Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62795

⸱

14 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 2Department of Biology, University of Florence, 3National Institute of Optics, National Research Council, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5Department of Neurosciences, Psychology, Drugs and Child Health, University of Florence, 6Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Samenvatting

Zowel genetische als niet-genetische hartaandoeningen kunnen ernstige remodelleringsprocessen in het hart veroorzaken. Structurele remodellering, zoals collageenafzetting (fibrose) en cellulaire uitlijning, kan de elektrische geleiding beïnvloeden, elektromechanische disfuncties introduceren en uiteindelijk leiden tot aritmie. De huidige voorspellende modellen van deze functionele veranderingen zijn gebaseerd op niet-geïntegreerde structurele informatie met een lage resolutie. Het plaatsen van dit raamwerk op een andere orde van grootte is een uitdaging vanwege de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden bij het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie in massief weefsel. In dit werk beschrijven we een methodologisch raamwerk dat beeldvorming van hele muizenharten met micrometrische resolutie mogelijk maakt. Het bereiken van dit doel heeft een technologische inspanning vereist waarbij vooruitgang in weefseltransformatie en beeldvormingsmethoden zijn gecombineerd. Ten eerste beschrijven we een geoptimaliseerd CLARITY-protocol dat in staat is om een intact hart te transformeren in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidenvrije vorm die een hoge transparantie en diepe kleuring mogelijk maakt. Vervolgens wordt een fluorescentie lichtplaatmicroscoop beschreven die in staat is om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopisch gezichtsveld (mm-schaal) met de resolutie op micronschaal. In navolging van het mesoSPIM-project maakt de bedachte microscoop de reconstructie van het hele muizenhart met micrometrische resolutie in een enkele tomografische scan mogelijk. Wij geloven dat dit methodologische kader het mogelijk zal maken om de betrokkenheid van de cytoarchitectuur-wanorde in de elektrische disfuncties te verduidelijken en de weg vrij te maken voor een uitgebreid model dat zowel de functionele als structurele gegevens beschouwt, waardoor een uniform onderzoek mogelijk wordt naar de structurele oorzaken die leiden tot elektrische en mechanische veranderingen na de weefselremodellering.

Inleiding

Structurele remodellering geassocieerd met hartaandoeningen kan de elektrische geleiding beïnvloeden en elektromechanische disfuncties van het orgaan introduceren 1,2. Huidige benaderingen die worden gebruikt om functionele veranderingen te voorspellen, maken vaak gebruik van MRI en DT-MRI om een algehele reconstructie van fibroseafzetting, vasculaire boom en vezelverdeling van het hart te verkrijgen, en ze worden gebruikt om preferentiële actiepotentiaalvoortplanting (APP) -paden over het orgaan te modelleren 3,4. Deze strategieën kunnen een mooi overzicht geven van de hartorganisatie. Hun ruimtelijke resolutie is echter onvoldoende om de impact van structurele remodellering op de hartfunctie op cellulair niveau te onderzoeken.

Het plaatsen van dit raamwerk in een andere orde van grootte, waar afzonderlijke cellen individuele rollen kunnen spelen bij de verspreiding van actiepotentialen, is een uitdaging. De belangrijkste beperking is de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden om beeldvorming met hoge resolutie (micrometrische resolutie) uit te voeren in massieve (centimetergrote) weefsels. In feite is het afbeelden van biologische weefsels in 3D met hoge resolutie erg ingewikkeld vanwege weefselondoorzichtigheid. De meest gebruikelijke aanpak om 3D-reconstructies in hele organen uit te voeren, is het voorbereiden van dunne secties. Nauwkeurige secties, assemblage en beeldvorming vereisen echter aanzienlijke inspanning en tijd. Een alternatieve aanpak die niet vereist dat het monster wordt gesneden, is het genereren van een transparant weefsel. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het ophelderen van weefsels voorgesteld 5,6,7,8. De uitdaging om massieve, transparante en fluorescerend gelabelde weefsels te produceren, is onlangs bereikt door echte weefseltransformatiebenaderingen te ontwikkelen (CLARITY9, SHIELD10). In het bijzonder is de CLARITY-methode gebaseerd op de transformatie van een intact weefsel in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidevrije vorm die het mogelijk maakt om hoge transparantie te verlenen door de selectieve verwijdering van membraanlipide-bilayers. Opmerkelijk is dat deze methode ook succesvol is gebleken bij hartvoorbereiding 11,12,13,14. Omdat het hart echter te kwetsbaar is om geschikt te zijn voor een actieve opruiming, moet het worden geklaard met behulp van de passieve benadering, die veel tijd nodig heeft om volledige transparantie te verlenen.

In combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals light-sheet microscopie, heeft CLARITY het potentieel om 3D massieve hartweefsels met micrometrische resolutie in beeld te brengen. Bij lichtplaatmicroscopie wordt de verlichting van het monster uitgevoerd met een dunne vellen licht die zijn opgesloten in het brandpuntsvlak van het detectieobjectief. De fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het verlichtingsvlak15. De detectiearchitectuur is vergelijkbaar met widefield-microscopie, waardoor de acquisitie veel sneller is dan laserscanmicroscopen. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen, kan een volledige tomografie van grote monsters worden verkregen, tot centimeters groot. Vanwege de intrinsieke eigenschappen van de Gaussische bundel is het echter mogelijk om een zeer dunne (in de orde van enkele micron) lichtplaat alleen voor een beperkte ruimtelijke uitbreiding te verkrijgen, waardoor het gezichtsveld (FoV) drastisch wordt beperkt. Onlangs is een nieuw excitatieschema geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en toegepast voor beeldvorming van de hersenen, waardoor 3D-reconstructies met isotrope resolutie16 mogelijk zijn.

In dit document wordt een passieve clearingbenadering gepresenteerd, waardoor de clearingtiming die nodig is voor het CLARITY-protocol aanzienlijk kan worden verminderd. Het hier beschreven methodologische raamwerk maakt het mogelijk om een heel muizenhart met micrometrische resolutie te reconstrueren in een enkele tomografische scan met een acquisitietijd in de orde van minuten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierbehandeling en -procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en in overeenstemming met de beginselen en voorschriften van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (protocolnummer 647/2015-PR). Alle dieren werden geleverd door ENVIGO, Italië. Voor deze experimenten werden 5 mannelijke C57BL/6J muizen van 6 maanden oud gebruikt.

1. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,6) in een chemische kap. Bewaar de 4% PFA aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.
  2. Hydrogeloplossing bereiden: Meng 4% Acrylamide, 0,05% Bis-acrylamide, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in een chemische kap. Bewaar de reagentia en de oplossing gedurende de gehele bereiding op ijs. Bewaar de hydrogel aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.
  3. Bereid clearingoplossing voor: Meng 200 mM boorzuur, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water; pH 8,6 in een chemische kap. Bewaar de oplossing tussen 21-37 °C om SDS-neerslag te voorkomen.
  4. Bereid verse Tyrode-oplossing op de dag van het experiment: voeg 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 en 4,7 mM KCl toe; titreer tot pH 7,4 met 1 M NaOH.

2. Hartisolatie

  1. Injecteer 0,1 ml 500 I.U. Heparine subcutaan 30 minuten vóór de hartisolatieprocedure.
  2. Vul een spuit van 30 ml en drie petrischalen van 6 cm met verse Tyrode-oplossing. Maak een kleine scheur (3-4 mm diep) op de rand van een van de petrischalen en plaats deze onder een stereoscopische microscoop.
  3. Bevestig een canule met een diameter van 1 mm op de spuit en steek deze in de spleet van de petrischaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten.
  4. Vul een spuit van 20 ml met 4% PFA en bewaar deze in de chemische kap. Maak een lege petrischaal onder de motorkap.
  5. Verdoof de muis met 3% isofluraan/zuurstof bij een stroomsnelheid van 1,0 l/min en offer deze op door cervicale dislocatie volgens de geldende dierenwelzijnsregels.
  6. Verwijder na het offer de vacht over de borst en open de borst om volledige toegang tot het hart te hebben.
  7. Isoleer het hart, dompel het onder in de petrischaal die eerder gevuld was met 50 ml Tyrode-oplossing. Gebruik een chirurgische schaar om de aorta direct in de buurt van de aortaboog te knippen om het hart bloot te leggen.
  8. Breng het hart over onder een stereoscopische microscoop en voer de cannulatie zorgvuldig uit. Steek de canule niet te diep in de aorta (niet meer dan 2 mm) om weefselschade te voorkomen.
  9. Gebruik een kleine klem en een hechtdraad (maat 5/0) om het hart aan de canule te bevestigen.
  10. Perfuseer het hart met 30 ml van de Tyrode-oplossing met een constante druk van 10 ml / min om bloed uit de bloedvaten te verwijderen.
  11. Maak de canule los van de spuit en plaats het hart in de petrischaal gevuld met Tyrode-oplossing. Pas op dat u geen luchtbellen in de canule heeft; verwijder anders de luchtbellen op de juiste manier.
  12. Bevestig de spuit van 20 ml gevuld met koude 4% PFA aan de canule en perfuseer het hart met dezelfde constante druk.
  13. Incubeer het hart in 10 ml van 4% PFA bij 4 °C 's nachts (O/N). Om weefselafbraak te voorkomen, voert u stappen 2.6-2.13 in de kortst mogelijke tijd uit.

