Methodenartikel

In vitro Differentiatie van menselijke dendritische cellen en hun markers bij Leishmania-infectie

847 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62794

⸱

6 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dendritische cellen (DC's) zijn essentiële componenten van aangeboren immuniteit tegen Leishmania-infectie. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de complexe interactie tussen DC's en Leishmania blijven slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om te evalueren hoe Leishmania-infectie de immunobiologische functie van menselijke DC's beïnvloedt, zoals migratiegerelateerde en costimulatoire molecuulexpressie.

Samenvatting

Leishmaniasis omvat een verzameling van klinische manifestaties die verband houden met de infectie van obligate intracellulaire protozoa, Leishmania. De levenscyclus van Leishmania-parasieten bestaat uit twee afwisselende levensfasen (amastigoten en promastigoten), waarin parasieten respectievelijk in geleedpotige vectoren of gastheren van gewervelde dieren verblijven. Met name de complexe interacties tussen Leishmania-parasieten en verschillende cellen van het immuunsysteem hebben een grote invloed op de uitkomst van de infectie. Belangrijk is dat, hoewel bekend is dat macrofagen de belangrijkste gastheerniche zijn voor Leishmania-replicatie , parasieten ook worden gefagocyteerd door andere aangeboren immuuncellen, zoals neutrofielen en dendritische cellen (DC's).

DC's spelen een belangrijke rol bij het overbruggen van de aangeboren en adaptieve takken van immuniteit en orkestreren zo immuunresponsen tegen een breed scala aan pathogenen. De mechanismen waarmee Leishmania en DC's op elkaar inwerken, blijven onduidelijk en omvatten aspecten van het vastleggen van pathogenen, de dynamiek van DC-rijping en -activering, DC-migratie naar drainerende lymfeklieren (dLN's) en antigeenpresentatie aan T-cellen. Hoewel een groot aantal studies het idee ondersteunt dat DC's een dubbele rol spelen bij het moduleren van immuunresponsen tegen Leishmania, blijft de deelname van deze cellen aan gevoeligheid of resistentie tegen Leishmania slecht begrepen. Na infectie ondergaan DC's een rijpingsproces dat gepaard gaat met de opregulatie van het oppervlakte-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) II, naast costimulatoire moleculen (namelijk CD40, CD80 en CD86).

Inzicht in de rol van DC's in de uitkomst van infecties is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische en profylactische strategieën om de immuunrespons tegen Leishmania te moduleren. Dit artikel beschrijft een methode voor de karakterisering van de Leishmania-DC interactie. Dit gedetailleerde protocol biedt richtlijnen voor de stappen van DC-differentiatie, de karakterisering van celoppervlaktemoleculen en infectieprotocollen, waardoor wetenschappers de DC-respons op Leishmania-infectie kunnen onderzoeken en inzicht kunnen krijgen in de rol die deze cellen spelen in de loop van infectie.

Inleiding

Leishmaniasis vormt een complex van verwaarloosde ziekten veroorzaakt door verschillende soorten van het geslacht Leishmania 1. Leishmania is een intracellulaire protozoa van de familie Trypanosomatidae die mensen en andere zoogdieren infecteert en een spectrum van ziekten veroorzaakt, variërend van huidlaesies tot viscerale vormen2. De voornaamste klinische manifestaties van deze ziekte zijn tegumentaire leishmaniasis (TL) en viscerale leishmaniasis (VL). De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat dat er jaarlijks 700.000 tot 1 miljoen nieuwe gevallen voorkomen, met 70.000 dodenper jaar 2. Wereldwijd treft leishmaniasis ongeveer 12 tot 15 miljoen mensen, en 350 miljoen mensen lopen het risico de ziekte op te lopen3.

Het geslacht Leishmania vertoont twee evolutionaire vormen: de promastigote en de amastigote4. Leishmania promastigoten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van flagellen en een hoge beweeglijkheid. Deze vormen worden aangetroffen in het spijsverteringskanaal van de zandvlieg, waar ze differentiatie ondergaan in de infectieuze vorm (metacyclische promastigoten)5. Daarentegen worden amastigoten aangetroffen in de intracellulaire omgeving van geïnfecteerde zoogdiercellen. Deze evolutionaire vorm repliceert op zijn beurt in de fagolysosomen van fagocytische cellen6.

De transmissiecyclus van Leishmania spp. begint tijdens de bloedvoeding, wanneer zandvliegen metacyclische promastigoten inoculeren in de huid van de gastheer1. Kort na de inenting van Leishmania fagocytiseren aangeboren immuuncellen, waaronder neutrofielen en weefselresidente macrofagen, de parasieten. In parasitofore vacuolen differentiëren Leishmania zich in amastigoten en repliceren, culminerend in de breuk van het gastheercelmembraan, waardoor de infectie van naburige cellen en de verspreiding van parasieten mogelijk is4. De cyclus wordt voltooid wanneer flebotomines amastigote-bevattende fagocyten opnemen, die differentiëren tot procyclische promastigoten en later tot metacyclische promastigoten in het darmkanaal van het insect7.

Dendritische cellen, professionele antigeenpresenterende cellen die in weefsels en lymfeklieren worden aangetroffen, fungeren als schildwacht voor het immuunsysteem8. Deze cellen worden aangetroffen in perifere weefsels in onrijpe stadia, voornamelijk betrokken bij het vangen en verwerken van antigeen. Na contact met ziekteverwekkers ondergaan DC's een rijpingsproces dat culmineert in hun migratie naar de lymfeklieren, waarna antigenen worden gepresenteerd aan naïeve CD4+ T-cellen. Deze cellen zijn ook essentieel bij het orkestreren van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen die tolerantie of ontsteking veroorzaken9. Het DC-rijpingsproces omvat verschillende aspecten, waaronder verhoogde expressie van MHC en costimulatoire moleculen, zoals CD40 en CD86, evenals verbeterde cytokinesecretie. DC's brengen verschillende markers tot expressie, waaronder CD11b en CD11c, en bij mensen brengen de DC's die afkomstig zijn van CD14+ -monocyten (moDC's) CD1a10 tot expressie. CCR7 komt sterk tot expressie op DC's en geeft het complexe migratieproces van deze cellenaan 12. CD209 en CD80 spelen ook een belangrijke rol bij het eerste contact met DC's en lymfocyten13.

Bij leishmaniasis suggereren studies dat moDC's parasieten fagocytoseren en deze afleveren bij de drainerende lymfeklieren (dLN's), waar ze antigenen presenteren aan T-cellen13. Het mechanisme voor het vangen van parasieten wordt geassocieerd met cytoskeletale reorganisatie door actinefilamenten tijdens fagocytose, wat de internalisatie van de parasiet bevordert14. De meeste studies naar de rol van DC's bij leishmaniasis hebben zich gericht op L. major, L. amazonensis en L. braziliensis15. Interessant is dat in vivo studies van Leishmania-infectie hebben aangetoond dat de verslechtering van de DC-functie optreedt op een parasietstamspecifieke manier.

Het is aangetoond dat DC's tijdens de vroege stadia van L. amazonensis-infectie een verminderd vermogen vertonen om parasitaire infectie te beperken. Omgekeerd werd in een experimenteel model van L. braziliensis-infectie aangetoond dat DC's de juiste immuunresponsen opbouwden die de overleving van Leishmania beperkten16. De belangrijkste aspecten waarvan bekend is dat ze verband houden met differentiële responsen op infectie met Leishmania spp. zijn de mate van DC-rijping en activering. Dit artikel beschrijft een methode om de rol van menselijke DC's bij Leishmania-infectie te onderzoeken om beter te begrijpen hoe deze cellen de ziekte-uitkomsten beïnvloeden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Cellen zijn verkregen van gezonde donorvrijwilligers. De hierin beschreven procedure werd goedgekeurd door de Nationale Ethische Commissie (nummer 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brazilië).

1. Differentiatie van menselijke dendritische cellen

  1. Pipetteer 10 ml mengsel van polysucrose-natriumtriazoaat in conische buisjes van 50 ml.
  2. Etiketteer de conische buisjes van 50 ml respectievelijk voor elke donor.
  3. Verzamel 30 ml bloed van gezonde donoren en voer alle volgende stappen uit in de laminaire flowkap.
  4. Breng het bloed voorzichtig over in de conische buisjes en verdun het bloed in een zoutoplossing (0,9% natriumchloride) in een verhouding van 1:1 bij kamertemperatuur.
  5. Breng het langzaam verdunde bloed aan op het mengsel van polysucrose-natriumtriazoaat in de buisjes (stap 1.1). Centrifugeer de buisjes eenmaal bij 400 × g gedurende 30 minuten bij 25 °C.
    OPMERKING: Zet de rem uit voor het centrifugeren om vermenging van gradiëntlagen te voorkomen. Verlaag na de eerste centrifugatie de temperatuur in de centrifuge tot 4 °C.
  6. Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge.
  7. Zoek naar de ring gevormd door perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) in het monster (buffy coat); Zuig het resterende plasma voorzichtig op met een pipet.
    OPMERKING: Centrifugatie leidt tot de vorming van de volgende gradiëntlagen: erytrocyten, dichtheidsgradiëntmedium, PBMC-ring en plasma. De PBMC-ring bevindt zich tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de plasmalagen.
  8. Breng de troebele PBMC-laag over naar een andere buis en voeg zoutoplossing toe tot een eindvolume van 30 ml.
  9. Centrifugeer de buisjes met de celsuspensies gedurende 10 minuten bij 250 × g bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en voeg 1 ml zoutoplossing toe om de pellet opnieuw te suspenderen.
  10. Verzamel een aliquot voor het tellen van cellen en verdun het 1:1.000. Gebruik 10 μL van de verdunde cellen voor het tellen van de cellen met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode met behulp van een Neubauer-kamer om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen.
  11. Draai de suspensie opnieuw 10 minuten bij 200 × g onder 4 °C.
  12. Resuspendeer de pellet in een buffer voor magnetische celsortering (MACS). Gebruik 80 μL van de buffer per 1 × 107 cellen.
    OPMERKING: Zie Tabel 1 voor de samenstelling van de MACS-buffer. Bewaar de buffer koud en bewaar deze bij 2-8 °C.
  13. Voeg CD14-microbeads toe aan de celsuspensie die in stap 1.9 is voorbereid. Gebruik 20 μL CD14-microbeads per 1 × 107 cellen.
    OPMERKING: CD14-microbeads worden gebruikt om menselijke monocyten uit PBMC's positief te selecteren, aangezien kralen die humaan anti-CD14 bevatten, binden aan CD14+ -cellen die tot expressie komen op de oppervlakken van de meeste monocyten.
  14. Pipetteer op en neer om de pellets en microbeads gelijkmatig te suspenderen. Laat 15 minuten op ijs staan.
  15. Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 300 × g bij 4 °C.
  16. Resuspendeer de cellen in de MACS-buffer. Gebruik 1-2 ml per 1 × 107 cellen in het cel-microbeadmengsel.
  17. Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 300 × g bij 4 °C.
  18. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 500 μl MACS-buffer.
    OPMERKING: Dit is het maximale volume van de celsuspensie die in één kolom moet worden verwerkt.
  19. Zet de magnetische zuil in elkaar.
  20. Was de kolom eenmaal met 500 μL MACS-buffer en laat de buffer onder zwaartekracht door de kolom stromen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kolom niet droog wordt, omdat lucht de kolom kan blokkeren.
  21. Voeg 500 μL van de cel-kralensuspensie (stap 1.19) per kolom toe. Laat de celsuspensie onder zwaartekracht door de kolom stromen.
  22. Was de kolom met 500 μL MACS-buffer (2x). Voeg alleen nieuwe buffer toe als het kolomreservoir leeg is. Laat de zuil niet opdrogen.
  23. Plaats een nieuwe buis onder de kolom, pipetteer 1 ml MACS-buffer op de kolom en spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk uit de kolom door de zuiger stevig in te drukken.
  24. Centrifugeer de met CD14 verrijkte cellen bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  25. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer.
  26. Resuspendeer de cellen in 1 ml volledig RPMI met 100 μL/ml interleukine-4 (IL-4) ( (50 ng/ml) + granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) (50 ng/ml).
  27. Zaadcellen op een plaat met 24 putjes in een concentratie van 2 × 105 cellen per putje in 500 μl compleet RPMI-medium dat de bovengenoemde cytokines bevat, en incuberen gedurende 7 dagen bij 37 °C.

2. Leishmania-cultuur

OPMERKING: In deze test werden L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) parasieten gebruikt.

  1. Onderhoud de promastigoten op Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) bloedagarmedium met 5 ml Schneider's complete medium of Minimum Essential Medium (MEM) in een kweekfles van 25 cm2 in een bio-zuurstofbehoefte (BZV) incubator bij 24 °C.
    OPMERKING: Om de promastigote vorm van de L. amazonensis-soort te kweken, werd 5 ml van het volledige medium van Schneider (Schneider's Insect Medium met 10% geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en gentamicine in een concentratie van 50 μg/ml) gebruikt.
  2. Incubeer gedurende 7 dagen bij 24 °C in de BZV-incubator.
  3. Pipetteer 100 μL promastigotcultuur in een nieuwe25 cm 2-cellige kweekkolf.
  4. Voeg 5 ml van de toegevoegde MEM toe.
  5. Incubeer bij 24 °C in de BZV-incubator en tel periodiek de promastigoten door een aliquot met zoutoplossing verdunde parasitaire celsuspensie over te brengen naar een Neubauer-kamer (d.w.z. hemocytometer) totdat de stationaire fase is bereikt.
    OPMERKING: Gebruik de eerste passage na NNN Medium niet voor experimenten.
  6. Breng 1 × 105 van Leishmania stationaire groeifase promastigoten over in een nieuwe 25 cm2 celkweekkolf en voeg 5 ml van de gesupplementeerde MEM toe.
  7. Bewaak periodiek de groei van culturen met behulp van een Neubauer-kamer totdat de stationaire fase is bereikt.
    OPMERKING: Gebruik promastigotenculturen voor maximaal 7 passages in vitro om verlies van virulentie te voorkomen.

3. Leishmania-infectie

  1. Nadat u de stationaire groei van gekweekte parasieten hebt gecontroleerd, verwijdert u alle inhoud uit de kweekflessen en plaatst u deze in conische buisjes van 50 ml. Voeg een koude zoutoplossing toe om een eindvolume van 30 ml te bereiken.
  2. Centrifugeer driemaal gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1.600 × g . Gooi het bovenstaande na centrifugeren weg en suspendeer de pellet opnieuw in een koude zoutoplossing.
  3. Was de cellen om niet-levensvatbare parasieten te verwijderen en resusureer de pellet in 1 ml koude zoutoplossing. Leid de suspensie 5 maal langzaam door een spuit van 1 ml voorzien van een naald van 16 G om de parasietclusters te scheiden.
  4. Verwijder een aliquoot uit het monster om de parasietconcentratie in een hemocytometer te tellen met behulp van Eq (1).
    Concentratie van parasieten = gemiddelde van parasieten in 4 kwadranten × verdunningsfactor × 104 (1)
  5. Bereken de hoeveelheid Leishmania sp. Vereist voor het aantal gastheercellen dat moet worden geplateerd om een 10:1 parasiet:gastheercelverhouding te behouden (stap 1.27).
  6. Was de DC's door 1 ml zoutoplossing toe te voegen en de cellen driemaal te centrifugeren bij 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Breng de benodigde hoeveelheid Leishmania aan in elk putje van de celkweekplaat met 24 putjes (zie stap 3.5).
  8. Incubeer de DC's met parasieten gedurende 4 uur in een incubator bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 .

4. Immunokleuring voor flowcytometrie-analyse

  1. Was de cellen na infectie twee keer met 1 ml zoutoplossing om niet-geïnternaliseerde parasieten te verwijderen.
    OPMERKING: Het paneel met antilichaamklonen en fluorochromen staat vermeld in de materiaaltabel.
  2. Verdunde antilichamen (1:50) in fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer (1x PBS met 1% BSA) met een eindvolume van 50 μL per experimentele conditie.
    OPMERKING: Het is belangrijk om antilichamen te titreren voordat u gaat experimenteren om optimale kleuringsconcentraties te garanderen. In dit protocol werd 1:50 gebruikt na titratie-experimenten.
  3. Bereid een mastermix voor (1x PBS met 1% BSA + antistoffenmix). Draai en pipetteer 50 μL van het mengsel in putjes die cellen bevatten.
  4. Incubeer de DC's kort met de antilichaammix (anti-humaan CD1a, anti-humaan CCR7, anti-humaan CD83, anti-CD11c, anti-humaan CD209, anti-humaan HLA-DR) op ijs gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht.
  5. Was de cellen tweemaal met 1 ml koude kleuringsbuffer (1% FBS in 1x PBS) en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  6. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in 200 μl koudekleuringsbuffer.
  7. Ga verder met het verzamelen van gegevens op een flowcytometer.
    OPMERKING: Om optimale omstandigheden voor FACS-analyse te garanderen, moet de gegevensverzameling binnen 48 uur na het kleuren van het monster worden uitgevoerd. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de FlowJo-software.
    1. Open het FlowJo softwareprogramma en maak een nieuwe werkplek aan. Voeg de flowcytometriebestanden toe die moeten worden geanalyseerd door ze naar het werkruimtevenster te slepen.
    2. Klik op de buisnaam om de parameters voor zijverstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) te selecteren.
      OPMERKING: Flowcytometrische analyse van DC-rijping was gebaseerd op de expressie van CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 en HLA-DR.
    3. Teken met behulp van de tool polygoonpoort een poort rond de DC's. Dubbelklik op de geselecteerde omheinde cellen om een nieuw venster weer te geven. Voer een doublet-opschoning uit door de FSC-A- en FSC-H-parameters te selecteren. Teken met het gereedschap 'Veelhoek ' een nieuwe plot rond afzonderlijke cellen.
    4. Dubbelklik op de omheinde cellen en selecteer SSC- en CD11c-parameters om een poort met CD11c+ -cellen te genereren.
    5. Exporteer de gereinigde CD11c+ celpoort door deze te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op de poort en selecteer de optie Equivalente knooppunten selecteren . Klik met de rechtermuisknop en exporteer de poort samen met alle gecompenseerde parameters door deze op te slaan in een recent gemaakte map.
    6. Maak een nieuwe werkruimte door de onlangs opgeslagen bestanden te openen. Klik op Werkruimte en selecteer plug-ins | Voorbeeld omlaag | 30.000 tot 50.000 evenementen; druk op OK.
      OPMERKING: Aangezien TSNE zowel een tijdrovend als rekenkundig veeleisend proces is, wordt deze stap aanbevolen om het totale aantal geanalyseerde gebeurtenissen te verminderen.
    7. Klik met de rechtermuisknop op een gedownsampled bestand en selecteer equivalente knooppunten.
    8. Klik met de rechtermuisknop op een gedownsampled bestand en selecteer Exporteren/aaneenschakelen.
    9. Klik op het aaneengesloten venster en selecteer alle gecompenseerde parameters. Selecteer de aaneengeschakelde bestanden en klik op werkruimte | plug-in | tSNE.
    10. Selecteer de gewenste parameters (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 en CD11c) om clusters te maken. Druk op OK.
    11. Klik op het aaneengeschakelde bestand om de parameters tSNE1 en tSNE2 te visualiseren.

5. Actine immunokleuring

  1. Plaat geïnfecteerde DC's op dekglaasjes geplaatst in platen met 24 putjes. Centrifugeer de platen gedurende 10 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Was cellen 3x met steriele zoutoplossing na infectie bij kamertemperatuur om eventuele extracellulaire parasieten te verwijderen.
  2. Incubeer de DC's met 500 μL 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het paraformaldehyde en voeg 1 ml zoutoplossing toe (zie tabel 1).

6. Immuno-etikettering

NOTITIE: Voer de volgende stappen uit onder roeren.

  1. Was de dekglaasjes met 1x PBS gedurende 5 min; Herhaal 3x. Voeg 500 μL ammoniumchloride-oplossing per putje toe; Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Was de dekglaasjes met 1x PBS gedurende 5 min; Herhaal 3x.
  3. Permeabiliseer het membraan met 0,15% saponine gedurende 15 minuten.
  4. Blokkeer gedurende 1 uur met 1x PBS 1x/3% BSA/0,15% saponine. Was de dekglaasjes 5 minuten met 1x PBS/0,15% saponine; Herhaal 3x.
  5. Incubeer de cellen gedurende 1 uur met falloïdine (1:1.200) verdund in 1x PBS/1% BSA/0,15% saponine. Was de dekglaasjes 5 minuten met 1x PBS/0,15% saponine; Herhaal 3x.
  6. Plaats de dekglaasjes met de cellen naar beneden op het montagemedium met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). Dek de dia's af met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen.
  7. Verkrijg afbeeldingen met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop met een 63x/1.4 objectief.

7. Confocale microscopie acquisitie en Fiji kwantificering

  1. Leg immunofluorescentiebeelden vast met behulp van een confocale laserscanmicroscoop (zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik voor de beste resolutie een 63x objectieve olie-onderdompelingslens.
  2. Bescherm de dekglaasjes tegen licht en laat ze minimaal 30 minuten op kamertemperatuur staan voordat u ze aanschaft.
  3. Gebruik absorberend weefsel om de dekglaasjes schoon te maken. Voeg een druppel immersieolie toe aan het objectief en plaats het objectglaasje op de microscooptafel. Selecteer het 63x objectief met olie, til het platform op totdat de olie het objectglaasje raakt en pas de scherpstelling op de microscoop aan.
  4. Open het programma en activeer de lasergolflengten van 488, 552 en 405 nm.
  5. Stel de beeldresolutie in op 1024 x 1024 pixels.
  6. Klik op live onder, stel de Z-stapel in en druk op Begin. Herhaal dit proces en druk vervolgens op de knop Beëindigen .
  7. Wacht tot de beeldacquisitie is voltooid en selecteer vervolgens de optie Maximale projectie in extra.
  8. Sla het experiment op en exporteer de afbeeldingen in .lif-formaat naar een computer.
  9. Open het FIJI-programma, open het experiment in FIJI en stel de weergavestapel in op Hyperstack.
  10. Selecteer geopende afbeeldingsbestanden afzonderlijk | tegels naaien.
  11. Selecteer het gereedschap voor de vrije hand in de Fiji-werkbalk en teken elke cel zorgvuldig met de hand. Druk op analyseren | meten om de fluorescentie-intensiteit te visualiseren. Herhaal dit proces voor elk celtype per groep.
  12. Sla de metingen op en exporteer ze naar een spreadsheet. Open het bestand met gegevens met behulp van statistische analysesoftware (zie de materiaaltabel) om statistische analyse uit te voeren.

8. Statistische analyse

  1. Open een nieuw project in de software.
  2. Gebruik voor gegevens met een normale verdeling de t-toets van de student; gebruik voor niet-parametrische gegevens de Mann-Whitney U-test .
  3. Plak de waarden die zijn verkregen uit de experimentele resultaten in de tabel.
  4. Selecteer beschrijvende statistieken en kies de optie kolom statistieken [alle tests] om de gegevensdistributie te analyseren.
    OPMERKING: Als de gegevens de Gauss-verdeling volgen, kiest u de t-toets om monsters te onderzoeken door twee paren te vergelijken. Als de verdeling niet-Gaussiaans is, analyseer dan gegevens met behulp van de Mann-Whitney U-test met centrale tendensmaten (gemiddelden of medianen) en variatiematen.
  5. Kies de beste grafiekoptie voor een optimale gegevensweergave.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit rapport onderzoekt de rol van DC's bij Leishmania-infectie met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie. Aanvankelijk werd het fenotypische profiel van de van menselijke monocyten afgeleide DC vastgesteld. Met name de verkregen CD11c+ dendritische celpopulaties waren positief voor CCR7, CD209, CD80, CD1a en HLA-DR. De resultaten geven aan dat de expressie van deze markers in DC-populaties sterk wordt beïnvloed door Leishmania-infectie. Geïnfecte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Leishmaniasis is wereldwijd een ernstig probleem voor de volksgezondheid. De pathogenese van deze ziekte is vrij complex en de mechanismen die de overleving van parasieten in gewervelde gastheren bevorderen, blijven ongrijpbaar17. DC's zijn professionele antigeenpresenterende cellen die door het hele lichaam worden aangetroffen, inclusief filter- en lymfoïde organen. Na het vastleggen en verwerken van antigeen, ondergaan onrijpe DC's een complex rijpingsproces dat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken het Gonçalo Moniz Institute (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brazilië) en de afdeling microscopie voor hun hulp. De auteurs zijn Andris K. Walter dankbaar voor kritische analyse, Engelse taalrevisie en hulp bij het redigeren van manuscripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti CCR7Thermo
anti CD209Isofarma
anti CD83Leica SP8
anti HLA-DRGibco
Bovine serum albuminThermoA2153-100GSigma
CiprofloxacinGibco
confocal microscopeThermo Fisher Scientific
Fetal bovine serumGibco
Flow JoThermo Fisher Scientific
GentamicinThermo Fisher Scientific
GlutaminGibco
HEPESThermo Fisher Scientific
phalloidinThermo Fisher Scientific
Phosphate buffer solutionPeprotech
prolong gold antifade kitBD pharmigen
RPMIBD pharmigen
SaponinBD pharmigen47036 – 50G – FSigma
Schneider's insect mediumsoftware BD biosciences

Referenties

  1. Torres-Guerrero, E., Qunitanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenhjaud, J., Arenas, R. Leishmaniasis: a review. F1000 Research. 6, 750(2017).
  2. Pace, D. Leishmaniasis. Journal of Infection. 69, Suppl 1 10-18 (2014).
  3. Reithinger, R., et al. Cutaneous leishmaniasis. Lancet. Infectious Diseases. 7 (9), 581-596 (2007).
  4. Kaye, P., Scott, P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. Nature Reviews. Microbiology. 9 (8), 604-615 (2011).
  5. Handman, E., Bullen, D. V. Interaction of Leishmania with the host macrophage. Trends in Parasitology. 18 (8), 332-334 (2002).
  6. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  7. Kamhawi, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes. Trends in Parasitology. 22 (9), 439-445 (2006).
  8. Guilliams, M., et al. Unsupervised high-dimensional analysis aligns dendritic cells across tissues and species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  9. Moll, H. Dendritic cells and host resistance to infection. Cellular Microbiology. 5 (8), 493-500 (2003).
  10. Sundquist, M., Rydstrom, A., Wick, M. J. Immunity to Salmonella from a dendritic point of view. Cellular Microbiology. 6 (1), 1-11 (2004).
  11. Saban, D. The chemokine receptor CCR7 expressed by dendritic cells: A key player in corneal and ocular surface inflammation. Ocular Surface Journal. 12, 87-99 (2014).
  12. Relloso, M., et al. DC-SIGN (CD209) Expression is IL-4 dependent and it is negatively regulated by IFN, TGF and inflammatory agents. Journal of Immunology. 168 (6), 2634-2643 (2002).
  13. Leon, B., Lopez-Bravo, M., Ardavin, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  14. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  15. Ashok, D., Acha-Orbea, H. Timing is everything: dendritic cell subsets in murine Leishmania infection. Trends in Parasitology. 30 (10), 499-507 (2014).
  16. Carvalho, A. K., et al. Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis promote differential expression of dendritic cells and cellular immune response in murine model. Parasite Immunology. 34 (8-9), 395-403 (2012).
  17. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  18. Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3012-3017 (2012).
  19. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1263-1272 (1994).
  20. Suzuki, H., et al. Activities of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 on monocytes. American Journal of Hematology. 75 (4), 179-189 (2004).
  21. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews. Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  22. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 1795(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differentiatie van dendritische cellenmarkers voor dendritische cellenantigeenpresentatiemodulatie van de immuunresponsMHC II expressiecostimulatorische moleculenrijping van DC spathogenenvangst
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen