Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Recombinante productie van bifidobacteriële endoglycosidasen voor afgifte van N-glycaan

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62804

⸱

20 juli 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

In dit artikel

Samenvatting

Bifidobacteriën bezitten een uniek genoomisch vermogen voor N-glycaansplitsing. Het recombinant produceren van deze enzymen zou een veelbelovend nieuw hulpmiddel zijn om bioactieve N-glycanen vrij te maken uit glycoproteïnerijke substraten zoals colostrum.

Samenvatting

Eiwitglycosylering is een diverse en veel voorkomende posttranslationele modificatie die in verband is gebracht met veel belangrijke rollen, zoals eiwitfunctie, waaronder eiwitvouwing, stabiliteit, enzymatische bescherming en biologische herkenning. N-glycanen gehecht aan glycoproteïnen (zoals lactoferrine, lactadherine en immunoglobulinen) kunnen niet door de gastheer worden verteerd en bereiken de dikke darm, waar ze worden geconsumeerd door bepaalde nuttige microben. Daarom worden ze beschouwd als prebiotische verbindingen van de volgende generatie die selectief de nuttige micro-organismen van het darmmicrobioom kunnen stimuleren. De isolatie van deze nieuwe klassen van prebiotica vereist echter nieuwe enzymen. Hier beschrijven we de recombinante productie van nieuwe glycosidasen van verschillende Bifidobacteria-stammen (geïsoleerd uit zuigelingen, konijnen, kippen en hommels) voor een betere N-glycaanisolatie van glycoproteïnen. De methode die in deze studie wordt gepresenteerd, omvat de volgende stappen: moleculair klonen van bifidobacteriële genen door een in vivo recombinatiekloonstrategie, controle van het transformatiesucces, eiwitinductie en eiwitzuivering.

Inleiding

Glycosylering is een zeer cruciale posttranslationele modificatie die wordt waargenomen in eiwitten. Ongeveer meer dan 50% van de eiwitten wordt in hun geglycosyleerde vorm aangetroffen in eukaryoten. N- en O-glycosylering zijn de twee belangrijkste soorten glycosylering 1,2. O-gebonden glycanen (O-glycanen) zijn covalent gehecht aan eiwitten via N-acetylgalactosamine aan de hydroxylgroep van een serine (Ser) of threonine (Thr) aminozuurresiduen. N-gebonden glycanen (N-glycanen) zijn complexe oligosachariden, die covalent gehecht zijn aan asparagine (Asn) aminozuurresidu van de eiwitten via N-acetylglucosamine (GlcNAc) in een bepaalde aminozuursequentie alsN-X-Ser/Thr en een minder gebruikelijke, alsN-X-Cys (cysteïne) (waarbij X elk aminozuur kan zijn behalve proline)3,4. De basische N-glycaankern bestaat uit twee HexNAc- en drie mannoseresiduen. Verdere verlenging van deze gemeenschappelijke kern met andere monosachariden via glycosyltransferase en glycosidase-enzymen bepaalt het type N-glycanen op basis van de mate van vertakking en het type binding5. N-glycanen worden over het algemeen gegroepeerd in drie hoofdklassen: hoge mannose (HM), complex type (CT) en hybride (HY)6.

N-glycanen zijn onverteerbare verbindingen door de gastheerorganismen vanwege het ontbreken van glycoside hydrolase-enzymen. Deze verbindingen bereiken de dunne/dikke darm in een onverteerde vorm waar duizenden verschillende bacteriesoorten ze gebruiken, en ze kunnen fungeren als prebiotica door gespecialiseerde darmmicroben te bevorderen, vooral Bifidobacterium species7. Recente bevindingen toonden aan dat N-glycanen selectief de groei van bepaalde bacteriesoorten stimuleren 8,9. N-glycanen die vrijkwamen uit glycoproteïnen uit rundermelk stimuleerden selectief de groei van Bifidobacterium longum subspecies infantis (B. infantis), een cruciale Bifidobacteriële soort in de darm van het kind, maar andere bifidobacteriële soorten zoals Bifidobacterium animalis (B. animalis) gebruiktendeze verbindingen niet9. Bovendien toonde een recente in vivo studie aan dat 19 unieke N-glycanen uit melklactoferrine en immunoglobulinen selectief de groei van B. infantis8 stimuleren. Vooral B. infantis bezit een genomisch vermogen voor glycaansplitsing en metabolisme. Een Endo-β-N-acetylglucosaminidase (EndoBI-1), dat behoort tot de glycosylhydrolasefamilie 18, recombinant geproduceerd uit B. infantis ATCC 15697, vertoonde een hoge activiteit op melkglycoproteïnen in in vitro omstandigheden 9,10. Dit nieuwe enzym van glycosidehydrolase kan de N-N'-diacetylchitobiose-delen in de N-glycanen splitsen10,11. De activiteit van EndoBI-1 wordt niet beïnvloed door kernfucosylering en verschillende reactieomstandigheden zoals hoge temperatuur, pH, reactietijd, enz. 3,11,12. Deze unieke eigenschap van bifidobacteriële glycosidehydrolasen biedt een veelbelovend hulpmiddel voor het produceren van N-glycanen uit glycoproteïnerijke substraten zoals rundercolostrum13,14.

Verschillende chemisch en enzymatisch ontwikkelde deglycosyleringsmethoden zijn op grote schaal gebruikt om N-glycanen en O-glycanen te verkrijgen uit glycoproteïnen 2,15. Chemische methoden worden veel gebruikt in de glycobiologie voor de deglycosylering van glycoproteïnen vanwege hun gebruiksgemak, lage kosten en hoge substraatspecificiteit16. De meest gebruikelijke chemische deglycosyleringsmethoden zijn β-eliminatie en hydratatie17. Van deze methoden is β-eliminatie gebaseerd op het principe van splitsing van glycanen uit glycoproteïnen door blootstelling van glycoproteïnen aan alkalische omstandigheden. De vrijgekomen glycanen kunnen tijdens het proces worden afgebroken als gevolg van de β-eliminatiereacties, maar dit probleem kan worden voorkomen met behulp van reductiemiddelen zoals natriumboorhydride (NaBH4)18,19,20. Er zijn verschillende beperkingen in de β-eliminatiemethode. De reductiemiddelen zetten glycanen om in alditolen en voorkomen dat ze een fluorofoor of chromofoor binden. Het wordt dus moeilijk om de glycaanafgifte te controleren19,20. Vanwege het hoge zoutgehalte in de reinigingsstap van de methode, kan elutie leiden tot monsterverliezen20. Een andere methode om glycaan uit glycoproteïnen vrij te maken is de hydrazine-methode, gebaseerd op het principe van de hydrolysereactie na toevoeging van watervrij hydrazine aan het glycoproteïne. Omdat het mogelijk is om de isolatie van glycanen te beheersen door reactieomstandigheden zoals temperatuur te veranderen, wordt de hydratatiemethode veel gebruikt in glycobiologie21. Chemische deglycosylering kan ook worden uitgevoerd met behulp van de watervrije formulering van waterstoffluoride en trifluorazijnzuur, naast andere chemische deglycosyleringsmethoden 16,22,23. De enzymatische afgifte van N-glycanen uit glycoproteïnen wordt gewoonlijk uitgevoerd door peptidyl-N-glycosidasen (PNGases) die over het algemeen N-glycanen afgeven, ongeacht hun grootte en lading 24,25,26,27. Net als bij de chemische deglycosyleringsmethoden heeft het enzymatische deglycosyleringsproces verschillende uitdagingen. PNGases vertonen activiteit in de aanwezigheid van verschillende gebruikte wasmiddelen, die de enzymtoegankelijkheid van de glycanen vergroten. Deze harde behandelingen kunnen echter de inheemse glycanen en de resterende polypeptidestructuren verstoren28. PNGases kunnen de glycanen niet splitsen wanneer er een fucose is gekoppeld aan N-acetylglucosamine29. Verschillende endoglycosidasen zoals F1, F2 en F3 vertonen meer activiteit op de natuurlijke eiwitten dan PNGases. Deze endoglycosidasen hebben een lage activiteit op de glycanen met meerdere antennes, terwijl hittebestendige nieuwe EndoBI-1 effectief is in alle soorten N-glycanen 10,11,28. Wat de beperkingen van de huidige methoden betreft, is het duidelijk dat er nog steeds nieuwe enzymen nodig zijn voor een effectieve afgifte van glycaan zonder enige beperking. Voor dit doel maken bifidobacteriële soorten, die een groot genomisch eiland hebben dat codeert voor verschillende glycosidehydrolasenenzymen, het mogelijk om N-glycanen te splitsen van glycoproteïnen30,31. In het kader van deze context is het algemene doel van deze studie het ontdekken van nieuwe glycosidasen van de verschillende bifidobacteriële soorten. Om deze enzymen recombinant te produceren, zijn verschillende fusielabels bedoeld om zowel hun productie als hun activiteit te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Moleculair klonen van bifidobacteriële genen

