Methodenartikel

Kwantitatieve beoordeling van macropinocytose in mTORC1-hyperactieve cellen met behulp van flowcytometrie

DOI:

10.3791/62793

⸱

2 augustus 2021

 , 
1Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Metcalf Science Center, Chemistry Department, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt experimentele hulpmiddelen om de macropinocytische opname van voedingsstoffen (koolhydraten en eiwitten) door mTORC1-hyperactieve cellen te evalueren. Gedetailleerde stappen om de opname van fluorescerend gelabeld dextran en runderserumalbumine (BSA) te kwantificeren, worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytose is een sterk geconserveerd, actine-afhankelijk endocytisch proces dat de opname van extracellulair materiaal, waaronder eiwitten en lipiden, mogelijk maakt. In prolifererende cellen kan macropinocytose extracellulaire voedingsstoffen aan het lysosoom leveren, verwerkt tot kritische macromolecuulbouwstenen. Recente studies hebben de afhankelijkheid van meerdere vormen van kanker van macropinocytose benadrukt, waaronder borst-, colorectale en pancreaskanker. Ras-mutaties worden verondersteld de drijvende kracht te zijn achter de initiatie van macropinocytose, wat leidt tot de activering van cellulaire anabole processen via de mTORC1-signaleringsroute. Interessant is dat mTORC1 ook onafhankelijk van Ras kan worden geactiveerd door macropinocytose. Daarom vertegenwoordigt macropinocytose een metabole kwetsbaarheid die kan worden gebruikt om macropinocytische tumoren aan te pakken door hun toegang tot voedingsstoffen therapeutisch te beperken.

Bij tubereuze sclerose complex (TSC) en lymfangioleiomyomatose (LAM) leidt mTORC1-hyperactivatie tot verbeterde macropinocytose en metabole herprogrammering. Hier beschrijven we een op flowcytometrie gebaseerd protocol om macropinocytose in zoogdiercellen kwantitatief te beoordelen. Er worden TSC2-deficiënte MEF's gebruikt, die een afwijkende activering van mTORC1 vertonen en waarvan is aangetoond dat ze een verhoogde macropinocytose hebben in vergelijking met cellen die TSC2 tot expressie brengen. Cellen die worden behandeld met farmacologische remmers van macropinocytose worden geïncubeerd met fluorescerend gelabeld, lysine-fixeerbaar, 70 kDa dextran of fluorescerend gelabeld runderserumalbumine (BSA) getest door middel van flowcytometrie. Tot op heden zijn robuuste beeldgebaseerde technieken ontwikkeld om macropinocytose in tumorcellen in vitro en in vivo kwantitatief te beoordelen. Deze analyse biedt een kwantitatieve beoordeling van macropinocytose in meerdere experimentele omstandigheden en vormt een aanvulling op bestaande beeldgebaseerde technieken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytose is een endocytisch proces dat zich toelegt op de bulkopname van extracellulair materiaal, gevolgd door de vorming van macropinosomen, ofwel gerecycled naar het plasmamembraan of versmolten met lysosomen om de geïnternaliseerde lading af te breken 1,2. Hoewel de opname van vracht niet-selectief is, is macropinocytose een proces dat uit meerdere stappen bestaat, streng gereguleerd door Rab GTPases en membraanfosfolipiden 3,4. Kankercellen gebruiken met name macropinocytose om extracellulaire voedingsstoffen, waaronder eiwitten, polysacchariden en lipiden, te internaliseren. Macropinocytose in kankercellen wordt geactiveerd door oncogenen stroomafwaarts van Ras of v-Src als een mechanisme om hun proliferatie te ondersteunen, vooral onder omstandigheden van voedingsstress 5,6. Daarom vertegenwoordigt macropinocytose een nieuwe therapeutische benadering voor het aanpakken van kankercellen door de opnameroutes van voedingsstoffen te verstoren 7,8.

Bij tubereuze sclerose complex (TSC) en lymfangioleiomyomatose (LAM) leiden mutaties met functieverlies in TSC1 of TSC2 tot hyperactivatie van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycine complex 1 (mTORC1)9. Van afwijkende mTORC1-activering is bekend dat het uitgebreide metabole herprogrammering stimuleert, waaronder opname en gebruik van glucose en glutamine, verbeterde nucleïnezuursynthese, lipidesynthese en autofagie10,11. Om deze verhoogde anabole behoefte te compenseren, verhogen mTORC1-hyperactieve cellen de opname van exogene voedingsstoffen via macropinocytose en versterken ze de lysosomale afbraak van geïnternaliseerde lading12. In recent werk hebben we ritanserine, een remmer van diacylglycerolkinase-alfa (DGKA) geïdentificeerd als een middel dat selectief de proliferatie van TSC2-deficiënte cellen remt13. DGKA is een lipidekinase dat diacylglycerol metaboliseert tot fosfatidinezuur (PA)14. PA is een cruciaal tweede boodschappermolecuul dat ook een cruciale rol speelt bij het handhaven van de homeostase van het celmembraan. Verrassend genoeg remt ritanserine de macropinocytose sterk door het fosfolipidenmetabolisme in TSC2-deficiënte cellen te herprogrammeren. Daarom kan het richten op de opname van voedingsstoffen door macropinocytose in TSC2-deficiënte cellen nieuwe therapeutische benaderingen bieden in TSC en LAM.

Kwantificering van macropinocytische opname in vitro en in vivo kan cruciale inzichten verschaffen in de regulatie van macropinosoomvorming en de ontdekking van moleculaire mechanismen versnellen, terwijl nieuwe therapeutische benaderingen worden geïdentificeerd 2,6. Tot op heden zijn er meerdere methodologieën ontwikkeld die de macropinocytische opname van fluorescerend dextran zowel in vitro als in vivo adequaat kwantificeren 2,15. Hier beschrijven we een op flowcytometrie gebaseerde benadering om de hoeveelheid geïnternaliseerd dextran en albumine in mTORC1-hyperactieve cellen direct te beoordelen (Figuur 1). Deze methode kan worden gebruikt om meerdere experimentele omstandigheden parallel te analyseren en vormt een aanvulling op bestaande op beelden gebaseerde benaderingen.

figure-introduction-1
Figuur 1. Workflow voor de beoordeling van macropinocytose in zoogdiercellen. Cellen worden gezaaid in platen met zes putjes en vervolgens behandeld met interessante verbindingen. Fluorescerende dextran of BSA worden gedurende 60 minuten toegevoegd en de opname wordt geremd door te wassen met ijskoud PBS. Cellen worden gefixeerd met behulp van paraformaldehyde en de fluorescentie-intensiteit wordt gekwantificeerd door middel van flowcytometrie. Cellen worden omheind en gegevens worden geanalyseerd met de juiste software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celbehandeling

Dag 1

  1. Zaad TSC2-deficiënte en TSC2-expressie embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen in drievoud, in elk putje van een weefselkweekplaat met zes putjes met behulp van DMEM, aangevuld met 10% FBS. De cellen moeten op dag 3 voor 60-70% samenvloeien.
    1. Zaai extra controleputjes voor elke geneesmiddelaandoening die niet wordt gekleurd met FITC-Dextran of TMR-BSA.

Dag 2

  1. Zuig media zorgvuldig op en spoel de cellen twee keer met PBS bij kamertemperatuur.
    1. Behandel cellen met vehiculum (DMSO), 100 μM fosfatidinezuur (PA), 25 μM EIPA, 10 μM ritanserine of een combinatie van PA en ritanserine. Gebruik DMEM aangevuld met 1% FBS.
      OPMERKING: Het DMSO-volume moet gelijk zijn aan het maximale volume oplosmiddel dat bij de behandeling wordt gebruikt. Als bijvoorbeeld 10 μL EIPA wordt gebruikt, moet het volume DMSO in de voertuigomstandigheden ook 10 μL zijn.

Dag 3

  1. Vervang media door serumvrije DMEM die de bovengenoemde geneesmiddelen bevatten en 0,5 mg/ml FITC-Dextran of 0,5 mg/ml TMR-BSA 16 uur na de behandeling. Incubeer de cellen gedurende 60 minuten in een incubator voor celcultuur van 37 °C/5% CO2 .
    OPMERKING: Om fotobleken van de fluoroforen tot een minimum te beperken, moeten FITC-Dextran en TMR-BSA-buizen in aluminiumfolie worden gewikkeld en moet het experiment worden uitgevoerd in een celkweekkast met de lichten uitgeschakeld.
  2. Zuig media op en was twee keer met ijskoud PBS.
    1. Maak cellen los met 500 μL trypsine. Plaats de cellen 2-3 minuten in een 37 °C/5% CO2 -celcultuurincubator.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat alle cellen zijn losgemaakt door ze onder een helderveldmicroscoop te observeren.
    2. Gebruik elke keer een schone pipetpunt om cellen te verzamelen in buisjes van 1,5 ml met behulp van 1% FBS gesupplementeerde DMEM op ijs.
    3. Pelletcellen door centrifugeren bij 425 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    4. Aspiratie van het bovenlevende.
  3. Resuspendeer de celpellet met 50 μL 2% paraformaldehyde.
    LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig en moet onder een geschikte zuurkast worden behandeld. Formaldehydehoudend afval moet worden verwijderd volgens de richtlijnen van de instelling.
    1. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 1 ml ijskoude PBS toe aan elke buis en resuspendeer de celpellet voorzichtig. Plaats de buizen op ijs.
  4. Centrifugeer de cellen bij 425 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
  5. Aspiratie van het bovenlevende.
    1. Resuspendeer de celpellet in 300 μl ijskoud PBS.
    2. Breng de cellen over naar de juiste FACS-buisjes op ijs.
    3. Ga verder met flowcytometrie.

2. Flowcytometrie

  1. Draai de cellen kort voordat u ze in de FACS-monsterhouder plaatst.
  2. Gebruik een stroom met lage snelheid om levende cellen van elk onkleurig monster (negatieve controle) te gaten met behulp van het juiste laservermogen, zoals te zien is in figuur 2A. Deze stap verschilt per instrument en moet voor elk experiment worden geoptimaliseerd. Pas het vermogen voor zowel voorwaartse verstrooiing (FSC) als zijverstrooiing (SSC) aan, zodat levende cellen onderscheiden zijn van puin of celclusters.
  3. Selecteer met behulp van de autogate-functie de levende celpopulaties voor elk monster en vermijd celresten en celclusters.
    OPMERKING: Alle celgebeurtenissen (ongeacht gating) worden uiteindelijk geregistreerd door de cytometer. Daarom is het selecteren van een poort in deze stap niet kritisch.
  4. Registreer de fluorescentie-intensiteit van elk monster met behulp van de juiste groene of rode lasers.

3. Analyse van flowcytometrie

  1. Poortcellen met behulp van voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters. Pas dezelfde poort toe op alle monsters.
  2. Maak histogrammen voor fluorescentie in elk monster zoals in figuur 2B.
  3. Bereken binnen elke celpoort de gemiddelde/mediane fluorescentie-intensiteit voor alle monsters.
  4. Exporteer gegevens voor de juiste statistische analyse.
    OPMERKING: Tijdens gegevensanalyse moet de gemiddelde/mediane fluorescentie-intensiteit van elk monster worden genormaliseerd door de niet-gekleurde monsterwaarden af te trekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ritanserine remt macropinocytose in TSC2-deficiënte cellen
We hebben eerder aangetoond dat de macropinocytische opname van voedingsstoffen drievoudig toeneemt in TSC2-deficiënte cellen in vergelijking met cellen die TSC2 tot expressie brengen16. Bij TSC en LAM wordt macropinocytose gemedieerd via diacylglycerolkinase-alfa (DGKA). Het metabolische product van DGKA is fosfatidinezuur (P...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering om macropinocytose te beoordelen met behulp van flowcytometrie. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige en snelle meting van het fluorescerend gelabelde macropinocytaire ladingsdextran en albumine. Eerdere studies hebben de macropinocytische index van kankercellen zorgvuldig gekarakteriseerd met behulp van confocale microscopiebenaderingen15,20. Hoewel deze methoden de internalisat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De LAM Foundation Career Development Award. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Kritische lezing werd uitgevoerd door Hilaire C. Lam.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMGibco11965-092Groeimedia
EIPA (amiloride)Sigma AldrichA3085Macropinocytosis inhibitor
FBSR&D SystemsS11150Fetaal bovien serum
FITC-DextranInvitrogenD1822Fluorescent polysacharide (70kDa)
ParafolmadehydePierce28906Fixatiemiddel
PBSGibco10010-023Fosfaat Buffer Saline
Penicilin/StreptomycinSigma AldrichP4458-100MLCelcultuur antibiotica
Fosfatidic ZuurAvanti840101PFosfolipide afgeleid van eieren
RitanserinTocris1955DGKA inhibitor
TMR-BSAInvitrogenA23016Fluorescent albumine
TrypsineSigma Aldrich25300-054Dissociatiemiddel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
  2. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  3. Maxson, M. E., Sarantis, H., Volchuk, A., Brumell, J. H., Grinstein, S. Rab5 regulates macropinocytosis by recruiting the inositol 5-phosphatases OCRL/Inpp5b that hydrolyze PtdIns(4,5)P2. Journal of Cell Science. , (2021).
  4. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1712(2013).
  5. Ramirez, C., Hauser, A. D., Vucic, E. A., Bar-Sagi, D. Plasma membrane V-ATPase controls oncogenic RAS-induced macropinocytosis. Nature. 576 (7787), 477-481 (2019).
  6. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  7. Kim, S. M., et al. Targeting cancer metabolism by simultaneously disrupting parallel nutrient access pathways. Journal of Clinical Investigation. 126 (11), 4088-4102 (2016).
  8. Selwan, E. M., Finicle, B. T., Kim, S. M., Edinger, A. L. Attacking the supply wagons to starve cancer cells to death. FEBS Letters. 590 (7), 885-907 (2016).
  9. Henske, E. P., Jozwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16035(2016).
  10. Duvel, K., et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular Cell. 39 (2), 171-183 (2010).
  11. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  12. Choo, A. Y., et al. Glucose addiction of TSC null cells is caused by failed mTORC1-dependent balancing of metabolic demand with supply. Molecular Cell. 38 (4), 487-499 (2010).
  13. Kovalenko, A., et al. Therapeutic targeting of DGKA-mediated macropinocytosis leads to phospholipid reprogramming in Tuberous Sclerosis Complex. Cancer Research. , (2021).
  14. Swanson, J. A. Phorbol esters stimulate macropinocytosis and solute flow through macrophages. Journal of Cell Science. 94, Pt 1 135-142 (1989).
  15. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  16. Filippakis, H., et al. Vps34-mediated macropinocytosis in Tuberous Sclerosis Complex 2-deficient cells supports tumorigenesis. Scientific Reports. 8 (1), 14161(2018).
  17. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biol Int. 39 (5), 531-539 (2015).
  18. Jachimska, B., Wasilewska, M., Adamczyk, Z. Characterization of globular protein solutions by dynamic light scattering, electrophoretic mobility, and viscosity measurements. Langmuir. 24 (13), 6866-6872 (2008).
  19. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87 (6), 4259-4270 (2004).
  20. Lee, S. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and Quantification of Macropinosomes in Pancreatic Tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
  21. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  22. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  23. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  24. Murphy, R. F. Analysis and isolation of endocytic vesicles by flow cytometry and sorting: demonstration of three kinetically distinct compartments involved in fluid-phase endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (24), 8523-8526 (1985).
  25. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (139), e58434(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beoordeling van macropinocytoseTSC2 defici nte MEF smetabole herprogrammeringRas mutatiesopname door tumorcellendextraanopnamerunderserumalbumineendocytisch proces
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen