Method Article

Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele microbiële teeltmethoden hebben meestal omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. Bovendien hebben microplaatgebaseerde teeltmethoden met hoge doorvoer die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een slechte microbiële groeistatus en experimentparallellisatie vanwege hun lage opgeloste zuurstof, slechte mengsel en ernstige verdamping en thermisch effect. Vanwege de vele voordelen van microdruppels, zoals een klein volume, een hoge doorvoer en een sterke controleerbaarheid, kan de op druppels gebaseerde microfluïdische technologie deze problemen overwinnen, die is gebruikt in vele soorten onderzoek naar microbiële teelt, screening en evolutie met hoge doorvoer. De meeste eerdere studies bevinden zich echter nog in het stadium van laboratoriumconstructie en -toepassing. Enkele belangrijke kwesties, zoals hoge operationele vereisten, hoge constructiemoeilijkheden en gebrek aan geautomatiseerde integratietechnologie, beperken de brede toepassing van druppelmicrofluïdische technologie in microbieel onderzoek. Hier werd met succes een geautomatiseerd microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie, waarmee de integratie van functies zoals inenting, teelt, online monitoring, subteelt, sortering en bemonstering werd bereikt die vereist zijn voor het proces van microbiële druppelteelt. In dit protocol werden wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 en een methanol-essentiële E. coli-stam (MeSV2.2) als voorbeelden genomen om te introduceren hoe de MMC kan worden gebruikt om geautomatiseerde en relatief hoge doorvoer microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren. Deze methode is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat grote voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor wetenschappelijke onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiële teelt is een belangrijke basis voor microbiologisch wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen, die veel wordt gebruikt bij de isolatie, identificatie, reconstructie, screening en evolutie van micro-organismen 1,2,3. Conventionele microbiële teeltmethoden gebruiken voornamelijk reageerbuizen, schudkolven en vaste platen als teeltcontainers, gecombineerd met schudincubators, spectrofotometers, microplaatlezers en andere apparatuur voor microbiële teelt, detectie en screening. Deze methoden hebben echter veel problemen, zoals omslachtige bewerkingen, lage....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installatie van instrumenten en software

  1. Kies een schone en steriele omgeving (zoals een schone bank) als speciale permanente ruimte voor MMC. Installeer de MMC gestaag in de ruimte.
    OPMERKING: Houd de MMC uit de buurt van de interferentie van sterke elektrische velden, magnetische velden en sterke warmtestralingsbronnen. Voorkom dat ernstige trillingen de optische detectiecomponenten aantasten. Zorg voor de voeding van AC220 V, 50 HZ naar de MMC. Voor meer informatie over MMC verwijzen wij u naar de Tabel met Materialen en de website voor MMC16.
  2. Installeer de bewerkingssoftware vanuit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol gebruikt E. coli MG1655 en een MeSV2.2-stam als voorbeelden om de microbiële teelt en methanol-essentiële adaptieve evolutie aan te tonen met een geautomatiseerde en relatief hoge doorvoerstrategie in MMC. De groeicurvemeting werd vooral gebruikt om microbiële teelt te karakteriseren. De adaptieve evolutie werd uitgevoerd door geautomatiseerde continue subteelt en het toevoegen van een hoge concentratie methanol als de selectieve druk tijdens elke subteelt. Of adaptieve evolutie was gerealiseerd, we.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert hoe het microbiële microdruppelcultuursysteem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie op lange termijn uit te voeren. MMC is een geminiaturiseerd, geautomatiseerd en high-throughput microbieel teeltsysteem. In vergelijking met conventionele microbiële teeltmethoden en -instrumenten met hoge doorvoer heeft MMC veel voordelen, zoals een laag arbeids- en reagensverbruik, eenvoudige bediening, online detectie (OD en fluorescentie), gegevensverzameling met .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2018YFA0901500), het National Key Scientific Instrument and Equipment Project van de National Natural Science Foundation of China (21627812) en het Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). We danken ook Prof. Julia A. Vorholt (Instituut voor Microbiologie, Afdeling Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Zwitserland) voor de levering van de methanol-essentiële E. coli stam versie 2.2 (MeSV2.2).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PVDF filter membraneMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBSterilize the MMC oil
4 °C refrigeratorHaierBCD-289BSWFor reagent storage
AgarBecton, Dickinson and Company214010For solid plate preparation
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean benchBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIFor aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Component of the special medium for MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Software installation and MMC control
Constant temperature incubatorShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balanceOHAUSAR 3130For reagent weighing
EP tubeThermo Fisher1.5 mLFor droplet collection
FeCl3·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing TubeThermo Fisher2.0 mLFor strain preservation
GluconateSigma-AldrichS2054Component of the special medium for MeSV2.2.
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AFor strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization PotSANYO ElectricMLS3020For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotopped420322Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Component of the special medium for MeSV2.2.
MethanolMACKLINM813895Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-IPerforming growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODFor various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODThe oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Component of the special medium for MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponent of the LB medium
Na2HPO4·12H2OGENERAL-REAGENTG10267BComponent of the special medium for MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dishCorning Incorporated90 mmFor the preparation of solid medium
Pipetteeppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLFor liquid handling
Quick connector ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottleLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBSampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flaskUnion-Biotech50 mLFor microbial cultivation
Shaking incubatorShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BFor the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfateSolarbioS8290Component of the special medium for MeSV2.2.
SyringeJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLDraw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needleOUBEL Hardware Store22GInner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigeratorSANYO Ultra-lowMDF-U4086SFor strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometerGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proFor the measurement of OD values
Vitamin B1SolarbioSV8080Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extractOxoid Ltd.LP0021Component of the LB medium
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Component of the special medium for MeSV2.2.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles