeen in vroege OA kraakbeen laesies4. Celgebaseerde therapieën zijn voornamelijk beperkt vanwege het beperkte aantal fenotypisch stabiele chondrocyten of chondroprogenitors die in staat zijn om het kraakbeen effectief te repareren3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om ziekteprogressie te voorkomen en grote kraakbeenlaesies te regenereren van het grootste belang.

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn voorgesteld als een behandeling voor artrose door verschillende auteurs5,6. EV's zijn vliezige lichamen die door de meerderheid van de celtypen worden uitgescheiden, zijn betrokken bij intercellulaire signalering en er is aangetoond dat ze de therapeutische effecten van stamcellen uitoefenen7,8,9, waardoor ze onlangs interesse hebben gewekt in regeneratieve geneeskunde10. EV's afgeleid van mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn de belangrijkste therapeutische EV's die zijn onderzocht voor artrose, hoewel andere gewrichtsgerelateerde cellen zijn gebruikt als EV-bronnen, bijvoorbeeld chondroprogenitors of immuuncellen11,12.

Bloedplaatjesconcentraten, zoals bloedplaatjeslysaten (PR's), worden gebruikt om de wondgenezing bij verschillende verwondingen te verbeteren, zoals hoornvlieszweren13,14,15 of bij peesweefselregeneratie16, vanwege de hypothese dat de EV-component van bloedplaatjesconcentraten verantwoordelijk kan zijn voor deze effecten17 . Sommige studies met betrekking tot gewrichtsgerelateerde ziekten gebruiken van bloedplaatjes afgeleide EV's (PL-EV's) als een behandeling om artroseaandoeningen te verbeteren. PL-EV's verbeteren de proliferatie en celmigratie van chondrocyten door de Wnt/β-catenineroute18te activeren, de expressie van chondrogene markers in artrose chondrocyten19te bevorderen of hogere niveaus van chondrogene eiwitten en minder tissulaire afwijkingen te vertonen bij artrosekonijnen die worden behandeld met PL-EV's18.

EV's bevatten eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die vrijkomen in de doelcel, waardoor cel-tot-cel communicatie tot stand wordt gebracht, wat het belangrijkste kenmerk is met betrekking tot hun therapeutische toepassingen20. De effecten van EV's zijn afhankelijk van hun bereikcellen en de daaropvolgende ladingafgifte. Dit effect kan indirect worden bevestigd door veranderingen in cellen, zoals metabole activiteit of genexpressiemodificatie. Deze methoden laten echter niet toe om te visualiseren hoe EV's cellen bereiken om hun functie uit te oefenen. Dit artikel presenteert dus een methode om deze PL-afgeleide EV's te labelen om te worden gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgedreven OA-kraakbeenexplantaten. Confocale microscopie werd gebruikt om de EV-opname en progressie naar de chondrocyten in de explantaten te volgen in een time-lapse van 5 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Kraakbeenexplantaten werden verkregen van de IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in overeenstemming met institutionele richtlijnen na ethische goedkeuring van het project door de CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Kolomvoorbereiding

  1. Kolommen in evenwicht brengen volgens de instructies van de fabrikant of als volgt:
    1. Verwijder de kolomkap en breng de kolom in evenwicht. Verwijder de opslagbuffer door elutie.
    2. Was de kolom 3 keer met 2,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Wacht tijdens elke wasbeurt tot de kolom het hele volume absorbeert.
      OPMERKING: Laat de kolom niet drogen.
    3. Bedek de kolom met de dop na de laatste wasbeurt en tot de monstervoorbereiding.

2. EV-etikettering

OPMERKING: Dit EV-etiketteringsprotocol maakt gebruik van een PL-EV-monster dat eerder is geïsoleerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met eerder beschreven voorwaarden21,22. Elk EV-monster van elke bron kan echter met dit protocol worden gebruikt.

  1. Concentreer het EV-monster en de besturing (PBS) met behulp van een concentratiebuis.
    1. Plaats de monsters in een concentratiebuis van 15 ml of 500 μL, afhankelijk van het startvolume van het EV-monster. Centrifugeer de buizen volgens de instructies van de fabrikant totdat een bijna droog monster is verkregen.
      OPMERKING: Het controlemonster is nodig om te controleren op een eventuele kleurstofachtergrond. Hoewel deze methode geen specifiek initieel volume vereist, moet er rekening mee worden gehouden dat ongeveer 10% van de deeltjes verloren gaat tijdens zuiveringsstappen.
  2. Resuspend de geconcentreerde monsters met verdunningsmiddel C. Resuspend EV-monsters met 200 μL en de controlegroep met 100 μL en breng ze over naar nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml.
  3. Scheid het EV-monster in twee aliquots van 100 μL. Markeer er een met kleurstof en gebruik het als behandeling (PKH-PL-EV); laat de andere ongemarkeerd, maar verwerk het (NTA-PL-EV) zoals het EV-monster en gebruik het om de EV-concentratie per NTA te kwantificeren.
  4. Bereid 2x kleurstofoplossing, resulterend in 8 μM PKH26-oplossing in verdunningsmiddel C.
  5. Meng 1 μL van 1 mM PKH26 linker per 125 μL verdunningsmiddel C in het monster. Bereid een volume voor dat nodig is om aan de monsters toe te voegen in een verhouding van 1:1.
  6. Voeg 2x kleurstofoplossing toe aan PKH-PL-EV en controleer monsters in een verhouding van 1:1 om 1x kleurstofconcentratie en 4 μM PKH26-concentratie te bereiken. Voeg hetzelfde volume PBS toe aan het NTA-PL-EV-monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Voeg 5% runderserum albumine-PBS-oplossing toe aan de monsters in een verhouding van 1:1 en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume ~400 μL is.
    OPMERKING: Met deze stap kunt u niet-specifieke kleurstofinteracties of ongebonden kleurstof verwijderen.
  8. Ga verder met het scheiden van de gelabelde EV's van de ongebonden kleurstof en niet-specifieke interacties van de kleurstof met de kolom.

3. Gelabelde EV-isolatie

  1. Verwijder de dop van de kolom, voeg 400 μL van het monster toe (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV of control) en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.
  2. Wacht tot het monster de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.
  3. Wacht tot de PBS de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een 1,5. ml centrifugebuis (EV's of besturing).
    OPMERKING: Deze stappen zijn nodig om de overtollige kleurstof uit de monsters te verwijderen. Een andere scheiding per kolom is nodig om zuiverdere EV's te verkrijgen. Daarom moeten de volgende stappen worden uitgevoerd in een nieuwe gebalanceerde kolom (stap 4.1.) of dezelfde kolom na een eerste wasstap (stap 4.2).
  4. Bereid de kolom voor op een nieuwe EV-scheidingsstap om zuiverdere EV's te verkrijgen. Als het een nieuwe kolom is, herhaalt u stap 2.1. en 2.2. Als het dezelfde kolom is, wast u de kolom met 2,5 ml 20% isopropanol en herhaalt u stap 2.1 en 2.2.
  5. Voeg 600 μL eerder geëlueerde EV's verkregen in stap 2.5 toe aan de kolom en gooi het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  6. Voeg 400 μL PBS toe en gooi al het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  7. Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een centrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik de EV's en controlemonsters voor verdere analyses of bewaar ze 's nachts bij 4 oC.
  8. Sla de gebruikte kolommen op voor toekomstig gebruik.
    1. Was de kolom met 25 ml 20% isopropanol en gooi het geëlueerde volume weg. Was de kolom 3 keer met 2,5 ml PBS.
    2. Voeg de opslagbuffer toe die in stap 1.1.1 is verwijderd en wacht tot de buffer de kolom binnenkomt. Bedek de kolom met de dop en bewaar bij 4 oC tot het volgende gebruik.

4. Ev-kwantificering

  1. Bereid 1:1.000 verdunningen van het NTA-PL-EV-monster en het eerste PL-EV-monster voor zoals beschreven in de volgende twee stappen.
    1. Bereid 1 ml 1:10 verdunde NTA-PL-EV en 1 ml 1:10 verdunde initiële PL-EV met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.
    2. Bereid 1 ml van een verdunning van 1:100 van de vorige verdunde monsters met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.
  2. Injecteer het 1:1.000 verdunde NTA-PL-EV-monster of het eerste PL-EV-monster met behulp van een steriele spuit in de NTA-pomp. Volg de instructies en aanbevelingen van de fabrikant voor de bepaling van de deeltjesconcentratie en de grootteverdeling.
    OPMERKING: Aangezien de EV-concentratie afhankelijk is van het startvolume van het monster, kan het nodig zijn om tussentijdse verdunningen af te lezen en aanpassingen aan te brengen om een correcte NTA-bepaling te verkrijgen.

5. EV's gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgestuurde artrose

  1. Was het kraakbeen tweemaal met PBS en snijd het onder steriele omstandigheden weg met een biopsiepons met een diameter van 3 mm.
    OPMERKING: Voer de procedure uit van stap 5.1 tot en met 5.6 in een celkweekkap.
  2. Plaats de explantaten in 96-well kweekplaten met DMEM-F12 medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine bij 37 oC, 5% CO2en 80% vochtigheid.
    1. Om een ontstekingsgestuurd OA-model vast te stellen, vult u het celkweekmedium aan met 10 ng / ml oncostatine M en 2 ng / ml tumornecrosefactor-alfa (TNFα).
  3. Behandel de explantaten met 1 × 109 deeltjes/put van gelabelde EV's (PKH-PL-EV) of controle in celkweekmedium aangevuld met oncostatine M en TNFα.
    OPMERKING: Meet het volume van het monster dat 1 × 109 deeltjes/put bevat en gebruik hetzelfde volume voor de regeling.
  4. Verwijder het medium van de 96-well celkweekplaten met kraakbeenexplantaten. Voeg 200 μL van het celkweekmedium beschreven in stap 5.3 toe aan elk putje.
    OPMERKING: Als de 96-well platen in contact zijn geweest met foetaal runderserum (FBS), was dan elke put drie keer met 200 μL PBS om eventuele EV's uit de FBS te verwijderen.
  5. Stop de in vitro test op verschillende tijdstippen: 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur.
  6. Was de celkweekputten met de kraakbeenexplantaten tweemaal met 200 μL PBS.
  7. Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan het weefsel om het gedurende 3 uur bij 4 oC te fixeren.
    OPMERKING: Stappen met PFA moeten worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de aanbevelingen van het veiligheidsinformatieblad.
  8. Verwijder de PFA, voeg 100 μL PBS toe, bewaar het vaste weefsel bij 4 °C en verwerk de monsters binnen 48 uur.

6. Microscopie voorbereiding en visualisatie

OPMERKING: Deze histologische procedure bestaat uit uitdroging, paraffine-inbedding en rehydratatiestappen. Deze stappen kunnen de algehele kleurstoffluorescentie verminderen (een beperking die wordt vermeld in het gegevensblad voor PKH26). Daarom kunnen andere procedures, zoals bevroren secties, meer geschikt zijn voor EV-visualisatie door confocale microscopie.

  1. Sluit de vaste weefsels in paraffineblokken in. Snijd het weefsel in 6 μm dikke delen.
  2. Deparaffiniseer de weefselsecties.
    OPMERKING: Alle stappen met xyleen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.
    1. Dompel de weefselsecties gedurende 30 minuten onder in xyleen, 100% ethanol gedurende 2 minuten, 96% ethanol gedurende 2 minuten, 75% ethanol gedurende 1 minuut en ten slotte in gedestilleerd water gedurende 30 s.
  3. Permeabiliseer de weefselsecties.
    1. Bereid een 0,1% Triton-0,1% natriumcitraatoplossing om het weefsel te permeabiliseren. Voeg een druppel van 20 μL toe aan elk weefselgedeelte en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was elke sectie tweemaal met 20 μL PBS.
  4. Voeg op een microscopisch kleine dia een druppel montagemedium toe met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) met een waterig montagemedium voor het behoud van de fluorescentie. Bedek de dia met 3 weefselsecties uit stap 6.3.1.
  5. Incubeer de dia's 's nachts bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  6. Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen licht tot confocale microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schematisch overzicht voor EV-etikettering en opnamemonitoring is weergegeven in figuur 1. De deeltjesconcentratie en EV-grootte gedetecteerd door NTA in tabel 1 laten zien dat de EV-concentratie tijdens het proces afneemt als gevolg van de zuiveringsstap die tweemaal wordt uitgevoerd na etikettering met de kolom. De verkregen hoeveelheid ligt echter in het optimale bereik van het aantal deeltjes dat voor de behandeling moet worden gebruikt. Deze deeltjesconcentratie wor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

EV-beeldvorming helpt om EV-eigenschappen te begrijpen, zoals hun afgifte- en opnamemechanismen. Hun beeldvorming maakt het mogelijk om hun biodistributie te monitoren en hun farmacokinetische eigenschappen te karakteriseren als medicijnvoertuigen. EV-beeldvorming en -tracking kunnen echter moeilijk zijn vanwege hun kleine afmetingen, hoewel veel beeldvormingsapparaten en etiketteringstechnieken zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen EV's te volgen onder in vitro en in vivo omstandigheden

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124); door het PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toeristenbelasting van de Balearen; van de Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); door het POSTDOCTORALE PROGRAMMA FOLIUM (FOLIUM 17/01) binnen de FUTURMed, gefinancierd voor 50% door de belasting op duurzaam toerisme van de Balearen en voor 50% door het ESF; en door de Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
1.5 mL Centrifuge tubeSPL life sciencesPLC60015
1 mL Syringe BD PlastipakBD303174
2-Propanol (Isopropanol)Panreac AppliChem1.310.901.211Bereidt op 20% met Milli-Q water
96-well culture plateSPL life sciencesPLC30096
Absolute ethanol PharmpurScharlabET0006005PGebruikt om 96% en 75% ethanol te bereiden met Milli-Q water
Biopsy Punch met zuiger 3 mmScandidactMTP-33-32
Bovine serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA7030Bereidt op 5% met PBS
Kraakbeen explantenIdISBa Biobank
Concentration tube 15 mL Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
Concentration tube 500 µL Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
Dekglas 24 x 60 mmDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Ingebedde paraffine weefselblokkenIdISBa BiobankTarief voor dienst
Exo-spin mini-HD kolommenCell guidance systemsEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 µm spuitfilterSarstedt83.1826.001
Fluoroshield met DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGBereidt een stockoplossing tot een eindconcentratie van 0.1 µg/µL verdunnen in PBS-0.1% BSA
ParaformaldehydeSigma-Aldrich8.18715.1000Bereidt op 4% met PBS en bewaard bij 4 °C
Penicilline-Streptomycine Oplossing 100xBiowestL0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit voor Algemene Celmembraan LabelingSigma-AldrichMINI26PKH26 en Dliuent C inbegrepen
Natriumcitraat dihydraatScharlabSO019911000
Superfrost Plus MicroscoopglazenThermo ScientificJ1800AMNZ
TNFαR&D systems210-TA-005Bereidt een stockoplossing tot een eindconcentratie van 0.01 µg/µL verdund in PBS-0.1% BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Gebruikt om een 0.1% Triton-0.1% natriumcitraat oplossing te bereiden met Milli-Q water
XyleenScharlabXI0050005P
Apparatuur
Centrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300MalvernNS300Apparaat met ingebouwde laser bij λ= 532 nm en sCMOS camera
Shandon Finesse 325 Manuele MicrotomeThermo Scientific™A78100101
TCS-SPE confocale microscoopLeica Microsystems5200000271

Referenties

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

EV-labelingEV-migratieEV-opnameconfocale microscopieEV's uit bloedplaatjeslysaatnanopartikeltrackingin vitro OA-modelchondrocytenopname
Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.