In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

Samenvatting

Immunogene celdood van tumoren, veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, kan tumorspecifieke T-celreacties veroorzaken door gevaargerelateerde moleculaire patronen vrij te geven en de productie van type I-interferon te induceren. Immunotherapieën, waaronder checkpoint-remming, vertrouwen voornamelijk op reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen om een therapeutisch effect te ontvouwen. Synergetische therapeutische benaderingen die immunogene celdood gebruiken als een intrinsiek antikankervaccin kunnen dus hun reactievermogen verbeteren. Het spectrum van immunogene factoren die vrijkomen door cellen onder therapie-geïnduceerde stress blijft echter onvolledig gekarakteriseerd, vooral met betrekking tot extracellulaire blaasjes (EV's). EV's, vliezige deeltjes op nanoschaal die door vrijwel alle cellen worden uitgestoten, worden beschouwd als vergemakkelijken intercellulaire communicatie en bij kanker is aangetoond dat ze cross-priming tegen tumorantigenen bemiddelen. Om het immunogene effect van EV's afgeleid van tumoren onder verschillende omstandigheden te beoordelen, wordt gezocht naar aanpasbare, schaalbare en geldige methoden. Daarom wordt hierin een relatief eenvoudige en robuuste aanpak gepresenteerd om de in vivo immunogeniciteit van EV's te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op flowcytometrie-analyse van milt T-cellen na in vivo immunisatie van muizen met EV's, geïsoleerd door op neerslag gebaseerde assays van tumorcelculturen onder therapie of steady-state omstandigheden. Dit werk toont bijvoorbeeld aan dat oxaliplatineblootstelling van B16-OVA-muizenmelanoomcellen resulteerde in de afgifte van immunogene EV's die de activering van tumorreactieve cytotoxische T-cellen kunnen bemiddelen. Daarom identificeert screening van EV's via in vivo immunisatie en flowcytometrie omstandigheden waaronder immunogene EV's kunnen ontstaan. Het identificeren van de voorwaarden voor immunogene EV-afgifte biedt een essentiële voorwaarde voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van EV's tegen kanker en het verkennen van de onderliggende moleculaire mechanismen om uiteindelijk nieuwe inzichten te onthullen in de rol van EV's in de immunologie van kanker.

Inleiding

Het immuunsysteem speelt een cruciale rol in de strijd tegen kanker, zowel wanneer het wordt aangezet door immuuncheckpointremming als voor de werkzaamheid van conventionele kankertherapieën. Tumorcellen die bezwijken voor genotoxische therapieën zoals de chemotherapeutische middelen oxaliplatine en doxorubicine, of ioniserende bestralingsbehandeling kunnen antigenen en gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) vrijgeven die mogelijk een adaptieve anti-tumor immuunrespons ^initiëren1. De meest prominente DAMPs, in de context van immunogene celdood, omvatten find-me-signalen zoals chemotactische ATP, eat-me-signalen zoals de blootstelling....

Protocol

Aan het begin van de experimenten waren muizen minstens 6 weken oud en werden ze onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Dit protocol voldoet aan de institutionele ethische normen en de geldende lokale regelgeving. Dierstudies werden goedgekeurd door de lokale regelgevende instantie (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). Mogelijke geslachtsgerelateerde vooroordelen werden in deze studies niet onderzocht.

1. Generatie en isolatie van EV's afgeleid van tumorcellen na blootstelling aan chemotherapie

1. Kweekmuun B16 melanoomcellen die ovalbumine (B16-OVA) tot expressie brengen in DMEM (met 4 mM L-glutamine en 4....

Resultaten

Dit protocol is bedoeld om de eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbare beoordeling van de immunogeniciteit van tumor-afgeleide EV's te vergemakkelijken. Hierbij worden muizen geënt met EV's afgeleid van in vitro culturen van tumorcellen die het modelantigeen kippenovoalbumine (OVA) tot expressie brengen. De daaropvolgende immuunrespons wordt geanalyseerd in milt T-cellen via flowcytometrie.

Figuur 1 geeft een overzicht van de praktische stappen .......

Discussie

Dit protocol biedt een immunologische in vivo beoordeling van EV's afgeleid van melanoomcellen onder chemotherapie-geïnduceerde stress, terwijl het zich aanpast aan EV's die worden uitgezonden door verschillende kankers onder verschillende behandelingen. Het immuniseren van muizen met EV's afgeleid van met oxaliplatine behandelde B16-OVA-cellen, bijvoorbeeld, breidt IFN-γ-producerende CD8 ⁺ T-cellen in de milt uit, die verder worden gestimuleerd door ex vivo incubatie met ovalbumine, wat wijs.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium met D-glucose (4,5 g/L) en L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	Van Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine met < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline zonder calciumchloride en magnesiumchloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mengsel van penicilline (10.000 U/mL) en streptomycine (10.000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristaat 13-acetaat, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, voor spuiten	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membraan
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium met D-glucose (2,00 g/L) en L-glutamine (300 mg/L), zonder HEPES
Spuit, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Spuiten met naald (0,45 mm x 12,7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	Voor isolatie uit celkweekmedia
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)