Gelijktijdige Brightfield, Fluorescentie en Optische Coherentie Tomografische Beeldvorming van Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Summary

Dit protocol presenteert een verzameling sarcomere, calcium en macroscopische geometrische gegevens van een actief samentrekkende cardiale trabecula ex vivo. Deze gelijktijdige metingen worden mogelijk gemaakt door de integratie van drie beeldvormende modaliteiten.

Abstract

In hartspier activeren intracellulaire Ca²⁺ transiënten contractiele myofilamenten, wat contractie, macroscopische verkorting en geometrische vervorming veroorzaakt. Ons begrip van de interne relaties tussen deze gebeurtenissen is beperkt omdat we niet in de spier kunnen 'zien' noch precies de spatio-temporele aard van excitatie-contractiedynamiek kunnen volgen. Om deze problemen op te lossen, hebben we een apparaat gebouwd dat een reeks beeldverwerkingsmodaliteiten combineert. In het bijzonder integreert het een brightfield-microscoop om lokale veranderingen van sarcomerelengte en weefselspanning te meten, een fluorescentiemicroscoop om de Ca^{2 +} transiënte te visualiseren en een optische coherentietomografie om de geometrische veranderingen van het weefsel tijdens de loop van een hartcyclus vast te leggen. We presenteren hier de beeldvormingsinfrastructuur en het bijbehorende framework voor gegevensverzameling. Gegevens worden verzameld uit geïsoleerde staafachtige weefselstructuren die bekend staan als trabeculae carneae. In ons instrument houden een paar positiegestuurde platinahaken elk uiteinde van een ex vivo spiermonster vast terwijl het continu wordt oversmolten met een voedingsrijke zoutoplossing. De haken staan onder onafhankelijke controle, waardoor real-time controle van spierlengte en kracht mogelijk is. In de lengte kan het monster in de lengte worden gescand, waardoor beperkingen in verband met de relatieve grootte van het microscoopbeeldvenster (540 μm bij 540 μm) en de lengte van een typische trabecula (>2000 μm) worden overschreden. Platinaelektroden aan beide uiteinden van de spierkamer stimuleren de trabecula met een door de gebruiker gedefinieerde snelheid. We gebruiken het stimulatiesignaal als trigger voor het synchroniseren van de gegevens uit elk beeldvenster om het hele monster te reconstrueren dat onder steady-state omstandigheden trilt. Het toepassen van beeldverwerkingstechnieken op deze brightfield beeldvormingsgegevens zorgt voor weefselverplaatsing en sarcomere lengtekaarten. Een dergelijke verzameling van gegevens, wanneer opgenomen in een experiment-modellering pijpleiding, zal een dieper begrip van spier contractiele homogeniteit en heterogeniteit in fysiologie en pathofysiologie.

Introduction

Superfusie van geïsoleerde hartspierweefselpreparaten is een standaard en veel gebruikt protocol voor het bestuderen van cardiale ionische activering en^{mechanica 1}. In het bijzonder heeft de isolatie van trabeculae, staafachtige structuren van de ventriculaire wanden, de beoordeling mogelijk gemaakt van verschijnselen, waaronder de lengteafhankelijke activering van contractie^2,rekafhankelijke respons van contractie^3,4en diastolische visco-elasticiteit⁵ van hartweefsel. Ter Keurs, de initiatiefnemer van deze techniek van het superfusing van geïsoleerde trabeculae, gebruikte aanvankelijk een combinatie van fluorescentiebeeldvorming voor Ca²⁺ metingen en laserdiffractie voor het bepalen van sarcomerelengtes^2,5. Sinds deze vroege studies is het steeds gebruikelijker geworden om sarcomere lengte-informatie met een grotere ruimtelijke resolutie te extraheren met behulp van 2D fast Fourier transform (FFT)-gebaseerde technieken⁶ op brightfield microscopiebeelden. De twee beeldvormingssystemen maken een gedeeltelijke beoordeling mogelijk van de onderliggende relatie tussen Ca²⁺ afgifte en sarcomere lengte-afhankelijke krachtproductie.

Hartspier is geried, met de zichtbare banderolleren geassocieerd met een onderliggende reeks contractiele eenheden bestaande uit dikke en dikke filamenten. De interactie van deze samenstellende filamenten waaruit sarcoom bestaat, ligt ten grondslag aan krachtgeneratie, die als volgt begint: een depolariserend elektrisch signaal, of actiepotentieel, zorgt ervoor dat spanningsafhankelijke L-type Ca²⁺ kanalen in het celmembraan openen; de daaropvolgende cellulaire instroom van Ca²⁺ induceert de afgifte van Ca²⁺ uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR), een intracellulaire Ca²⁺ opslag, in een proces dat bekend staat als Ca²⁺-geïnduceerde Ca²⁺ afgifte⁷; deze plotselinge toename van de intracellulaire Ca²⁺ concentratie van nanomoulier tot micromolar bereik maakt krachtproductie mogelijk; Ca²⁺ pompen extruderen ca²⁺ continu uit de cytosol terug in het SR- en extracellulaire compartiment; wanneer de intracellulaire Ca²⁺ concentratie terugkeert naar het nanomolarenwaaier, stopt de krachtproductie en ontspant de spier. Tijdens de krachtproductie glijden de dikke en dunne filamenten over elkaar heen. De sarcoomlengte bepaalt de relatieve mate van overlap en dus het potentieel voor krachtproductie van de spier macroscopisch.

In dit artikel breiden we deze fluorescentie-brightfield beeldvormingstechnieken uit met optische coherentietomografie (OCT). OCT maakt gebruik van het fysische principe van interferentie en is in staat om de geometrische vervorming van weefsel te verkrijgen om spiercontractiele heterogeniteit te begrijpen⁸. Ons apparaat (figuur 1) maakt gebruik van een spectral-domein OCT (SD-OCT) systeem. In SD-OCT splitst een bundelsplijter het licht van een breedband superluminescente diode van korte coherentielengte in referentie- en meetarmen. De referentiearm bevat een vaste spiegel en de meetarm bevat een 2D-galvanometer om het licht te sturen. Het licht dat uit het monster wordt teruggekaatst, wordt verzameld en interfereert met het gereflecteerde licht in de referentiearm om een interferentiepatroon te vormen. De diepte-informatie is gecodeerd in de frequentie van de spectrale rand. Om de informatie te extraheren, wordt het signaal door een spectrometer doorgegeven en wordt een omgekeerde FFT op het resultaat toegepast. Het overeenkomstige 1D-signaal vertegenwoordigt de structuren op verschillende diepten, wat overeenkomt met veranderingen in brekingsindex⁹ (A-scan). Door de laser in één as te sturen, kan men een dwarsdoorsnede van het interessemonster (B-scan) construeren en op dezelfde manier, door het proces in een stapsgewijs patroon in de resterende as te herhalen, kan een driedimensionaal beeld worden gegenereerd (C-scan). Bij uitbreiding kan men een reeks B-scans verzamelen in één segment voor een herhalend tijds variërend onderwerp op basis van een externe trigger en herhalen om een driedimensionale scan te genereren, die een tijdsverlengende planaire afbeelding¹⁰vertegenwoordigt.

Bij de integratie van de drie beeldvormingssystemen hebben we de volgende twee principes overwogen. Ten eerste mogen beeldsensoren geen licht detecteren van een alternatieve beeldvormingsmodaliteit, en ten tweede moet het fysieke ontwerp vrije ruimte bevatten voor ten minste drie gelijktijdige beeldvormingsvlakken. Om aan de eerste eis te voldoen, gebruikt de brightfield-microscoop een 660 nm golflengte-LED om het monster in een omgekeerde configuratie te verlichten. De fluorescentiemicroscoop bevindt zich in een epifluorescentieconfiguratie waarbij dezelfde objectieve lens wordt gebruikt voor zowel excitatie als verzameling van het uitgestraalde licht. Het excitatielicht heeft een golflengte tussen 340 nm en 380 nm, en een fotomultiplicatorbuis (PMT) meet het uitgestraalde licht op een golflengte van 510 nm. Een paar dichroïsche spiegels stelt deze twee optische paden in staat om dezelfde fysieke voetafdruk te delen zonder de tegenovergestelde meting te verstoren (figuur 2). Ten slotte maakt de LGO gebruik van breedbandlicht (100 nm spectrale breedte) met een centrale golflengte van 840 nm, verschillend van de andere twee modaliteiten. Vanwege de lage coherentie van het licht dat voor OCT wordt gebruikt, zal strooi licht van de brightfield-fluorescentiebronnen niet bijdragen aan het interferentiepatroon dat diepte-informatie codeert. Voor de tweede vereiste heeft het behuizingsontwerp voor de capillaire buis toegankelijke optische paden naar de voorste, inferieure en superieure vlakken van het monster. Tijdens experimenten houden twee platinahaken een trabecula vast in een capillaire buis doordrenkt met zuurstofhoudende Krebs-Henseleit (KH) oplossing. De galvanometerkop van de OCT is orthogonaal gericht op de brightfield-fluorescentie beeldvormingsroute om te profiteren van het derde orthogonale optische vlak (figuur 3).

Dit artikel schetst de ontwerpoverwegingen voor het bouwen van een apparaat dat tegelijkertijd calcium, sarcomerelengte en spiergeometrie kan weergeven. Om deze meetcapaciteiten aan te tonen, beschrijven we het proces van het isoleren van een ventriculaire trabecula, de voorbereiding van de nodige bufferoplossingen, samen met de kritieke stappen die betrokken zijn bij de behandeling en fluorescentiebelasting van een ex vivo trabecula. Ten slotte schetst dit document de processen die nodig zijn om de gegevensset te vertalen naar nuttigere visualisaties.

Protocol

De Animal Ethics Committee van de Universiteit van Auckland keurde de behandeling van ratten en de bereiding van weefselmonsters goed.

1. Beeldkalibratie

1. Brightfield microscoop pixel kalibratie
   1. Vul de meetkamer met gedestilleerd water.
   2. Plaats een diffractierooster met bekende lijnen per μm in de meetkamer.
   3. Druk op F1 om de opname mogelijk te maken en pas de framesnelheid [Hz] aan totdat het diffractierooster duidelijk zichtbaar is (figuur 4A). Zorg ervoor dat het diffractierooster parallel loopt met de rand van het frame. Druk nogmaals op F1 om de opname te stoppen.
   4. Stel de total images in op Capture? op één, druk op Ctrl + Shift + S om gegevens naar schijf te streamen en druk op F1 om een afbeelding van het diffractierooster vast te leggen.
   5. Open ImageJ en importeer de diffractie rasp afbeelding(File > Open > Select Calibration image). Houd shift ingedrukt, teken een lijn die 20 lichte en donkere banden van het diffractierooster omvat.
   6. Kalibreer de afbeelding (Analyseer > Schaal instellen). De lengte van de lijn vanaf stap 1.1.5 stelt de waarde Afstand in pixels in. Stel de waarde bekende afstand in op 20 keer de lijnen per μm-meting en de lengte-eenheid op μm. De inverse van de schaal is het aantal micrometers dat wordt weergegeven door een pixel.
2. KALIBRATIE VAN DE OCT-diepteresolutie
   1. Meet de dikte van een glasmicroscoopschuif met vernier remklauwen.
   2. Schakel de OCT-laserbron in.
   3. Bedek de galvanometerkop en klik op BG kregen om het achtergrondinterferentiepatroon te meten en af te trekken van de meting (figuur 4B).
   4. Klem de gemeten glasmicroscoopschuif (vanaf stap 1.2.1) in de meetarm van de OCT.
   5. Klik op Live Stream om de OCT-afbeelding weer te geven. Pas de schuif van de glasmicroscoop aan totdat deze zichtbaar is binnen de B-scan.
   6. Als u de B-scanafbeelding wilt vastleggen, stelt u Bereik Y (Stappen) in op één, klikt u op B-scangegevens streamen?en klikt u op Verkrijgen.
   7. Importeer de B-scan afbeelding in ImageJ (File > Open > Select B-scan). Houd shift ingedrukt, teken een lijn tussen de grenzen van de glazen microscoopschuif.
   8. De schaal instellen (Analyseren > Schaal instellen). Stel bekende afstand in op de meting die is verzameld in stap 1.2.1.
   9. Om de diepteresolutie in de lucht te berekenen, corrigeert u voor de brekingsindex van de microscoopschuif (n_glas = 1,5175)¹¹ door de meting per pixelwaarde te vermenigvuldigen met n_glas.
      OPMERKING: Het geciteerde _n-glas is voor borosilicaatglas. Microscoopglaasjes kunnen van verschillende materialen worden gemaakt. Gebruik de juiste brekingsindex voor de gemeten dia.
   10. Als u de diepteresolutie voor myocardium wilt schalen, deelt u de waarde van stap 1.2.9. door n_myocardium = 1,38 (eerder gerapporteerde waarde¹²).

2. Voorbereiding spiermonster

1. Maak het dissectieplatform klaar.
   1. Giet een deel van de dissectieoplossing (aangegeven in tabel 1)in een kleine metalen kom en plaats deze ongeveer een uur voor hartuitzetting in de vriezer.
   2. Stel een dissectie-installatie in die ervoor zorgt dat de dissectieoplossing goed zuurstofrijk is (100% zuurstof) en door elk van de buizen is gespoeld. Vul de dissectiekamer met zuurstofhoudende dissectieoplossing en bind 3/0 hechtdraad losjes rond de perfusiekatheter.
2. Accijns het hart.
   1. Verdoof 8-10 weken oude Wistar rat met behulp van gasvormige isofluraan (< 5% in zuurstof). Bevestig anesthesie door staart knijpen.
   2. Plaats de verdoofde rat in een liggende positie en injecteer subcutaan in het buikgebied met heparineoplossing (1000 IE/kg). Zorg voor nog vijf minuten anesthesie om de heparine te laten circuleren.
   3. Haal de metalen kom met dissectieoplossing uit de vriezer en plaats deze in de buurt van de euthanasiebank.
      OPMERKING: Vermijd het volledig bevriezen van de dissectieoplossing om de volledige onderdompeling van het ontlede hart mogelijk te maken.
   4. Breng de verdoofde rat over naar de euthanasiebank en euthanaseer door cervicale dislocatie.
   5. Open de rattenborst met een schaar, snijd eerst de lichaamswand langs de onderkant van de ribbenkast, vervolgens het diafragma, voordat u langs de laterale randen van de ribbenkast gaat. Til de borst uit de weg.
   6. Pak het hart met de ene hand, terwijl de andere hand een gebogen schaar gebruikt om de verbindingsvaten te snijden (aorta, vena cava, enz.).
   7. Dompel het hart snel onder in de koude dissectieoplossing.
3. Isoleer een trabecula.
   1. Identificeer de aorta terwijl het hart zich in de metalen kom bevindt en breng het hart vervolgens over naar de dissectiekamer. Trek met twee gebogen tangen de aorta over de perfusiekanule.
   2. Houd de aorta op zijn plaats met één tang. Open ondertussen de slanglijn zodat de dissectieoplossing door de perfusiekannula kan stromen.
      OPMERKING: Streef ernaar om de perfusie binnen de minuut na de hartuitzetting te voltooien.
   3. Zodra de coronaire vasculatuur is ontdaan van bloed en het hart volledig is doordrenkt met de dissectieoplossing, stopt u de perfusiestroom en zet u de aorta vast met behulp van de hechting. Zet de stroom weer aan en doordrenkt het gekanuleerde hart.
   4. Draai de canule zodat de linker kransslagader zichtbaar is op het superieure oppervlak. Speld de top van het hart op de bodem van de dissectiekamer (figuur 5A). Snijd beide atria af (figuur 5B).
   5. Knip met een veerschaar langs de rechterkant van het septum naar de top van het hart (zoals aangegeven op figuur 5B). Speld de geopende linkerventrikel vast aan de basis van de dissectiekamer. Snijd vervolgens langs de linkerkant van het septum, open de rechterventrikel en speld deze ook vast aan de basis van de dissectiekamer(figuur 5C).
      OPMERKING: Om de ventrikels in een open positie te spelden, moeten sommige papillaire spieren worden doorgesneden. Identificeer een vrijlopende trabecula in de rechterventrikel (figuur 5D-E).
   6. Snijd met behulp van de veerschaar en een tang het wandweefsel rond de trabecula en snijd vervolgens het wandweefsel orthogonaal doormidden in de richting van de trabecula. Knip het wandweefsel af tot de afmeting geschikt is voor de gebruikte montageconfiguratie. In dit geval ongeveer de helft van de grootte van een sesamzaadje (figuur 5F).
      OPMERKING: Trabeculae kan worden ontleed van de rechter- en linkerventrikel, maar die van links zijn meestal troebeler en minder toepasbaar voor sarcomere- en geometriemetingen.
   7. Laat de accijnstrabecula in de dissectiekamer, continu superfusing met de dissectie-oplossing.

3. Experimenteel protocol

OPMERKING: Het apparaat¹³ dat voor dit experiment is gebruikt, is in eigen huis gebouwd en maakt gebruik van aangepaste besturingscode. De noodzakelijke overwegingen voor het ontwerp van een apparaat dat is gebouwd om deze gegevens te repliceren, zijn twee onafhankelijk bediende montagehaken, een meetkamer met drie optisch heldere assen(figuur 3)en een externe triggerlijn die de brightfield- en OCT-camera's synchroniseert met de stimulator. Het PMT-spannings- en krachtsignaal werd verzameld met analoge DAQ-kaarten, de beelden van de OCT en de brightfield-microscoop werden verzameld met behulp van Camera Link frame-grabber-kaarten en het stimulussignaal werd verzameld met behulp van een digitale I/ O-kaart. Gegevens werden offline opgeslagen met behulp van een set consumentenlussen voor producenten om de tijdelijke uitlijning te behouden.

1. Maak de cardiomyometer klaar.
   1. Spoel heet (~60 °C) water, gedestilleerd water (kamertemperatuur) en vervolgens superfusaatoplossing door de meetkamer. Bubbel continu de superfusaatoplossing met carbogen.
   2. Schakel de verlichtingsbron van de brightfieldmicroscoop in en druk op F1 om opname mogelijk te maken (figuur 4A). Pas de downstreamhaak handmatig aan totdat deze in het brightfield-beeld is gecentreerd. Klik op Stroomafwaartse as nulen vervolgens stroomafwaarts uitgeschakeld om de motor in te schakelen ( figuur4C). Verplaats de schuifregelaar DS Setpoint [um] totdat het einde van de haak is uitgelijnd met de rand van het standaard interessegebied.
      1. Plaats de stroomafwaartse as opnieuw nul en verplaats de schuifregelaar DS-instelpunt [um] naar 1000. Herhaal het proces met de upstream-haak, maar verplaats de schuifregelaar US Setpoint [um] niet.
   3. Klik op Verplaatsen naar montage ( afbeelding4C).
   4. Start het fluorescentieverlichtingssysteem door de lampschakelaar te draaien voordat u snel de subsystemen van de controller inschakelt door de hoofdschakelaar te schakelen.
      OPMERKING: Sommige UV-lichtbronnen produceren grote hoeveelheden ozon. Als dit het geval is, sluit u een ozonafzuiger aan op de uitlaatopening van de lichtbron en zorgt u ervoor dat deze werkt voordat u de fluorescentieverlichtingsbron inschakelt.
   5. Schakel de bedrijfsmodus in Turbo-Blanking door op de modusknop op het voorpaneel te drukken, gevolgd door 2en vervolgens 1. Druk op de on-line knop om de besturingscode te laten informeren.
2. Zet de trabecula op.
   1. Pauzeer de superfusaatstroom door de meetkamer. Vul de montagekamer met de dissectieoplossing.
   2. Transporteer de trabecula met een spuit van 1 ml van de dissectiekamer naar de montagekamer (afbeelding 5G).
   3. Om de trabecula over te brengen, plaatst u de spuit verticaal en in contact met het oppervlak van de montagekameroplossing. Laat de trabecula via de zwaartekracht in de montagekamer afdalen (figuur 5H).
   4. Verlaag het vloeistofniveau in de montagekamer zodat deze in niveau is met het midden van de haken.
   5. Pas de afstand tussen de haken aan om de slappe lengte van de trabecula weer te geven door de schuifregelaar DS Setpoint [um] te verplaatsen.
   6. Gebruik een microscoop om visualisatie te helpen, pak een van de stukjes eindweefsel licht vast met een tang en monteer deze op de upstreamhaak. Monteer het andere stukje eindweefsel op de stroomafwaartse haak (figuur 5I).
   7. Eenmaal stevig gemonteerd, verplaatst u de trabecula terug in de meetkamer (figuur 5J) door op Verplaatsen naar kamer ( figuur4C) te drukken. Hervat de superfusaatstroom en vloeistofextractie.
   8. Stel stimulusfrequentie [Hz] in op 1, stimulusduur [ms] op 10 en stimulusspanning op 10. Start de stimulatie door op Stimulus On te drukken?.
3. Maak de trabecula klaar.
   1. Na ongeveer 1 uur acclimatisatie, geleidelijk verminderen van de stimulus spanning en stimulus duur in 1 V en 1 ms stappen, respectievelijk. Een typische set waarden is 3 V en 3 ms.
   2. Schakel het brightfield-verlichtingssysteem in. Druk op F1 en selecteer een interessegebied dat een geried gebied in de gebruikersinterface omsluit. Klik op SL berekenen? om de gemiddelde sarcoomlengte in het gemarkeerde gebied te berekenen. Verhoog de spierlengte tot de gemiddelde sarcoomlengte 2,32 μm is door de schuifregelaar Scheidingsinstelpunt [um] te verhogen.
      OPMERKING: SL berekenen? maakt gebruik van een 2D FFT zoals beschreven in stap 4.3. Het interessegebied dat wordt gebruikt om de gemiddelde sarcoomlengte te berekenen, is meestal een vierkant van 100 μm tot 150 μm. Daarom, als de spier nadert optimale sarcomere lengte, 43 tot 65 sarcomeres worden gebruikt om de gemiddelde sarcoom lengte te berekenen.
   3. Beweeg de spier door de schuifregelaar Centre Setpoint [um] op het tabblad "Centre and Separation Control ( Afbeelding4C) zo in te stellen dat de rand van de downstreamhaak net zichtbaar is in de brightfield-afbeelding. Verzamel de fluorescentie-informatie voor tien twitches.
   4. Verhoog de Centre Setpoint [um] waarde met 200 en verzamel nog eens tien twitches aan fluorescentie-informatie. Herhaal dit proces totdat de brightfield-afbeelding de upstream-haak bevat. Verzamel de laatste ruiten aan fluorescentie-informatie.
   5. Zet de trabecula terug op een centrale positie door de waarde Centre Setpoint [um] in te stellen op 0.
   6. Verlaag de stimulusfrequentie tot 0,2 Hz en schakel over van het KH-superfusaat naar de Fura-2-beladingsoplossing (beschreven in tabel 1).
   7. Meet het fluorescentiesignaal elke 10 minuten door op Fluorescentiebron inschakelen op het tabblad Stim en gegevens te klikken. Visualiseer het fluorescentiesignaal op het tabblad PMT-signaal.
   8. Nadat het 360 nm-signaal met een factor 10 is toegenomen of de duur van de laadprocedure meer dan 2 uur heeft overschreden, keert u de stimulusfrequentie terug naar 1 Hz en schakelt u terug naar de KH-superfusaatoplossing.
   9. Controleer de verhoudingsmeting elke 10 minuten totdat de verhoudingsmeting stabiliseert, waarna het verzamelen van gegevens kan beginnen.
4. Verzamel brightfield- en fluorescentiebeeldvormingsgegevens.
   1. Breng de spier terug naar de positie waar de rand van de stroomafwaartse haak net aanwezig is in het brightfield-beeld. Begin met het streamen van hardwaregegevens door op Stream Data to Disk te klikken op het tabblad Stim en Gegevens van de gebruikersinterface voor hardwarebeheer. Leg fluorescentiegegevens vast door op Fluorescentiebron inschakelente klikken .
   2. Stel op de gebruikersinterface van Brightfield Imaging de opnamemodus in op een externe trigger, verhoog de framesnelheid tot 100 Hz en stel het aantal beelden in op 100. Druk op Ctrl + Shift + S gevolgd door F1 om de brightfield imaging-gegevens voor dit venster op te nemen.
   3. Verhoog de waarde van centre setpoint [um] met 200 en herhaal stap 3.4.2. Ga verder met het scanprotocol totdat de beeldvormingsgegevens zijn verzameld voor het laatste venster van stap 3.3.4.
   4. Zet de trabecula terug op een centrale positie door de waarde Centre Setpoint [um] in te stellen op 0.
5. Oct-beeldvormingsgegevens verzamelen.
   1. Schakel de OCT-laserbron in door de hoofdtoets op de | symbool, drukt u op de aan /uit-knop, gevolgd door de SLDs-knop.
   2. Bedek de galvanometerkop en klik op BG kregen om het achtergrondinterferentiepatroon te meten en af te trekken van de meting (figuur 4B).
   3. Stel de beeldopnamemodus in op livebeeld.
   4. Pas de y-positieaan totdat de B-scanafbeelding alleen de upstreamhaak bevat. Deel de spierlengte die op het voorpaneel van het bedieningspaneel (figuur 4B) wordt weergegeven door twee en trek de huidige y-positieaf. Voer deze waarde in de invoer "y-offset" in. Pas de waarde "x-offset" aan totdat de doorsnede van de trabecula in het frame is gecentreerd.
   5. Scan met de trabecula gecentreerd langs de y-asdoor de y-positieaan te passen om de posities te vinden die overeenkomen met de upstream- en downstreamhaken. Noteer deze posities naar beneden. Stel bereik Y (stappen) in op het absolute verschil tussen deze waarden gedeeld door tien.
   6. Stel de beeldopnamemodus in op Stimulus Geactiveerd?, Bereik X (stappen) op 100 en klik op de knop Actieve parameters instellen.
   7. Klik op B-scangegevens streamen?en vervolgens op Verkrijgen.
      OPMERKING: Het gated imaging protocol vereist 200 twitches om de volledige spiergeometrie vast te leggen voor een monster van 2 mm lang, wat overeenkomt met een opnametijd van ~ 3 min 20 s.

4. Verwerk de brightfield beeldgegevensset

1. Bereid de beelden voor op analyse.
   1. Afbeeldingen importeren in ImageJ (Bestand > > afbeeldingsvolgorde importeren > Afbeelding selecteren).
   2. Vergroot het beeldcontrast(Afbeelding > Pas > helderheid/contrast aan > Verplaats minimum- en maximumschuifregelaars om het beeld histogram te centraliseren).
   3. Verscherp de afbeeldingen(Proces > Filters > Unsharp Mask > stel Radius (Sigma) in op 1,0 pixels en Mask Weight (0,1-0,9) op 0,6).
   4. Exporteer de afbeeldingsvolgorde(Opslaan als > afbeeldingsvolgorde > Stel de indeling inop PNG , Begin bij 0 en Cijfers (1-8) tot 4).
2. Naai de afbeeldingen, meet de gelokaliseerde verplaatsing en bereken de lokale sarcomerelengtes.
   1. Open "TrabeculaProcessing.m" (beschikbaar op aanvraag) en stel de variabele FolderPath in op de hoofdmap met alle gegevens en ImagePath op de map waarin de afbeeldingsvolgorde van stap 4.1.4 is opgeslagen. Stel secties in op het aantal imagingvensters en -frames op het aantal frames dat per venster is vastgelegd.
   2. Voer de code uit.
      OPMERKING: De uitgangen zijn aanwezig in het uitvoermappad dat door de gebruiker is opgegeven. (Standaard is het pad ingesteld op FolderPath/Output).
3. FFT sarcomere lengte techniek
   1. Gebruik beeldverwerkingssoftware om een FFT uit te voeren op een gebied van de afbeelding waar sarcomen goed zichtbaar zijn.
   2. Vermenigvuldig de pixels per kalibratieresultaten van stap 1.1.6 met 1,6 μm en 3,0 μm voordat u de inverse berekent om het bereik van ruimtelijke frequenties van belang te krijgen.
   3. Pas een exponentieel toe aan het FFT-resultaat, negeer de frequentie-informatie in het frequentiebereik berekend in stap 4.3.2 en trek deze af van het transformatieresultaat om de DC-term te verwijderen.
   4. Pas een Gaussiaanse curve aan op de frequentieband van belang.
   5. Bereken de inverse van de piek van de Gaussiaanse curve. Dit is de gemiddelde sarcoomlengte voor de regio van belang.
      OPMERKING: De FFT-berekening en de montage van de exponentiële en Gaussiaanse vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van aangepaste LabVIEW-code.

5. Verwerk de fluorescentiegegevens

1. Trek de vensterafhankelijke autofluorescentie af van het betreffende venster en bereken het quotiënt van de signalen die verband houden met de excitatiegolflengten van 340 nm en 380 nm.

6. Verwerk de OCT-beeldvormingsgegevens

1. Bereid de OCT-afbeelding voor op segmentatie.
   1. Open ImageJ en importeer de afbeeldingen (File > Import > Image Sequence). In het venster verkenner wordt dit geopend, zoekt u de afbeeldingen, selecteert u er een en klikt u op Openen.
      OPMERKING: Als de besturingscode voor de OCT de afbeeldingen niet opslaat in een indeling die leesbaar is voor ImageJ, converteert u ze naar PNG.
   2. Om visualisatie te vergemakkelijken, organiseert u de afbeeldingsvolgorde in een hyperstack(Image > Hyperstacks > Stack to Hyperstack). Stel in het dialoogvenster dat wordt geopend het aantal segmenten in op het aantal B-scans per segment en de X op het aantal segmenten over de lengte van de trabecula.
   3. Teken een rechthoek die de trabecula omsluit. Controleer of het het hele volume door de tijd heen omsluit met behulp van de schuifregelaars in het hyperstackvenster. De afbeelding bijsnijden naar het venster (Afbeelding > bijsnijden).
   4. Segmenten verwijderen die afbeeldingen van de bevestigingshaken bevatten (Stapels > Gereedschappen > Slice Keeper). Selecteer het bereik van segmenten dat alleen trabecula-informatie bevat.
2. Train WEKA segmentatie.
   1. Open WEKA-segmentatie (Plug-ins > segmentatie > trainbare Weka-segmentatie).
   2. Stel de selectiemodus in op Freehand.
   3. Klik op Instellingen en pas de classificatie en trainingsinstellingen aan. (Voor dit model werden de volgende trainingskenmerken gebruikt: Gaussiaanse waas, Sobel-filter, Hessisch, Verschil van Gaussians, membraanprojecties, Bilateraal en Lipschitz. Membraandikte werd ingesteld op 1, Membraanpleistergrootte op 8, Minimale sigma op 1 en Maximale sigma op 32. De classificatie is ingesteld op FastRandomForest en de classificatieopties zijn ingesteld op: batchSize 100, maxDepth to 32, numFeatures to 32, numThreads to 0 en numTrees to 200.)
   4. Segmenteer afbeeldingen handmatig totdat de training resulteert in bevredigende segmentaties.
   5. Sla de classificatie op.
3. Segmenteer de verwerkte B-scans
   1. Start WEKA-segmentatie volgens stap 6.2.1.
   2. Laad de classificatie vanaf stap 6.2.5.
   3. Klik op Resultaat maken.
   4. Converteer de afbeeldingen naar 8-bits(afbeelding > type > 8-bits).
   5. Converteer de afbeeldingen naar binair (Proces > Binaire > Binair maken > Standaardmethode en standaardachtergrond).
   6. Opslaan als afbeeldingsvolgorde (PNG).
4. Bereken de gemiddelde CSA in de gesegmenteerde B-scan afbeeldingen.
   1. Tel het aantal witte pixels in een binaire B-scan afbeelding.
   2. Vermenigvuldig het pixelgebied met de gekalibreerde diepteresolutie (vanaf stap 1.2) en 10 μm (de afstand tussen naburige A-scans).
   3. Herhaal dit voor alle B-scans tussen de haken en gemiddelde metingen.
5. Gesegmenteerde afbeelding omzetten in een mesh.
   1. Open "OCTmain.m" (beschikbaar op aanvraag) en stel imageDirectory in op de map met de uitvoer van stap 6.3.6. Stel outputPath indien nodig in.
   2. Stel segmenten in op de waarde "Bereik Y (stappen)" (stap 3.5.5) en frames op de waarde "Herhaal X" (stap 3.5.6), z_dim de diepteresolutie (stap 1.2.10) en x_dim & y_dim de waarde die aan 10 is toegewezen.
   3. Klik op Uitvoeren.

Results

Om de regionale Ca²⁺ en brightfield informatie over de gehele lengte van de hier gepresenteerde trabecula vast te leggen, waren zeven spierposities nodig. Figuur 6 suggereert dat de twitch-kracht ongestoord was door deze beweging, waaruit bleek dat er geen positieafhankelijkheid was van de actieve krachtproductie.

B-scans verzameld met optische coherentietomografie met een snelheid van 100 Hz werden gesegmenteerd met behulp van de ImageJ-plug-in WEKA¹⁴ (Figuur 7A). Elke doorsnede lijkt vervormd door het verschil tussen de laterale (10 μm) en diepte (1,73 μm (in myocardium)) resoluties. Deze vervorming werd gecorrigeerd door de diepteas van de afbeelding te schalen met de laterale resolutie-diepteresolutieverhouding. Figuur 7B,C toont aan dat na het schalen van de ruwe C-scan van de trabecula deze ongeveer cilindrisch is in de meetkunde. De reflectie van de wand van de meetkamer kan soms overlappen met de spiergegevens (figuur 7A, B), maar de segmentatiesoftware kan worden getraind om dit te verantwoorden ( figuur7D, E). Eenmaal gesegmenteerd, kan het dwarsdoorsnedegebied langs de lengte van de spier worden berekend gedurende de twitch (Figuur 7F). Merk op dat deze specifieke trabecula een kleine aanhangsel vertakking van het heeft. De beweging van de tak is duidelijk ~0,75 mm langs de trabecula. Ten slotte kunnen de gesegmenteerde afbeeldingen worden omgezet in mazen om de constructie van geometrische modellen te helpen (figuur 7G).

Beeldvormingsgegevens die op elk van de verschillende trabeculaposities met een snelheid van 100 fps werden vastgelegd, werden aan elkaar genaaid om een enkel volledig beeld van de trabecula te creëren (figuur 8A). De resolutie van deze beelden is 0,535 μm/pixel. Het gebruik van lineaire wegingsfuncties in de overlappende gebieden van naburige vensters helpt visualisatie en minimaliseert de impact van het vignet dat aanwezig is in de brightfield-afbeeldingen. Om het fluorescerende signaal te meten, wordt een venster van 540 μm bij 540 μm van de trabecula cyclisch verlicht met 340 nm, 365 nm en 380 nm golflengtelicht met een snelheid van 600 Hz. De verhouding van de uitgezonden fluorescentie geassocieerd met het excitatielicht van 340 nm en 380 nm correleert met het intracellulaire calcium nadat de trabecula is geladen met Fura-2. Omdat deze meting een verhouding is, is de effectieve meetsnelheid 200 Hz. De gemiddeld (n = 10) intracellulaire Ca²⁺ transiënten uit elk venster zijn uitgelijnd met het gebied waarin ze zijn afgebeeld (figuur 8B). Hoewel de piek van de transiënten redelijk consistent lijkt, is de diastolische [Ca²⁺] lager in het gebied tussen 900 μm en 1800 μm langs de trabecula. Evenzo wijzen de resultaten van de berekeningen van verplaatsingsvolging (figuur 8C) en sarcomerelengte (figuur 8D) ook op de aanwezigheid van regionale variabiliteit. De gebruikte markerloze trackingtechniek is in staat om de verplaatsing van elke pixel te verwerken, met voldoende contrast. Bij het in kaart brengen van de verdeling van sarcomerelengten in post werd een kruiscorrelatiegebied van 128 pixels bij 128 pixels (~ 67 μm bij 67 μm) gebruikt om de regionale sarcomerelengte te berekenen. Dit gebied omvat ongeveer 29 sarcomen wanneer het monster dicht bij de optimale sarcoomlengte ligt. De stapgrootte (in zowel de x- als de y-richting)tussen het zwaartepunt van elk kruiscorrelatievenster werd ingesteld op 50 pixels (~ 26 μm) voor het verwerken van deze gegevens. De geschiktheid van schattingen van de sarcoomlengte werd getest op basis van de breedte en amplitude van de Gaussiaanse pasvorm voor het FFT-signaal. Aan deze voorwaarden werd niet voldaan in het spiergebied tussen 0 μm en 500 μm, zodat daar geen informatie over de lengte van sarcomen kon worden berekend. Gezien de bijbehorende verplaatsingen is het waarschijnlijk dat de sarcomen in dit gebied langwerpig zijn tijdens de contractiele fase. In overeenstemming met deze speculatie verkorten de gemiddelde sarcomerelengtes aan de rechterkant van de trabecula in die periode. Door de informatie van elk van de panelen te combineren, blijkt dat het gebied met het grootste dwarsdoorsnedegebied niet de belangrijkste kracht produceert. In de veronderstelling dat de regionale variatie van Ca²⁺ transiënten een ongeveer vloeiende gradiënt heeft, geeft figuur 8B aan dat de grootste amplitude Ca²⁺ transiënt ergens tussen 1300 μm en 1600 μm langs de trabecula voorkomt. De verplaatsingskaart geeft aan dat het gebied dat de minste beweging ondergaat, goed aansluit op de piek Ca²⁺ transiënt. Deze regio heeft echter de kleinste dwarsdoorsnedegebieden van de steekproef. Met deze gegevens in gedachten zou men kunnen concluderen dat deze regio de meeste stress veroorzaakte.

Figuur 1: Geannoteerde afbeelding van de cardiomyometer. Elk van de belangrijkste optische componenten wordt beschreven. De inzet bevat een close-up, achteraanzicht, van de microscoop objectief in situ,onder de meetkamer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Optische route voor gelijktijdige brightfield en fluorescentie microscopie. De verlichtingsbron voor de fluorescentiemicroscoop is een Xenonbooglamp, waarvan de output cyclisch schakelt tussen 340 nm, 365 nm en 380 nm licht. Het uitgangspad van de booglamp bevat een dichroïsche spiegel met een afgesneden golflengte van 409 nm die het UV-licht reflecteert op een spiegel die het licht in een fluorescentiemicroscoopdoelstelling richt. De lens richt het excitatielicht op het monster en verzamelt het uitgestraalde licht, dat een langere golflengte van 510 nm heeft. Dit uitgezonden licht gaat door de eerste dichroïsche spiegel, maar niet door de tweede, omdat het een afgesneden golflengte van 552 nm heeft. Een veldlens richt het gereflecteerde licht vervolgens op de sensor van de PMT. Ondertussen bevindt de verlichtingsbron (660 nm LED) voor de brightfieldmicroscoop zich boven het monster. Het overgebrachte licht wordt door een condensatorlens op het monster gericht en de 20× fluorescentiedoelstelling vangt het resulterende transmissiebeeld op. De golflengte die wordt gebruikt voor brightfield-verlichting overschrijdt de afgesneden golflengte van elke dichroïsche spiegel, dus het gaat door beide voordat het beeld wordt gericht op de sensor van een CMOS-camera. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Ontwerp van de meetkamerhouder. (A) Isometrisch zicht op de meetkamerhouder met optische paden eroverheen. Brightfield-verlichting vindt plaats vanaf het superieure oppervlak(z-as); fluorescentieverlichting vindt plaats vanaf het inferieure oppervlak(z-as) en het OCT-signaal van de meetarm is orthogonale naar de andere verlichtingsas(y-as). Tijdens het experiment houden twee platina haken een trabecula vast in een glazen capillaire buis die fungeert als de meetkamer. Stemspoelmotoren regelen elke haak en hun posities worden gemeten met behulp van laserinterferometrie. De huidige positie wordt vergeleken met een door de gebruiker gedefinieerd instelpunt en met behulp van een PID-controller die is gecodeerd in een FPGA, wordt de fout geminimaliseerd. (B) Meetkamer ter plaatse met de brightfield verlichting ingeschakeld. De achteraanzicht wordt weergegeven in de set van figuur 1 . (C) Schematisch van de superfusaatstroom door de meetkamerhouder. Superfusaat komt in de achterkant van het blok en stroomt in de richting aangegeven door pijlen. De upstream- en downstreamelektroden bepalen de veldstimulatie voor het opwekken van de samentrekking van een gemonteerde trabecula in de meetkamer. Blauwe arcering geeft de gebieden aan waar het superfusaat stroomt tijdens een experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Voorpaneel van de beeldverwervings- en besturingssoftware. (A) Brightfield imaging gebruikersinterface. (B) OCT imaging gebruikersinterface. (C) Hardware controle gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Trabecula dissectie- en montageprotocol. (A) Langendorff-doordrenkt rattenhart in de dissectiekamer. (B ) Hetzelfde hart met de atria verwijderd. Stippellijnen geven de excisiebaan aan om de ventrikels te openen. (C) Een geopend hart om het interieur van beide ventrikels bloot te leggen. Het onderbroken vak geeft het gebied aan waar trabeculae meestal worden gevonden. (D) Het rechts-ventriculaire wandgebied (hetzelfde als aangegeven door het onderbroken vak in C). Stippellijnen markeren drie trabeculae. (E) Een trabecula geselecteerd uit de drie in D. (F) De trabecula van paneel E met het wandweefsel verwijderd. (G) De geïsoleerde trabecula aan het einde van een spuit van 1 ml. (H) De trabecula in de montagekamer. (I) De trabecula gemonteerd tussen twee platina haken. (J) De trabecula, gemonteerd tussen haken, in de meetkamer (figuur 3B). De groene vlek is een artefact uit het eerste dichroïsche filter. (K) Secundaire hoek van de gemonteerde trabecula in de meetkamer. De afstand tussen de trabecula en de microscoop objectief is ongeveer 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Positieafhankelijkheid van de krachtmeting. De kracht die door de spier wordt geproduceerd vanuit elk van de beeldvormingsposities (n = 7) bedekt. De gemiddelde productie van actieve kracht bedroeg 0,527 mN ± 0,003 mN, tijd tot 50 % krimp 77,1 ms ± 0,3 ms en tijd tot 50 % ontspanning 328,1 ms ± 0,9 ms (alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SE). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7: OCT beeldvormingsanalyse. (A) Voorbeeld van WEKA-segmentatie. De gesegmenteerde doorsnede van de spier wordt rood gemarkeerd en de achtergrond wordt groen gemarkeerd. (B) Superieure weergave van de ruwe C-scan gegevens van een trabecula. De heldere schuine lijn naar de bovenkant van het beeld is de reflectie van de wand van de meetkamer. (C) Zijdelingse weergave van de ruwe C-scangegevens van een trabecula. (D) Superieure weergave van de gesegmenteerde LGO-gegevens. (E) Zijdelingse weergave van de gesegmenteerde LGO-gegevens. (F) Het dwarsdoorsnedegebied over de lengte van de trabecula (x-as)door de tijd (y-as). Het gemiddelde dwarsdoorsnedegebied langs de spierlengte was 0,0326 mm² ± 0,0005 mm² (gemiddelde ± S.E.) (G) Een gaas van de trabecula. De mesh is ongeveer uitgelijnd met het dwarsdoorsnedegebiedplot van paneel F. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8: Brightfield en fluorescentie beeldvormingsanalyse. (A) Gestikt beeld (zeven beeldvensters) van de trabecula. (B) Ca²⁺ transiënten over de lengte van de trabecula. (C) Gemiddelde x-verplaatsing van elk beeldvenster. Een positieve verplaatsing vertegenwoordigt een beweging naar rechts en negatief naar links. (D) Gemiddelde sarcomerelengtes van elk beeldvenster met het nodige beeldcontrast. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1: Tabel met oplossingen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

In deze studie presenteren we een configuratie waarmee de assemblage van drie optische systemen die brightfield-, fluorescentie- en OCT-beeldvorming combineren, gegevens kan verzamelen van een actief samentrekkende ex vivo cardiale trabecula (figuur 1 en figuur 2). Een dergelijke georkestreerde integratie is mogelijk door het ontwerp van de meetkamer (figuur 3) om de orthogonale opstelling van de LGO naar de brightfield-fluorescentieas mogelijk te maken. Het spieropbouwende systeem speelt een even belangrijke rol in het succes van gelijktijdige kwantificeringen van belangrijke indices bij het karakteriseren van de dynamiek van hartspier excitatie-contractie. De nieuwigheid ervan is het mogelijk maken van spierscanprocedures zonder duidelijke verstoring van de mechanische prestaties van de spier (figuur 6). Met de gecombineerde beeldvormingsconfiguratie en het gemotoriseerde haaksysteem voor krachtmeting kan dit systeem de regionale heterogeniteit in de ca²⁺ transiënte, verplaatsings- en sarcomerelengte evalueren, samen met macroscopische geometrische informatie van een samentrekkende trabecula gedurende de tijd van de twitch (figuren 7 en figuur 8).

Gezien de alomtegenwoordigheid van brightfield-epifluorescentiebeeldvormingssystemen binnen hartonderzoekslaboratoria, kan de reproductie van deze resultaten worden bereikt met enkele kleine hardwareoverwegingen. Hier presenteren we de beeldverwerkingstoolkit voor het combineren van brightfield-epifluorescentie en OCT, wat essentieel is bij het analyseren van de onderliggende contractiele heterogeniteit. De integratie van de OCT vereist een onbelemmerd optisch pad, terwijl de gated imaging een externe triggerlijn vereist tussen de stimulus en zowel de OCT- als brightfield imaging camera, en spiermontagehaken die het monster door de meetkamer kunnen verplaatsen. De vereiste nabewerkingssoftware en -methoden zijn vrij beschikbaar. Met name de gebruikte segmentatiesoftware, WEKA^14,is open-source. De techniek van markerless tracking van materiaalpunten^8,sarcomerelengte, gated volumetrische beeldvorming¹⁰en meshgeneratiecodes zijn eveneens toegankelijk en kunnen op verzoek van de overeenkomstige auteur beschikbaar worden gesteld.

Spier levensvatbaarheid, optimale belasting van Fura-2, en beeld focus zijn de drie pijlers die de basis vormen van een succesvol experiment. Het gebruik van een dissectieoplossing met BDM om contractuur, transport van de spier in een spuit, continue oxygenatie van de oplossing en het voorbereiden van nieuwe experimentele oplossingen op de dag van een experiment te voorkomen, dragen allemaal bij aan een hoge levensvatbaarheid van de spieren. Alvorens de trabecula met Fura-2AM te laden, moet autofluorescentie worden verzameld voor elke voorwaarde die men wil bestuderen, omdat het een significant effect kan hebben op de gemeten Ca²⁺ transiënte¹⁵. Oxygenatie van Fura-2AM laadoplossing wordt gecompliceerd door de noodzakelijke opname van de oppervlakteactieve stof pluronic-F127 om het laden van kleurstoffen te helpen. Om de resulterende overmatige bubbelvorming veroorzaakt door deze oppervlakteactieve stof te bestrijden, stelt een kleine druppel antischuim in de laadoplossing de gebruiker in staat om de oxygenatiesnelheid te verhogen, waardoor de kans wordt vergroot dat de trabecula functionele levensvatbaarheid behoudt tijdens het laadproces. Ten slotte moet de beeldvormingsfocus gelijkmatig zijn langs de spierlengte om de signaal-ruisverhouding van de brightfield- en fluorescentie-informatie te maximaliseren.

Er zijn twee beperkingen om te overwegen met de hier gepresenteerde methoden. Ten eerste is de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop. Hoewel de ruimtelijke resoluties van de OCT en brightfield imaging hoog zijn, is de resolutie van de fluorescentiemicroscoop beperkt tot de integraal van de fluorescentie van het volume dat wordt vastgelegd in een beeldvenster van 540 μm bij 540 μm. Er is ruimte om de ruimtelijke resolutie van de fluorescentiemicroscoop te verhogen door een high-gain charge-coupled apparaatcamera te gebruiken, in plaats van een PMT, om het fluorescentiesignaal vast te leggen ten koste van de signaal-ruisverhouding¹⁶. Ten tweede is de diameter van de trabecula die kan worden bestudeerd in termen van meetbare sarcomerelengte en geometrische diepte. De windowed-FFT-benadering voor het berekenen van de sarcoomlengte maakt gebruik van het voordeel van een verbeterde ruimtelijke resolutie, maar wordt geassocieerd met verminderde robuustheid (figuur 8D). In gevallen waarin troebele of trabeculae met een grote diameter moet worden bestudeerd, zal de oplosbaarheid van de FFT sterk worden verminderd als gevolg van het verminderde contrast dat gepaard gaat met de sarctische banderol in grotere weefselmonsters. Evenzo zullen binnen de LGO de tegenreflecties van een beelddiepte van meer dan 300 μm te zwak zijn om tijdens de segmentatiefase te worden opgelost. Daarom is onze techniek beperkt tot trabeculae met een diameter van minder dan 300 μm. Het wordt echter niet aanbevolen om monsters met een grote diameter te bestuderen, omdat er problemen kunnen zijn met diffusieve oxygenatie van de spierkern tijdens hoge stimulatiesnelheden¹⁷.

Onze methode maakt de beoordeling van de ionische mechanische functie in combinatie met spiergeometrie in gezonde en zieke spieren mogelijk, wat een krachtige benadering biedt voor het begrijpen van hartspierfysiologie, pathofysiologie en farmacologie. De hier beschreven pijplijn voor beeldverwerking extraheert gegevens die cruciaal zijn voor het verkrijgen van een dieper begrip van contractiele heterogeniteit. Een manier om het potentieel van zo'n rijke dataset volledig te realiseren, is door wiskundige modellen te bouwen die deze gegevens integreren en interpreteren, en om voorspellingen te doen die experimenteel kunnen worden getest met behulp van ons apparaat.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime	Acros Organics	150375000
20× microscope lens	Nikon	CFI Super Fluor 20×	NA 0.75
2D Galvanometer	Thorlabs	GVSM002/M
50-50 beam splitter	Thorlabs	FC850-40-50-APC
90-10 beam-splitter	Thorlabs	TW850R2A2
Analogue input module	National Instruments	NI-9205	Records the PMT signal at 200 kHz
Brightfield imaging light source	CoolLED	PE-2	660 nm LAM
Broadband light source	Superlum	Broadlighter-840
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cameralink card	National Instruments	NI-1429	Brightfield imaging frame grabber
Carbogen 5	BOC	Gas code: 181
Condensor lens	Nikon	LWD 0.52
D(+)-Glucose	Merck	108337
DAQ	National Instruments	NI-6259	Triggers the galvanometer movement
Dichroic mirror 1	Semrock	FF409-Di03
Dichroic mirror 2	Semrock	FF552-Di02
Diffraction grating	Wasatch Photonics	1200 lines/mm @840 nm
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
Direct-Q 3 UV System	Merck Millipore	ZRQSVR3WW	Distilled water machine
Dry bath	Corning	6875-SB	LSE digital dry bath
FIJI	ImageJ		Open-source image processing software
Fura-2AM pentapotassium salt	Thermofisher	F14186
Hardware FPGA card	National Instruments	NI-7813R	Also controls the triggering of the brightfield capture
Heparin	Pfizer	61024
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Inverted microscope	Nikon	TI-DH illumination pillar
Isofluorane	MedSource	VAPDRUGISO250
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Line-scan camera	Basler	spL2048-70km	Spectrometer camera
Magnetic stirrer	IKA	3810000	RCT basic
Matlab	Mathworks		Data processing code
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
NaH2PO4.2H2O	Sigma-Aldrich	71505
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
OCT FPGA card	National Instruments	NI-1483R
Oxygen tank	BOC	Gas code: 100D
pH meter	Mettler Toledo	MP220
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H7422-20
Powerload	Thermofisher	P10020
Superluminescent diode	Broadlighter	D-840
Transimpedance amplifier	Custom
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	252859
Wistar rat	Vernon Jansen Unit		8 – 10 weeks
Xenon arc lamp	Sutter Instrument	DG-4	Lambda DG-4