  1. PCR-amplificatie van gerichte genen door drie vectorprimersets (N-His, C-His en N-His SUMO)
    1. Maak 100 μM voorraad primer (oligomeren) oplossingen door steriel water toe te voegen in de hoeveelheden die door het bedrijf zijn bepaald. Bereid uit deze voorraden 10 μM nieuwe voorraden voor om te worden gebruikt bij PCR-amplificatie van de doelgenen.
    2. Bereid het PCR-mengsel (totaal volume 50 μl) voor met 25 μl mastermix, 1 μl voorwaartse en achterwaartse primer bij 0,2 μM, 21 μl DNase/RNase-vrij gedestilleerd water en 2 μl sjabloon-DNA (bacteriële cellen) in de PCR-buisjes. Roer het mengsel voorzichtig door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: De mastermix (Lucigen) die voor PCR wordt gebruikt, bevat Taq DNA-polymerase met een hoge zuiverheid en hoge activiteit en kan bij hogere temperaturen werken voor betrouwbare amplificatie van sjablonen tot 5 kb.
    3. Stel het PCR-programma als volgt in: eerste denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 minuten voor de afgifte van genomisch DNA, vervolgens 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en rek bij 72 °C gedurende 1 min, en de laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 min.
    4. Controleer de PCR-producten door middel van de agarosegelelektroforesemethode met een geldocumentatiesysteem nadat ze gedurende 60 minuten op 100 V op de 1% agarosegel zijn gebruikt. Meng de PCR-producten en de DNA-ladder met de ladende kleurstof door te mengen in een verhouding van 1:5 (5 μL PCR-product + 1 μL ladende kleurstof en 5 μL 1 kb DNA-ladder + 1 μL laadkleurstof) om op de gel te laden (Figuur 1).
    5. Meet de DNA-concentraties van PCR-producten met behulp van een fluorometer vóór de moleculaire kloonstap.
      OPMERKING: Concentraties van PCR-producten moeten binnen het bereik liggen dat nodig is voor moleculair klonen (25-100 ng/μL).
  2. Bereiding van lysogenie bouillon (LB) agar medium voor moleculair klonen
    1. Los 12,5 g LB en 6 g agarose op in 500 ml dH2O en autoclaaf op het LB-agarmedium (sterilisatie bij 121 °C gedurende 20 min).
    2. Los 15 mg kanamycine op met 1 ml dH2O en bewaar bij -20 °C.
    3. Voeg na het autoclaveren 1 ml kanamycine toe aan de fles met de steriele 500 ml LB-agarmedium. De uiteindelijke concentratie kanamycine is 30 μg/ml. Giet 25 ml LB agar kanamycine media in elke plaat in de laboratoriumkast.
  3. Hitteschoktransformatie van chemisch competente E. coli-cellen
    1. Voeg 1-3 μl (25-100 ng) van de PCR-producten voor elke stam toe aan de buis, inclusief 40 μl chemisch competente E. coli-cellen . Voeg vervolgens 2 μL van het vector-DNA toe aan hetzelfde buisje. Roer voorzichtig met de pipetpunt en breng de mengsels over in centrifugebuisjes van 15 ml.
      OPMERKING: Voer deze stap uit op ijs. Pineer niet op en neer om te mengen om luchtbellen en onbedoeld opwarmende cellen te voorkomen.
    2. Incubeer de buisjes met de competente cellen en het DNA gedurende 30 minuten op ijs. Breng een hitteschok aan op het mengsel in een waterbad van 42 °C gedurende 45 s. Leg deze buisjes direct op ijs en incubeer gedurende 2 minuten.
    3. Voeg 960 μL van het herstelmedium, dat wordt gebruikt voor het snelle herstel van cellen na moleculair klonen, toe aan de cellen in de buisjes en incubeer de buisjes bij 250 rpm gedurende 1 uur bij 37 °C in een schudbroedmachine.
    4. Plaat 100 μL getransformeerde cellen op LB-agarplaten die 30 μg/ml kanamycine bevatten. Gebruik alleen chemisch competente E. coli-cellen als negatieve controle.
      OPMERKING: Breng LB-agarplaten met 30 μg/ml kanamycine, bereid in stap 1.2.2, vóór gebruik in de incubator bij 37 °C.
    5. Incubeer alle platen een nacht bij 37 °C in een omgevingsatmosfeer (figuur 2).
  4. Bereiding van LB-medium voor kolonie-PCR
    1. Los 7,5 g LB met 300 ml dH2O op in een fles en autoclaaf op het LB-medium (sterilisatie bij 121 °C gedurende 20 min).
    2. Los 9 mg kanamycine (30 μg/ml) op met 1 ml dH2O en zet op -20 °C. Voeg na het autoclaveren 1 ml kanamycine toe aan de fles met het steriele 300 ml LB-medium. Bewaar de vloeibare kweekstof tot gebruik bij +4 °C.
  5. Screening van transformatoren door kolonie-PCR
    1. Om te bevestigen dat alle transformanten de recombinante genen dragen, selecteert u willekeurig kolonies en versterkt u de doelgenen door middel van PCR met behulp van de sequencing-primers die bij de kloonkit worden geleverd.
    2. Voer alle stappen op ijs uit en koel alle PCR-buisjes en 15 ml buisjes voor gebruik voor.
    3. Breng met behulp van een pipetpunt de helft van een geselecteerde kolonie over in het PCR-buisje voor elk monster. Neem nog eens de helft van de kolonie met de pipetpunt en doe deze in de buis van 15 ml met 5 ml LB+kanamycine vloeibaar medium (bereid in stap 1.4). Draai de buizen van 15 ml en incubeer de vloeibare culturen een nacht bij 250 tpm bij 37 °C in een schudbroedmachine.
    4. Doe 50 μl PCR-reactiemengsel (25 μl mastermix, 1 μl voorwaartse primer, 1 μl omgekeerde primer, 23 μl DNase/RNase-vrij gedestilleerd water) in alle PCR-buisjes en dispergeer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren.
    5. Stel het PCR-programma in op 95 °C gedurende 5 minuten voor het vrijkomen van genomisch DNA door het lyseren van bacteriële cellen, in totaal 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s voor de eerste denaturatie, 60 °C gedurende 30 s voor het gloeien, 72 °C gedurende 1 minuut voor rek en 72 °C gedurende 10 minuten voor de laatste verlenging.
    6. Controleer de PCR-producten met behulp van de gelelektroforesemethode nadat ze gedurende 60 minuten op 100 V op de 1% agarosegel zijn gedraaid (Figuur 3). De details van de elektroforese van DNA-gel worden beschreven in stap 1.1.3.
    7. Bereid 15% glycerolvoorraden van de succesvolle transformanten. Doe 500 μL 60% glycerolvoorraad in de cryobuisjes en voeg 1.500 μL van de vloeibare cultuur van de succesvolle transformanten toe. Bewaar bereide bouillons bij -80 °C.

2. L-rhamnose inductie van eiwitexpressie

  1. Bereid een voorcultuur voor met 1 L LB vloeibaar medium dat 30 μg/ml kanamycine bevat.
  2. Doe 8 ml van het LB-medium in centrifugebuisjes van 50 ml. Gebruik een van de buisjes als negatieve controle die alleen het vloeibare medium bevat. Los voor 20% L-rhamnose als bouillon 0,5 g L-rhamnose op met 2,5 ml dH2O en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
  3. Doe 10 μL van de bacterievoorraden in de centrifugebuisjes met 8 ml vloeibare media. Draai ze voorzichtig en broed ze een nacht bij 37 °C in de schudbroedmachine.
  4. Giet 250 ml LB vloeibaar medium in een gesteriliseerde erlenmeyer van 2 l.
  5. Inoculeer 2,5 ml van de nachtelijke vloeibare cultuur in een kolf van 2 l met LB vloeibaar medium in een verhouding van 1:100 tussen de kolf en het medium, en incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C en 150 tpm in de schudbroedmachine.
  6. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) voor de bacteriële cellen met een spectrofotometer. Wanneer de cellen de optische dichtheid van 0,5-0,6 bereiken, voegt u 2,5 ml 20% rhamnose (de uiteindelijke concentratie is 0,2%) toe aan de 250 ml LB-cultuur en incubert u 's nachts bij 37 °C bij 250 tpm in de schudbroedmachine.
  7. Breng de vloeibare cultuur over in de buisjes van 5 x 50 ml, centrifugeer de monsters 3724 x g gedurende 15 minuten bij +4 °C en gooi het bovenstaande weg. Bewaar de pellets bij -20 °C tot de zuiveringsstap.
    OPMERKING: Om de eiwitexpressie met SDS-PAGE te evalueren, verzamelt u 1 ml niet-geïnduceerde (wanneer gekweekt met een optische dichtheid van 600 nm van 0,5-0,6, zonder L-rhamnose) cultuur als controle en 1 ml geïnduceerde cultuur (na nachtelijke incubatie) als geïnduceerd monster. Microcentrifugeer alle monsters bij 12.000 x g gedurende 1 minuut en suspendeer niet-geïnduceerde en geïnduceerde monsters met respectievelijk 50 μL en 100 μL SDS-PAGE laadbuffer.

3. Cellyse van chemisch competente E. coli-cellen die His-gelabelde enzymen bevatten

  1. Bereid lysisbuffer pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazool, 1% SDS), evenwichtsbuffer pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool), wasbuffer pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazool) en elutiebuffer pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool).
  2. Plaats de buisjes van 50 ml met de celpellets gedurende 15 minuten bij -80 °C om in te vriezen. Verwijder vervolgens de pellets van -80 °C en ontdooi ze bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 5 ml dH2O toe aan de pellets en los op door op en neer te pipetteren. Centrifugeer bij 3724 x g gedurende 15 minuten bij +4 °C en gooi het bovenstaande weg.
  4. Voeg voor 50 ml kweekpellets 6.300 μL lysisbuffer en 63 μL EDTA-vrije stopproteaseremmercocktail (verhouding 1:100) toe aan de pellets en los op door op en neer te pipetteren. Incubeer ze 30 minuten op ijs, vortex elke 10 minuten.
  5. Stel de pulsmodus van de sonicator in op 10 s AAN en 59 s UIT, en de amplitude op 37%. Plaats de buis in een bekerglas met ijs en dompel de sonde van de sonicator onder in de buis.
    NOTITIE: De sonde moet volledig worden ondergedompeld zonder een kant van de buis aan te raken.
  6. Na het sonicatieproces (6 pulsen gedurende 10 s met 1 minuut koeling) centrifugeren de monsters op 3.724 x g gedurende 45 minuten bij +4 °C. Verzamel vervolgens alle bovenstaande onderdelen in een buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3.724 x g bij +4 °C.
  7. Verzamel het bovenstaande in een buisje en neem 100 μL van het monster voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) in stap 4.7. Meet de eiwitconcentraties van de monsters met behulp van een fluorometer.

4. Zuivering van enzymen met een His-label door middel van een batchmethode

  1. Voeg 1 ml Ni-NTA-hars toe aan een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 2 minuten op 700 x g. Verwijder voorzichtig de tube en gooi het gevormde bovenstaande weg.
  2. Voeg 2 ml (tweemaal het harsvolume) van de evenwichtsbuffer toe aan de buis en meng goed totdat de hars volledig is gesuspendeerd. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten op 700 x g en verwijder de buffer voorzichtig en gooi deze weg.
  3. Meng het eiwitextract en de evenwichtsbuffer in een verhouding van 1:1 in een centrifugebuis. Voeg het mengsel toe aan de buis met hars en zet het 30 minuten op een shaker op 150 tpm. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten op 700 x g en gooi de supernatant weg.
  4. Was de hars met 5 ml wasbuffer en centrifugeer de tube gedurende 2 minuten op 700 x g. Herhaal de wasstap totdat de concentratie van het bovenstaande afneemt tot de basislijn.
  5. Voeg 1 ml elutiebuffer toe aan de buis om gebonden His-gelabelde eiwitten te elueren. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten op 700 x g. Sla het bovenstaande op en neem 100 μL voor SDS-PAGE-analyse in stap 4.7. Herhaal de elutiestap drie keer. Meet de concentraties van elk supernatans met behulp van een fluorometer.
  6. Verzamel alle bovenstaande stoffen in de 10 kDa cut-off buis en centrifugeer deze gedurende 2 minuten bij 700 x g. Herhaal de centrifugatie totdat het volume van het bovenstaande afneemt tot 200 μl door af en toe op en neer te pipetteren. Bewaar de gezuiverde eiwitten bij -20 °C en neem 100 μL voor SDS-PAGE-analyse in stap 4.7.
    OPMERKING: De eiwitconcentratie moet worden gemeten en, als de concentratie laag is, centrifugeren totdat deze toeneemt.
  7. SDS-PAGE analyse van de gezuiverde eiwitten
    1. Bereid een 4% stapelgel (40% acrylamide/bisacrylamide, 1 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% ammoniumpersulfaat, TEMED, dH2O) en 12% oplossende gel (40% acrylamide/bisacrylamide, 1 M Tris pH 8,8, 10% SDS, 10% ammoniumpersulfaat, TEMED, dH2O).
    2. Meng het monster met 2x Laemmli monsterbuffer in een verhouding van 1:1 en incubeer gedurende 5 minuten bij 95 °C om de eiwitten te denatureren.
      OPMERKING: De eiwitconcentratie van monsters moet worden gemeten voordat ze worden geladen en het geladen volume is gebaseerd op hun concentratie voor een gelijke belasting.
    3. Voeg 1x lopende buffer toe aan de tank en laad de monsters en de eiwitladder in de putjes. Laat de eiwitten eerst op 80 V draaien en verhoog de stroom naar 120 V wanneer de eiwitten van de stapelgel naar de oplossende gel gaan.
    4. Doe de gel in coomassie blue staining dye en doe het 30 minuten in een shaker. Was de gel met een kleuroplossing (250 ml dH2O + 50 ml azijnzuur (HOAc) + 200 ml methanol) en maak de afbeelding (Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Glycosylhydrolase-lidenzymen geselecteerd van verschillende oorsprong waren het doelwit in deze studie. Er werd aangenomen dat de gelijktijdige toepassing van verschillende enzymen met verschillende structuren zou kunnen zorgen voor een betere afgifte van glycanen, aangezien ze zijn geëvolueerd om actief te zijn in verschillende glycoproteïnen. De lijst van doelwitgenen en hun oorsprong staat vermeld in tabel 1. Bacteriestammen werden verkregen uit Belgium Co-ordinated C...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in vivo recombinatiekloneringsstrategie die wordt gebruikt voor het moleculair klonen van de doelgenen levert snelle en betrouwbare resultaten op in vergelijking met andere traditionele kloonprotocollen. Hoewel er veel handige methoden zijn voor moleculair klonen, heeft de methode die in dit artikel wordt beschreven meer voordelen. In tegenstelling tot andere kloonsystemen heeft het in-vivo-kloonsysteem geen enzymatische behandeling of zuivering van de PCR-producten ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door TUBITAK #118z146 en Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplificatie van doelgenen (PCR)
DNase/RNase-vrij gedistilleerd waterInvitrogen10977035Amplificatie van doelgenen (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RDNA-gelelektroforese
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500DNA-gelelektroforese
Qubit-eiwitanalysekitInvitrogenQ33211Meting van DNA-concentratie
LB-bouillon, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGBacterieel kweekmedium
AgaroseInvitrogen16500-500Bacterieel kweekmedium et al.
Kanamycin monosulfaatGoldBioK-120-5Antibioticum in bacterieel kweekmedium
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-HisLucigen49011-1Kloneerkit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMOLucigen49013-1Kloneerkit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-HisLucigen49012-1Kloneerkit
GlyceroloplossingSigma-Aldrich15524-1L-RBereiding van glycerolvoorraad
L-Rhamnose monohydraatSigma-Aldrich83650Inductie van eiwitexpressie
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Page-analyse
SureCast 40% (w/v) AcrylamideInvitrogenHC2040SDS-Page-analyse
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page-analyse
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page-analyse
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page-analyse
Tris et al.BioShopTRS001.1SDS-Page-analyse en cellysis
10% SDSClearBandS100SDS-Page-analyse
PageRuler Plus voorgekleurde eiwitladderThermoFisher26619SDS-Page-analyse
ImidazoolSigma-Aldrich56750Cellysis
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RCellysis
Natriumfosfaat monobasisch anhydrousamresco0571-1KgNatriumfosfaatbuffer voor cellysis
Natriumfosfaat dibasisch dihydraat et al.Sigma-Aldrich04272-1KgNatriumfosfaatbuffer voor cellysis
10-kDa-cut-off centrifugaalfilterAmicon®- MERCKUFC9010Zuivering van enzymen
```

Referenties

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729(2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323(2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485(2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275(2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646(1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315(2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ProteïneglycosyleringGlycoproteïne-isolatieMoleculaire kloneringProteïnezuiveringDarmmicrobioomPrebiotische verbindingenGlycosidase-enzymen

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.