3. Hart opruiming

  1. Was de volgende dag het hart in 0,01 M PBS 3 keer bij 4 °C gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden bewaard in PBS + 0,01% natriumazide (NaN3) bij 4 °C.
  2. Incubeer het hart in 30 ml Hydrogel-oplossing bij schudden (15 tpm) bij 4 °C gedurende 3 dagen.
  3. Ontgas het monster bij kamertemperatuur met behulp van een droger, een vacuümpomp en een buizensysteem dat de droger verbindt met zowel de pomp als een stikstofleiding.
    1. Plaats het monster in de droger en open de injectieflacon, houd de dop erop.
    2. Sluit de droger en haal de zuurstof uit de buis door de stikstofleiding te openen.
    3. Zet de vacuümpomp aan om de zuurstof gedurende 10 minuten uit de droger te verwijderen.
    4. Schakel de pomp uit en gebruik de knop van de droger om de stikstofleiding te openen. Zodra de druk gelijk is aan de atmosferische druk, opent u de droger voorzichtig en sluit u de injectieflacon snel.
  4. Houd het hart in de ontgaste Hydrogel-oplossing bij 37 °C gedurende 3 uur in rust.
  5. Wanneer de Hydrogel goed gepolymeriseerd is en er volledig gelatineus uitziet, verwijdert u voorzichtig het hart en plaatst u het in de monsterhouder.
  6. Plaats de monsterhouder met het hart in een van de opruimkamers en sluit deze goed om lekken van de opruimoplossing te voorkomen.
  7. Schakel het waterbad in waar de container met de opruimoplossing is geplaatst en de peristaltische pomp om de recirculatie van de opruimoplossing te starten.
  8. Vervang de opruimoplossing in de container eenmaal per week om de verduidelijkingsprocedure te versnellen.

4. Kleuring van het celmembraan

  1. Zodra het hart volledig helder lijkt, verwijdert u het uit de monsterhouder en wast u het gedurende 24 uur in 50 ml opgewarmde PBS. Was opnieuw in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) gedurende 24 uur.
  2. Incubeer het monster in 0,01 mg / ml Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x bij schudden (50 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 7 dagen.
  3. Was het monster na de incubatie van 7 dagen in 50 ml PBS-T 1x bij kamertemperatuur in schudden gedurende 24 uur.
  4. Incubeer het monster in 4% PFA gedurende 15 minuten en was het vervolgens 3 keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden opgeslagen in PBS + 0,01% NaN3 bij 4 °C.
  5. Incubeer het hart in toenemende concentraties van 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% en 47% TDE/PBS) gedurende elk 8 uur, tot de uiteindelijke concentratie van 68% TDE in 0,01 M PBS om de vereiste brekingsindex (RI = 1,46) te leveren. Dit is het RI matching medium (RI-medium) om beelden te verkrijgen16.

5. Hartmontage en -acquisitie

OPMERKING: Alle componenten van het optische systeem worden in detail vermeld in de tabel met materialen.

  1. Vul voorzichtig ongeveer 80% van het externe cuvette (kwarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) met het RI-medium.
    OPMERKING: Hier is het mogelijk om verschillende niet-vluchtige oplossingen te gebruiken die een RI van 1,46 garanderen.
  2. Vul het interne cuvet (kwarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) voorzichtig met hetzelfde RI-medium.
  3. Dompel het monster onder in de interne cuvette. De hierboven beschreven monsterincubaties zorgen ervoor dat het monster stabiel blijft in het RI-medium zonder te worden vastgehouden.
  4. Verplaats het monster voorzichtig naar de bodem van de cuvette met een dun pincet en rangschik het hart met zijn lengteas evenwijdig aan de hoofdas van de cuvette om het excitatielichtpad door het weefsel tijdens het scannen te minimaliseren.
  5. Bevestig de op maat gemaakte plug voorzichtig boven de interne cuvette met twee schroeven.
  6. Monteer het monster met behulp van de magneten op de microscooptrap.
  7. Vertaal de verticale monstertrap handmatig om de interne cuvette onder te dompelen in de externe.
  8. Schakel de excitatielichtbron (golflengte van 638 nm) in en stel een laag vermogen in (in de orde van grootte van 3 mW).
  9. Verplaats het monster met behulp van de gemotoriseerde vertaler om een binnenvlak van het weefsel te verlichten.
  10. Schakel de beeldbewerkingssoftware (HCImageLive) in en stel de cameratrigger in op de externe (light-sheet) modus om de acquisitietrigger van de camera aan te sturen door de aangepaste software die de volledige installatie regelt.
  11. Schakel Automatisch opslaan in het deelvenster Scaninstellingen in en stel de uitvoermap in waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen.
  12. Pas de monsterpositie in het XY-vlak handmatig aan met de lineaire vertalers om het monster naar het midden van de FoV van de camerasensor te verplaatsen.
  13. Verplaats het monster langs de Z-as met behulp van de lineair gemotoriseerde vertaler om hartgrenzen te identificeren voor tomografische reconstructie.
  14. Verhoog het laservermogen tot ~20 mW, klaar voor de beeldverwerkingssessie.
  15. Start de tomografische acquisitie, klik op de knop Start in het sequence panel van de imaging software en verplaats tegelijkertijd het monster langs de Z-as met de constante snelheid van 6 μm/s met behulp van de gemotoriseerde vertaler.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De ontwikkelde passieve clearing setup maakt het mogelijk om een geklaard volwassen muishart (met een afmeting van de orde 10 mm x 6 mm x 6 mm) te verkrijgen in ongeveer 3 maanden. Alle componenten van de opstelling zijn gemonteerd zoals weergegeven in figuur 1. De verwaarloosbare temperatuurgradiënt tussen elke clearingkamer (in de orde van 3 °C) maakt het mogelijk om de temperatuur in alle kamers in een goed bereik te houden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk werd een succesvolle aanpak geïntroduceerd om een heel muizenhart op hoge resolutie te zuiveren, te beitsen en in beeld te brengen. Eerst werd een weefseltransformatieprotocol (CLARITY) geoptimaliseerd en uitgevoerd, enigszins aangepast voor de toepassing ervan op het hartweefsel. Inderdaad, om een efficiënte reconstructie in 3D van een heel hart te verkrijgen, is het essentieel om het fenomeen van lichtverstrooiing te voorkomen. De CLARITY-methodologie stelt ons in staat om een zeer transparant intact hart t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 952166 (REPAIR), MUR in het kader van het FISR-programma, project FISR2019_00320 en Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-2’ ThiodiethanolSigma-Aldrich166782
AcrylamideBio-Rad61-0140
AV-044 InitiatorWako ChemicalsAVP5874
Bis-AcrylamideBio-Rad161-042
Boric AcidSigma-AldrichB7901
CameraHamamatsuOrca flash 4.0 v3
Camera softwareHamamatsuHC Image
Collimating lensThorlabsAC254-050-A-ML
Detection armIntegrated optics0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lensNikon91863
Exteraìnal quartz cuvettePortmann InstrumentsUQ-753
Fold mirrorsThorlabsBBE1-E02
Galvanometric mirrorThorlabsGVS211/M
GlucoseSigma-AldrichG8270
HCImage LiveHamamatsu4.6.1.19
HEPESSigma-AldrichH3375
Internal quartz cuvettePortmann InstrumentsUQ-204
KClSigma-AldrichP4504
Laser sourceIntegrated Optics0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filterThorlabsFELH0650
Magnetic baseThorlabsKB25/M
MgCl2Chem-LabCI-1316-0250
Motorized traslatorPhysisk InstrumentM-122.2DD
NaClSigma-Aldrich59888
ObjectiveThorlabsTL2X-SAP
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Phosphate Buffer SolutionSigma-AldrichP4417
Polycap ASWhatman2606T
Relay lensQioptiqG063200000
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL3771
Tube lensThorlabsACT508-200-A-ML
Tunable lensOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pumpKNF Neuberger IncN86KT.18
Water bathMemmertWTB

Referenties

  1. Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
  2. Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
  3. Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
  4. Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
  5. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  6. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).
  9. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  10. Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73(2019).
  11. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).
  12. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
  13. Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
  14. Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
  15. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
  16. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  17. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).
  18. Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).
  19. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Light-sheetmicroscopieCLARITY-protocolweefselklaringtomografische reconstructiebeeldvorming van hartweefselhydrogel-inbeddingrefractive index matchingcellulaire membraanresolutie
Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.