Method Article

Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele microbiële teeltmethoden hebben meestal omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. Bovendien hebben microplaatgebaseerde teeltmethoden met hoge doorvoer die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een slechte microbiële groeistatus en experimentparallellisatie vanwege hun lage opgeloste zuurstof, slechte mengsel en ernstige verdamping en thermisch effect. Vanwege de vele voordelen van microdruppels, zoals een klein volume, een hoge doorvoer en een sterke controleerbaarheid, kan de op druppels gebaseerde microfluïdische technologie deze problemen overwinnen, die is gebruikt in vele soorten onderzoek naar microbiële teelt, screening en evolutie met hoge doorvoer. De meeste eerdere studies bevinden zich echter nog in het stadium van laboratoriumconstructie en -toepassing. Enkele belangrijke kwesties, zoals hoge operationele vereisten, hoge constructiemoeilijkheden en gebrek aan geautomatiseerde integratietechnologie, beperken de brede toepassing van druppelmicrofluïdische technologie in microbieel onderzoek. Hier werd met succes een geautomatiseerd microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie, waarmee de integratie van functies zoals inenting, teelt, online monitoring, subteelt, sortering en bemonstering werd bereikt die vereist zijn voor het proces van microbiële druppelteelt. In dit protocol werden wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 en een methanol-essentiële E. coli-stam (MeSV2.2) als voorbeelden genomen om te introduceren hoe de MMC kan worden gebruikt om geautomatiseerde en relatief hoge doorvoer microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren. Deze methode is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat grote voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor wetenschappelijke onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiële teelt is een belangrijke basis voor microbiologisch wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen, die veel wordt gebruikt bij de isolatie, identificatie, reconstructie, screening en evolutie van micro-organismen 1,2,3. Conventionele microbiële teeltmethoden gebruiken voornamelijk reageerbuizen, schudkolven en vaste platen als teeltcontainers, gecombineerd met schudincubators, spectrofotometers, microplaatlezers en andere apparatuur voor microbiële teelt, detectie en screening. Deze methoden hebben echter veel problemen, zoals omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. De teeltmethoden met hoge doorvoer die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, zijn voornamelijk gebaseerd op de microplaat. Maar de microplaat heeft een laag niveau van opgeloste zuurstof, slechte mengeigenschappen en ernstige verdamping en thermisch effect, wat vaak leidt tot een slechte groeistatus en experimentlillaatologie van micro-organismen 4,5,6,7; aan de andere kant moet het worden uitgerust met dure apparatuur, zoals vloeistofbehandelingswerkstations en microplaatlezers, om geautomatiseerde teelt- en procesdetectiete bereiken 8,9.

Als een belangrijke tak van microfluïdische technologie is de afgelopen jaren druppelmicrofluïdica ontwikkeld op basis van traditionele continustromende microfluïdische systemen. Het is een discrete flow microfluïdische technologie die twee onmengbare vloeibare fasen (meestal olie-water) gebruikt om gedispergeerde microdruppels te genereren en erop te werken10. Omdat microdruppels de kenmerken hebben van een klein volume, een groot specifiek oppervlak, een hoge interne massaoverdrachtsnelheid en geen kruisbesmetting veroorzaakt door compartimentering, en de voordelen van sterke controleerbaarheid en hoge doorvoer van druppels, zijn er vele soorten onderzoek geweest waarbij druppelmicrofluïdische technologie wordt toegepast in de teelt, screening en evolutie van micro-organismen met hoge doorvoer11 . Er zijn echter nog steeds een aantal belangrijke problemen om druppelmicrofluïdische technologie populair te maken en op grote schaal toe te passen. Ten eerste is de werking van druppelmicrofluïdica omslachtig en ingewikkeld, wat resulteert in hoge technische vereisten voor operators. Ten tweede combineert druppelmicrofluïdische technologie optische, mechanische en elektrische componenten en moet deze worden geassocieerd met biotechnologische toepassingsscenario's. Het is moeilijk voor een enkel laboratorium of team om efficiënte druppelmicrofluïdische controlesystemen te bouwen als er geen multidisciplinaire samenwerking is. Ten derde kost het vanwege het kleine volume microdruppels (van picoliter (pL) tot microliter (μL)) veel moeite om de nauwkeurige geautomatiseerde controle en real-time online detectie van druppels te realiseren voor enkele elementaire microbiële bewerkingen zoals subteelt, sortering en bemonstering, en het is ook moeilijk om een geïntegreerd apparatuursysteem te bouwen12.

Om de bovenstaande problemen aan te pakken, werd met succes een automatisch microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie13. Het MMC bestaat uit vier functionele modules: een druppelherkenningsmodule, een druppelspectrumdetectiemodule, een microfluïdische chipmodule en een bemonsteringsmodule. Door de systeemintegratie en -controle van alle modules wordt het geautomatiseerde besturingssysteem inclusief de generatie, teelt, meting (optische dichtheid (OD) en fluorescentie), splitsen, fusie, sortering van druppels nauwkeurig vastgesteld, waardoor de integratie van functies zoals inenting, teelt, monitoring, subteelt, sortering en bemonstering die nodig is voor het proces van microbiële druppelteelt wordt bereikt. MMC kan tot 200 replicerende druppelteelteenheden van 2-3 μL volume bevatten, wat overeenkomt met 200 schudkolf teelteenheden. Het microdruppelteeltsysteem kan voldoen aan de vereisten van niet-contaminatie, opgeloste zuurstof, mengen en massa-energie-uitwisseling tijdens de groei van micro-organismen, en voldoen aan de verschillende behoeften van microbieel onderzoek door middel van meerdere geïntegreerde functies, bijvoorbeeld groeicurvemeting, adaptieve evolutie, single factor multi-level analyse en metabolietonderzoek en -analyse (gebaseerd op fluorescentiedetectie)13,14.

Hier introduceert het protocol hoe de MMC te gebruiken om geautomatiseerde en microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren (figuur 1). We namen wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 als voorbeeld om de groeicurvemeting en een methanol-essentiële E. coli-stam MeSV2.215 aan te tonen om de adaptieve evolutie in MMC aan te tonen. Er is een bedieningssoftware voor MMC ontwikkeld, die de bediening zeer eenvoudig en duidelijk maakt. In het hele proces moet de gebruiker de initiële bacterieoplossing bereiden, de voorwaarden van de MMC instellen en vervolgens de bacterieoplossing en gerelateerde reagentia in de MMC injecteren. Vervolgens zal de MMC automatisch bewerkingen uitvoeren zoals druppelgeneratie, herkenning en nummering, teelt en adaptieve evolutie. Het zal ook online detectie (OD en fluorescentie) van de druppels met een hoge tijdresolutie uitvoeren en de gerelateerde gegevens (die kunnen worden geëxporteerd) in de software weergeven. De operator kan het teeltproces op elk moment stoppen op basis van de resultaten en de doeldruppels extraheren voor volgende experimenten. De MMC is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een relatief hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat aanzienlijke voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en robuust experimenteel platform voor onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installatie van instrumenten en software

  1. Kies een schone en steriele omgeving (zoals een schone bank) als speciale permanente ruimte voor MMC. Installeer de MMC gestaag in de ruimte.
    OPMERKING: Houd de MMC uit de buurt van de interferentie van sterke elektrische velden, magnetische velden en sterke warmtestralingsbronnen. Voorkom dat ernstige trillingen de optische detectiecomponenten aantasten. Zorg voor de voeding van AC220 V, 50 HZ naar de MMC. Voor meer informatie over MMC verwijzen wij u naar de Tabel met Materialen en de website voor MMC16.
  2. Installeer de bewerkingssoftware vanuit het bestand MMC.zip
    OPMERKING: Neem contact op met de auteurs voor het MMC.zip bestand.
    1. Maak een speciale map en sla het zip-bestand daarin op.
    2. Maak een andere speciale map aan als de "Installation Directory". Pak de MMC uit.zip en sla de bestanden op in de nieuwe map.
      OPMERKING: De computerconfiguratie is het beste om te voldoen aan: (1) Windows 7 64-bits besturingssysteem of hoger; (2) CPU: i5 of hoger; (3) geheugen: 4 GB of meer; (4) harde schijf: 300 GB of meer (rotatiesnelheid groter dan 7200 rpm of solid-state disk).

2. Voorbereidingen

  1. Sluit de naald van de spuit (binnendiameter is 0,41 mm en de buitendiameter is 0,71 mm), snelkoppeling A en reagensfles (figuur 2C) aan en autoclaaf ze gedurende 15 minuten bij 121 °C.
    OPMERKING: Schroef de dop van de reagensfles iets los tijdens het steriliseren. Elke keer kunnen er nog een paar reagensflessen worden klaargemaakt voor gebruik.
  2. Gebruik een 0,22 μm polyvinylideenfluoride (PVDF) filter om MMC-olie te filteren. Plaats de microfluïdische chip (figuur 2B) en MMC-olie van tevoren in de schone bank en steriliseer ze door ultraviolette bestraling gedurende 30 minuten voor gebruik.
    OPMERKING: Voor de details van Quick connector A, reagensfles, MMC-olie en microfluïdische chip raadpleegt u de tabel met materialen.
  3. Installeer de microfluïdische chip
    1. Open de deur van de operatiekamer (figuur 2A) en til de optische vezelsonde op.
    2. Lijn de elektrische veldgaten uit met de elektrische veldnaalden en plaats de chip voorzichtig op het spaanonderstel. Steek vervolgens de twee positioneringskolommen in de positioneringsgaten en plaats de optische vezelsonde (figuur 2D).
    3. Sluit de snelkoppeling A op de chip aan op de overeenkomstige poort van de MMC volgens het positienummer (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.
  4. Vul de MMC-olie (tot ongeveer 80 ml) in de oliefles en leeg de afvalvloeistof in de afvalfles voor gebruik.
    OPMERKING: De afvalvloeistof is meestal organisch afval. Raadpleeg de regionale wet- en regelgeving bij verwijdering, onder voorbehoud van wijzigingen op basis van experimentele opstelling.

3. Groeicurve meting in MMC

  1. Bereiding voor initiële bacteriële oplossing
    1. Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om Luria-Bertani (LB) medium en autoclaaf te bereiden bij 121°C gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Componenten van LB-medium: NaCl (10 g/L), gistextract (5 g/L) en trypton (10 g/L).
    2. Haal de E. coli MG1655-stam uit de glycerolbouillon en kweek deze in een schudkolf van 50 ml met 10 ml LB-medium in een schudincubator (200 tpm) bij 37 °C gedurende 5-8 uur.
      LET OP: De teelttijd is afhankelijk van de specifieke soorten. Het is optimaal om de soort te kweken tot de logaritmische periode/fase.
    3. Verdun de gekweekte E. coli MG1655-oplossing met vers medium tot een OD600 van 0,05-0,1 om een eerste bacterieoplossing te verkrijgen (bereid ongeveer 10 ml).
  2. Klik op Initialisatie om de MMC te initialiseren. Nadat de initialisatie-interface verschijnt, stelt u de teelttemperatuur in op 37 °C en de foto-elektrische signaalwaarde op 0,6 (figuur 3A). De initialisatie duurt ongeveer 20 minuten.
  3. Schakel de UV-lamp (golflengte 254 nm) in tijdens de initialisatie.
  4. Injecteer de initiële bacterieoplossing en MMC-olie in de reagensfles.
    1. Haal een gesteriliseerde reagensfles op de schone bank en draai de dop vast.
    2. Gebruik een steriele spuit van 10 ml om 3-5 ml MMC-olie uit de naald van de spuit van de zijbuis te injecteren. Kantel en draai de reagensfles langzaam om de olie volledig in de binnenwand te laten infiltreren.
    3. Injecteer ongeveer 5 ml initiële bacterie-oplossing en vul vervolgens de reagensfles door opnieuw 5-7 ml van de olie te injecteren.
    4. Trek de onafhankelijke snelkoppeling A eruit en steek de snelkoppeling A van de reagensfles in de snelkoppeling B om de monsterinjectie te voltooien (figuur 4A).
  5. Wacht tot de initialisatie is voltooid en schakel vervolgens de UV-lamp uit (golflengte 254 nm).
  6. Open de deur van de operatiekamer en plaats de reagensfles in het metalen bad.
  7. Trek de C2-connector van de chip en de snelkoppeling A van de reagensfles eruit. Sluit de zijbuisconnector van de reagensfles aan op de C2-connector en de bovenbuisconnector op de O2-connector. Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.
  8. Klik op Groeicurve om de functie van het meten van de groeicurve te kiezen (figuur 3A). Voer in de interface voor parameterinstellingen het getal in als 15, schakel de OD-detectieschakelaar in en stel de golflengte in op 600 nm. Klik op Start om het genereren van druppels te starten. Het duurt ongeveer 10 minuten.
    OPMERKING: Hier verwijst Nummer naar het aantal druppels dat moet worden gegenereerd. Golflengte verwijst naar de golflengte van de te detecteren OD. Stel het getal (maximaal 200) en de golflengte (350-800 nm) in volgens de experimentvereisten.
  9. Wanneer er een pop-upvenster verschijnt op de hoofdinterface met de vraag "Verwijder de reagensfles tussen C2 en O2, klik vervolgens op de knop OK na voltooiing", opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles eruit te halen en de C2- en O2-connectoren aan te sluiten.
  10. Sluit de deur en klik op de knop OK in het pop-upvenster om de druppels automatisch te cultiveren en de OD-waarden te detecteren.
    OPMERKING: De MMC detecteert de OD-waarde wanneer de druppel de optische vezelsonde passeert. Daarom is de detectieperiode afhankelijk van het aantal gegenereerde druppels.
  11. Wanneer de groeicurve de stationaire fase bereikt, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Selecteer het gegevensopslagpad en exporteer de OD-waarde die tijdens de teeltperiode is geregistreerd in het .csv-formaat, dat kan worden geopend door de juiste software (bijvoorbeeld Microsoft Excel). Gebruik vervolgens een kaartsoftware (bijvoorbeeld EXCEL en Origin 9.0) om de groeicurve te plotten.
    OPMERKING: Tijdens het teeltproces is het mogelijk om op elk gewenst moment op de gegevensexport te klikken om de OD-gegevens van alle huidige druppels te exporteren.

4. Adaptieve evolutie in MMC

  1. Bereiding voor initiële bacteriële oplossing
    1. Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om het speciale vloeibare medium en de vaste platen voor de MeSV2.2 en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C te bereiden.
      OPMERKING: Voor de componenten van het speciale medium verwijzen wij u naar tabel 1 en de tabel met materialen.
    2. Kweek de MeSV2.2 met behulp van de massieve plaat (diameter = 90 mm) in een incubator met constante temperatuur van 37 °C gedurende 72 uur. Kies vervolgens een onafhankelijke kolonie en kweek deze in een schudkolf van 50 ml met 10 ml van het speciale vloeibare medium in een schudincubator (200 rpm) bij 37 °C gedurende 72 uur.
    3. Verdun de gekweekte MeSV2.2-oplossing met het medium tot een OD600 van 0,1-0,2 (zorg ervoor dat het totale volume niet minder dan 10 ml is) en blijf het gedurende 5 uur in de schudfles kweken om de initiële bacterieoplossing te verkrijgen.
      OPMERKING: De MeSV2.2 is een methanol-essentiële E. coli stam. Het speciale vloeibare medium bevat 500 mmol/L methanol, wat een sterke belasting is voor MeSV2.2, wat resulteert in een zeer langzame groei. Merk op dat het verkrijgen van de initiële bacterieoplossing hier verschilt van die beschreven in stap 3.1.
  2. Initialiseer de MMC zoals uitgelegd in stap 3.2, 3.3 en 3.5.
  3. Haal twee gesteriliseerde reagensflessen eruit, waarvan er één voor de initiële bacterieoplossing is en de andere voor het verse medium. Injecteer de initiële bacterieoplossing (5 ml), vers medium (12-15 ml) en MMC-olie in de reagensflessen zoals uitgelegd in stap 3.4.
    OPMERKING: Aangezien adaptieve evolutie een langdurig proces is waarbij meerdere subteelten betrokken zijn, moet u zoveel mogelijk vers medium opslaan in MMC. Het medium kan niet worden aangevuld tijdens het uitvoeren van het experiment.
  4. Installeer de twee reagensflessen in MMC zoals uitgelegd in stap 3.6. Installeer de ene voor de initiële bacterieoplossing tussen de C2- en O2-connector en de andere voor het verse medium tussen de C4- en O4-connector.
  5. Klik op ALE om de functie van adaptieve evolutie te kiezen (Figuur 3B). Schakel in de interface voor parameterinstellingen de schakelaar OD-detectie in.
  6. Stel het getal in als 50, Golflengte als 600 nm, Concentratie als 0%, Type als Tijd, Parameter als 30 h en Herhalingen als 99. Klik op Start om het genereren van druppels te starten. Het duurt ongeveer 25 minuten.
    OPMERKING: Hier verwijst "Concentratie" naar de maximale concentratie van chemische factoren voor adaptieve evolutie. Voor verschillende druppels is het in MMC realiseerbaar om verschillende concentraties van chemische factoren te introduceren om verschillende groeiomstandigheden te bieden. Bereken de geïntroduceerde concentraties met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
    Hier verwijst "C" naar de concentratie van chemische factoren die in druppels worden geïntroduceerd; "a": de concentratie van chemische factoren in de reagensflessen tussen de C4- en O4-connector; "b" verwijst naar de concentratie van chemische factoren in de reagensflessen tussen de C6- en O6-connector; en "i" verwijst naar de beschikbare concentratie. Er zijn acht concentraties beschikbaar in MMC. Aangezien de chemische factor hier een enkele concentratie heeft (500 mmol / L methanol) en het een van de ingrediënten van het medium is, is hier slechts één reagensfles met de chemische factor geïnstalleerd en wordt de concentratie ingesteld op 0%. Type verwijst naar de subkweek, die is onderverdeeld in drie typen: tijdmodus, OD-waardemodus en fluorescentiemodus. De eerste betekent om de druppels voor een vaste tijd te cultiveren en vervolgens te subcultiveren, terwijl de laatste twee middelen om de druppels te cultiveren tot vooraf gedefinieerde OD-waarde / fluorescentie-intensiteit en vervolgens subcultiveren. Parameter verwijst naar de gerelateerde parameter die vereist is bij het kiezen van een subcultuurmodus. Herhalingen verwijst naar het aantal sub-cultivaties.
  7. Verwijder de reagensfles die tussen de C2- en O2-connector is geplaatst, zoals uitgelegd in stap 3.8.
  8. Let erop of de maximale OD-waarden van de druppels tijdens elke subkweekperiode aanzienlijk zijn toegenomen. Als de toename optreedt en voldoet aan de experimentvereisten, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren zoals uitgelegd in stap 3.9.
    OPMERKING: Hier is de subteeltperiode afhankelijk van de parameter. Wanneer u bijvoorbeeld Type instelt als Tijd en Parameter op 30 h, is de subteeltperiode 30 h. Tijdens elke subkweekperiode zijn er de maximale OD-waarden van de druppels. Schat in of de adaptieve evolutie voldoet aan de experimentvereisten door de verhoging van de maximale OD-waarden (de toename hangt af van het daadwerkelijke teeltproces van de stam, bijvoorbeeld verhoogd met meer dan 20%).
    LET OP: Let erop of het opgeslagen verse medium uitgeput is. Als de significante toename niet is opgetreden, zelfs niet nadat het medium is uitgeput, extraheer dan de beter groeiende druppels en voer een nieuwe ronde van adaptieve evolutie uit.
  9. Extraheer de doeldruppels uit de MMC.
    1. Klik op de knop Screening om de functie van druppelextractie te kiezen (figuur 3C). Kies de optie Verzamelen , klik op het aantal doeldruppels en klik vervolgens op OK.
      OPMERKING: Druppelscreening omvat "Collect", "Discard" en "Extract seed solution". "Extractzaadoplossing": het verzamelen van de resterende druppels13 na de onderteelt.
    2. Wacht tot het pop-upvenster vraagt: "Trek de CF-snelconnector eruit en plaats deze in de EP-buis". Plaats de CF-snelkoppeling in de microcentrifugebuis voor verzameling volgens de softwareprompt en klik vervolgens op OK (Figuur 4D).
    3. Na 1-2 minuten verschijnt er een nieuw venster met de vraag: "Plaats de connector terug en klik op OK als u klaar bent". Plaats vervolgens de CF-snelkoppeling terug en klik op OK om MMC te laten blijven werken (Afbeelding 4D). Wanneer de volgende doeldruppel de druppelherkenningsplaats bereikt, herhaalt u 4.9.2-4.9.3 om deze te verzamelen.
      OPMERKING: Nadat alle doeldruppels zijn verzameld, zal de MMC doorgaan met het kweken van de resterende druppels. Als de teelt niet nodig is, klikt u op Stoppen om de bewerking direct te beëindigen.
    4. Extraheer de druppel met een pipet van 2,5 μL, laat deze op de 90 mm agaroseplaat vallen en verdeel deze gelijkmatig met een driehoekige glazen spreidstaaf met een zijlengte van 3 cm. Kweek het vervolgens in een incubator met constante temperatuur van 37 °C gedurende 72 uur.
    5. Pluk 3-5 onafhankelijke kolonies en kweek ze afzonderlijk in de schudkolven van 50 ml met 10 ml vers medium in een schudincubator (200 tpm) bij 37 °C gedurende 48-72 uur. Volg de gerelateerde standaardvoorschriften om de gekweekte bacterie-oplossing in de glycerolbuis op te slaan voor volgende experimenten.

5. Schoon van de MMC

  1. Klik na voltooiing van het experiment op Stoppen om alle bewerkingen te stoppen. Klik vervolgens op Reinigen om de chip en buizen schoon te maken. Het duurt ongeveer 15 minuten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol gebruikt E. coli MG1655 en een MeSV2.2-stam als voorbeelden om de microbiële teelt en methanol-essentiële adaptieve evolutie aan te tonen met een geautomatiseerde en relatief hoge doorvoerstrategie in MMC. De groeicurvemeting werd vooral gebruikt om microbiële teelt te karakteriseren. De adaptieve evolutie werd uitgevoerd door geautomatiseerde continue subteelt en het toevoegen van een hoge concentratie methanol als de selectieve druk tijdens elke subteelt. Of adaptieve evolutie was gerealiseerd, we...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert hoe het microbiële microdruppelcultuursysteem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie op lange termijn uit te voeren. MMC is een geminiaturiseerd, geautomatiseerd en high-throughput microbieel teeltsysteem. In vergelijking met conventionele microbiële teeltmethoden en -instrumenten met hoge doorvoer heeft MMC veel voordelen, zoals een laag arbeids- en reagensverbruik, eenvoudige bediening, online detectie (OD en fluorescentie), gegevensverzameling met ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2018YFA0901500), het National Key Scientific Instrument and Equipment Project van de National Natural Science Foundation of China (21627812) en het Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). We danken ook Prof. Julia A. Vorholt (Instituut voor Microbiologie, Afdeling Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Zwitserland) voor de levering van de methanol-essentiële E. coli stam versie 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PVDF filtermembraanMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBDe MMC olie steriliseren
4 °C koelkastHaierBCD-289BSWVoor reagensopslag
AgarBecton, Dickinson and Company214010Voor de bereiding van vaste platen
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
Schone werkbankBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIVoor aseptische werkzaamheden en UV-sterilisatie
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Software-installatie en MMC-besturing
Incubator met constante temperatuurShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Voor de microbiële cultivatie met vast medium
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
Elektronische weegschaalOHAUSAR 3130Voor het wegen van reagentia
EP-buisThermo Fisher1.5 mLVoor druppelverzameling
FeCl3·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
FreezingbuisThermo Fisher2.0 mLVoor het bewaren van stammen
GluconaatSigma-AldrichS2054Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AVoor het bewaren van stammen
HogedrukstoominsterilisatiepotSANYO ElectricMLS3020Voor sterilisatie met een autoclaaf
isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG)Biotopped420322Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
Kanamycin sulfaatSolarbioK8020Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
MethanolMACKLINM813895Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
Microbiële Microdroplet Cultuursysteem (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-IVoor het bepalen van de groeicurve en adaptieve evolutie. Raadpleeg http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidische chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODVoor verschillende druppeloperaties. Raadpleeg http://www.tmaxtree.com/en/
MMC olieLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODDe oliefase voor druppelmicrofluidica. Raadpleeg http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JOnderdeel van het LB-medium
Na2HPO4·12H2OGENERAL-REAGENTG10267BOnderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
PetrischaalCorning Incorporated90 mmVoor de bereiding van vast medium
Pipeteppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLVoor vloeistofverrinning
Snelle connector ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Voor de verbinding van elke verbinding. Raadpleeg http://www.tmaxtree.com/en/
ReagensflesLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBBemonstering en opslag van bacterieoplossing en reagentia. Raadpleeg http://www.tmaxtree.com/en/
SchudbuisUnion-Biotech50 mLVoor microbiële cultivatie
SchudbroodjeShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BVoor de microbiële cultivatie in schudbuis
StreptomycinesulfaatSolarbioS8290Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
SpuitJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLVloeistof trekken en in de reagensfles injecteren
SpuitenaadOUBEL Hardware Store22GDe binnendiameter is 0,41 mm en de buitendiameter is 0,71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Onderdeel van het LB-medium
Ultralage temperatuur koelkastSANYO Ultra-lowMDF-U4086SVoor stambewaring (-80 °C)
UV–Vis spectrofotometerGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proVoor de meting van OD-waarden
Vitamine B1SolarbioSV8080Onderdeel van het speciale medium voor MeSV2.2.
GistextractOxoid Ltd.LP0021Onderdeel van het LB-medium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles