Voorbijgaande transductie van de gestrobileerde vormen van Echinococcus granulosus

Summary

We beschrijven een snelle transiënte transductietechniek in verschillende ontwikkelingsstadia van Echinococcus granulosus met behulp van lentivirale vectoren van de derde generatie.

Abstract

Cystische echinokokkose of hydatidziekte is een van de belangrijkste zoönotische parasitaire ziekten veroorzaakt door Echinococcus granulosus, een kleine lintworm in de darm van honden. Er is dringend behoefte aan toegepast genetisch onderzoek om de mechanismen van pathogenese en ziektebestrijding en -preventie te begrijpen. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem belemmert echter de directe interpretatie van de functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder de Echinococcus-soorten . De huidige studie toont het potentieel aan van lentivirale gentransiënte transductie in de metacestode en gestrobileerde vormen van E. granulosus. Protoscoleces (PSC's) werden geïsoleerd uit hydatid cysten en overgebracht naar specifieke bifasische kweekmedia om zich te ontwikkelen tot gestrobileerde wormen. De wormen werden getransfecteerd met geoogst lentivirus van de derde generatie, samen met HEK293T-cellen als transductieprocescontrole. Een uitgesproken fluorescentie werd gedetecteerd in de gestrobileerde wormen gedurende 24 uur en 48 uur, wat wijst op voorbijgaande lentivirale transductie in E. granulosus. Dit werk presenteert de eerste poging tot lentivirus-gebaseerde transductie in lintwormen en toont de veelbelovende resultaten met mogelijke implicaties in experimentele studies over platwormbiologie.

Introduction

Cystische echinokokkose (CE) is een van de belangrijkste helmintziekten veroorzaakt door Echinococcus granulosus, een kleine lintworm binnen de familie Taeniidae ^1,2. Uitgebreide studies over immunodiagnostische en vaccinontwikkeling voor E. granulosus zijn uitgevoerd. Onvoldoende kennis over de moleculaire basis van parasietbiologie vormt echter grote beperkingen in de diagnose, het beheer en de preventie van hydatidziekte 3,4,5,6.

In de....

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door het National Institute for Medical Research Development en de Research Ethics Review Committee, nr. 958680. Lentivirussen zijn geclassificeerd als BSL-2 organismen; daarom werden alle laboratoriumkweekprocedures in dit protocol uitgevoerd met behulp van steriele laboratoriumpraktijken en uitgevoerd onder een laminaire stromingskap volgens de NIH-richtlijnen. Figuur 1 toont een schematische presentatie van het onderzoeksprotocol voor de verschillende E. granulosusstadia .

1. Hydatid cysten verzamelen

1. Verzamel leverhydatid cysten van natuurlijk....

Results

Hier beschrijven we een snelle en efficiënte transiënte transductietechniek in E. granulosus door gebruik te maken van lentivirale vectoren van de derde generatie. We kweekten PSC's in een bifasisch kweekmedium om gestrobileerde wormen te verkrijgen, zoals eerder beschreven^25,26. Protoscoleces ontwikkelen zich na 6 weken in vitro tot gestrobileerde wormen. Verschillende stadia van E. granulosus werden waargenomen in het bifasische kweek.......

Discussion

Het begrijpen van de moleculaire basis van nematoden en Platyhelminthes biologie is cruciaal voor het begrijpen van de pathogeniciteit van zoönotische parasieten²⁷. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem is een groot obstakel voor de directe interpretatie van functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder Echinococcus-soorten ^12,27. De huidige studie toont het uitstekende potentieel van lentivirus in E. gra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well culture plates	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 culture flask	SPL Life Sciences	70325
6-well culture plates	SPL Life Sciences	30006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubator	memmert	ICO150
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Dog bile			Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Calf Serum (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells	BONbiotech	BN_0012.1.14	Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentrate
Inverted fluorescence microscope	OLYMPUS	IX51
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin	Roche	10108057001	Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS)	DNAbiotech	DB0011	This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI medium	BioIdea	BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x working solutions (pH 7.4–7.6)