Diepe en ruimtelijk gecontroleerde volume-ablaties met behulp van een twee-fotonenmicroscoop in de zebravis Gastrula

Summary

Embryonale ontwikkeling vereist grootschalige coördinatie van celbewegingen. Twee-foton excitatie gemedieerde laserablatie maakt de ruimtelijk gecontroleerde 3-dimensionale ablatie van grote groepen diepe cellen mogelijk. Bovendien kan deze techniek de reactie van collectief migrerende cellen in vivo op verstoringen in hun mechanische omgeving onderzoeken.

Abstract

Morfogenese omvat veel celbewegingen om cellen in weefsels en organen te organiseren. Voor een goede ontwikkeling moeten al deze bewegingen nauw worden gecoördineerd, en accumulerend bewijs suggereert dat dit, althans gedeeltelijk, wordt bereikt door mechanische interacties. Het testen hiervan in het embryo vereist directe fysieke verstoringen. Laserablaties zijn een steeds vaker gebruikte optie die het mogelijk maakt om mechanische beperkingen te verlichten of twee celpopulaties fysiek van elkaar te isoleren. Veel ablaties worden echter uitgevoerd met een ultraviolette (UV) laser, die een beperkte axiale resolutie en weefselpenetratie biedt. Hier wordt een methode beschreven om diepe, significante en ruimtelijk goed gedefinieerde volumes af te breken met behulp van een microscoop met twee fotonen. Ablaties worden gedemonstreerd in een transgene zebravislijn die het groene fluorescerende eiwit in het axiale mesendoderm tot expressie brengt en wordt gebruikt om het axiale mesendoderm af te snijden zonder het bovenliggende ectoderm of de onderliggende dooiercel te beïnvloeden. Het celgedrag wordt gevolgd door live beeldvorming voor en na de ablatie. Het ablatieprotocol kan worden gebruikt in verschillende ontwikkelingsstadia, op elk celtype of weefsel, op schalen variërend van enkele micron tot meer dan honderd micron.

Introduction

Cel-cel interacties spelen een vitale rol in de ontwikkeling. Cellen geven signalen die hun directe buren, of cellen verder weg, kunnen waarnemen, waardoor hun lot en/of gedrag wordt beïnvloed. Veel van deze signalen zijn chemisch van aard. Bijvoorbeeld, in de goed gekarakteriseerde inductiegebeurtenissen produceert een celgroep diffuusibele moleculen die het lot van een andere celpopulatie ^{beïnvloeden1}. Andere signalen zijn echter mechanisch; cellen oefenen krachten en beperkingen uit op hun buren, die de buren waarnemen en waarop ze ^reageren2.

Een manier om het belang van deze cel-cel interacties in vivo te bestuderen, is door sommige cellen te elimineren en de daaropvolgende ontwikkeling te observeren. Helaas zijn de beschikbare technieken om cellen te verwijderen of te vernietigen beperkt. Cellen kunnen chirurgisch worden ^{verwijderd3,4}, met behulp van naalden of kleine draden, maar dergelijke behandelingen zijn invasief, niet erg nauwkeurig en worden meestal uitgevoerd onder een stereomicroscoop, waardoor onmiddellijke beeldvorming onder een microscoop wordt voorkomen. Bovendien impliceert het richten op diepe cellen het doorboren van een gat in bovenliggende weefsels, waardoor ongewenste verstoringen ontstaan. Genetisch gecodeerde fotosensitizers, zoals KillerRed, zijn gebruikt om celdood te induceren via ^{lichtverlichting5}. Fotosensitizers zijn chromoforen die reactieve zuurstofsoorten genereren bij lichtbestraling. Hun belangrijkste beperking is dat ze lange lichtverlichting nodig hebben (ongeveer 15 minuten), wat moeilijk te bereiken kan zijn als cellen bewegen, en dat ze celdood induceren door apoptose, wat niet onmiddellijk is.

Ten slotte zijn laserablaties ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in de afgelopen 15 jaar6,7,8,9,10,11,12. Een laserstraal wordt gericht op de beoogde cel/weefsel. Het induceert zijn ablatie door verhitting, fotoablatie of plasma-geïnduceerde ablatie; het betrokken proces is afhankelijk van de vermogensdichtheid en ^{belichtingstijd13}. De meeste ablatieprotocollen gebruiken UV-lasers voor hun hoge energie. UV-licht wordt echter zowel geabsorbeerd als verstrooid door biologische weefsels. Het richten op diepe cellen vereist dus een hoog laservermogen, dat vervolgens schade veroorzaakt in meer oppervlakkige, buiten het vlak gelegen weefsels. Dit beperkt het gebruik van UV-lasers tot oppervlakkige structuren en verklaart hun relatief lage axiale resolutie. Niet-lineaire optica (zogenaamde twee-fotonenmicroscopie) maakt gebruik van niet-lineaire eigenschappen van licht om een fluorofoor te prikkelen met twee fotonen van ongeveer halve energie in het infrarode domein. Wanneer toegepast op ablaties, heeft dit drie belangrijke voordelen. Ten eerste wordt het infraroodlicht minder verstrooid en minder geabsorbeerd dan UV-licht door biologische ^weefsels14, waardoor diepere structuren kunnen worden bereikt zonder het vereiste laservermogen te vergroten. Ten tweede zorgt het gebruik van een femtoseconde gepulseerde laser voor zeer hoge vermogensdichtheden, waardoor een ablatie ontstaat door plasma-inductie, die, in tegenstelling tot verwarming, niet ruimtelijk ^{diffundeert15}. Ten derde wordt de vermogensdichtheid die plasmavorming induceert alleen op het brandpunt bereikt. Dankzij deze eigenschappen kunnen laserablaties met twee fotonen worden gebruikt om diepe cellen nauwkeurig te richten zonder de omliggende weefselomgeving te beïnvloeden.

Collectieve migraties zijn een uitstekend voorbeeld van ontwikkelingsprocessen waarbij cel-cel interacties fundamenteel zijn. Collectieve migraties worden gedefinieerd als celmigraties waarbij naburige cellen het gedrag van één cel ^{beïnvloeden16}. De aard van deze interacties (chemisch of mechanisch) en hoe ze celmigratie beïnvloeden, kan sterk variëren en wordt vaak niet helemaal begrepen. Het vermogen om cellen te verwijderen en te observeren hoe dit de anderen beïnvloedt, is van cruciaal belang bij het verder ontrafelen van deze collectieve processen. Een paar jaar geleden stelden we vast – met behulp van chirurgische benaderingen – dat de migratie van de polster tijdens zebravisgastrulatie een collectieve migratie ^is17. De polster is een groep cellen die de eerste internaliserende cellen aan de dorsale kant van het embryo ^vormt18. Deze cellen, gelabeld in groen in de Tg (gsc: GFP) transgene lijn, bevinden zich diep in het embryo, onder verschillende lagen epiblastcellen. Tijdens gastrulatie leidt deze groep de uitbreiding van het axiale mesoderm, migrerend van de embryonale organizer naar de dierlijke pool19,20,21,22,23 (figuur 1A). We stelden vast dat cellen contact met hun buren nodig hebben om hun migratie in de richting van de dierenpool te oriënteren. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire bases van deze collectieve migratie houdt echter in dat sommige cellen worden verwijderd om te zien hoe dit de resterende cellen beïnvloedt. Daarom ontwikkelden we ablaties van grote en diepe volumes met behulp van een microscopie-opstelling met twee fotonen. Hier demonstreren we het gebruik van dit protocol om de polster in het midden te scheiden en de gevolgen voor celmigratie te observeren door kernen te volgen die zijn gelabeld met Histone2B-mCherry.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Ethische Commissie N 59 en het Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche onder het dossiernummer APAFIS#15859-2018051710341011v3. Sommige van de onderstaande stappen zijn specifiek voor onze apparatuur en software, maar kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende apparatuur.

1. Injectie voorbereiding

1. Bereid 75 ml 1% agarose-oplossing in Embryo Medium (EM).
2. Plaats de spuitvorm in een petrischaaltje van 90 mm en giet ongeveer 50 ml agarose, genoeg om de mal te laten drijven. Laat de agarose stollen en verwijder de spuitvorm.
3. Bereid een met agarose bedekte schaal door 1 ml agarose in een petrischaaltje van 30 mm te gieten.
4. Bereid 4 μL van 30 ng/μL Histone2B-mCherry mRNA-oplossing door de stamoplossing te verdunnen in RNase-vrij water en op ijs te houden.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u handschoenen draagt tijdens het manipuleren van mRNA om RNase-gemedieerde degradatie te voorkomen.
5. Trek een injectienaald uit een capillair met behulp van de micropipette puller.

2. Embryopreparatie

1. Zodra vissen eieren hebben gelegd, verzamelen, spoelen en oogsten in een petrischaaltje van 90 mm in EM. Plaats de embryo's in een couveuse van 28,5 °C.
2. Wacht 20 minuten tot de eerste cel zichtbaar is.
3. Breng 30 embryo's terug naar de injectieplaat gevuld met EM. Knijp embryo's in de groeven met een licht stompe tang en oriënteer ze met de dierenpaal omhoog.
4. Vul met behulp van een microladerpunt een injectienaald met 2 μL mRNA-oplossing. Steek de naald in de capillaire houder die is geplaatst in een micromanipulator die is verbonden met een slang van polytetrafluorethyleen (PTFE) op een luchtinjector.
5. Breek onder de stereomicroscoop voorzichtig de punt van de naald.
6. Injecteer de mRNA-oplossing in de embryo's van het 1-celstadium door de naald in de cel in te brengen.
   OPMERKING: Het geïnjecteerde volume is ongeveer een derde van het celvolume.
7. Plaats de geïnjecteerde embryo's terug in de couveuse van 28,5 °C.

3. Voorbereiding van de twee-fotonenmicroscoop

OPMERKING: In dit protocol worden twee lasers gebruikt. Men wordt gebruikt om GFP in beeld te brengen (bij 920 nm) en ablaties uit te voeren (bij 820 nm). Het wordt de groene /ablatielaser genoemd. De andere wordt gebruikt bij 1160 nm om mCherry in beeld te brengen. Het zal de rode laser worden genoemd.

1. Stel de groene/ablatielaser in op 820 nm (ablatiegolflengte) en de rode laser op 1160 nm (mCherry excitatie).
2. Gebruik beweegbare spiegels op het optische pad om groene/ablatie- en rode laserstralen uit te lijnen, zowel bij het in- als uitstappen van de scankop.
   OPMERKING: Dit verhoogt de focus van de laserstraal en minimaliseert het focale volume voor excitatie en ablatie.
3. Meet het maximale vermogen van de groen/ablatielaser bij 820 nm onder het objectief. Plaats hiervoor de vermogensmeter onder het objectief, sluit de zwarte kamer, stel het groene / ablatielaservermogen in op 100% en open de luiken. Bereken het percentage laservermogen dat nodig is om 300 mW te bereiken.
4. Zet de groene/ablatielaser terug op 920 nm (GFP excitatie) en stel het laservermogen in op 7%. Stel het rode laservermogen in op 15%.
5. Activeer epi-PhotoMultiplier Tubes (PMT) detectoren voor groene en rode lijnen; stel de PMT-gevoeligheid van de groene en rode lijn in op 65.
6. Stel het gezichtsveld in op 400 x 400 μm, de beeldresolutie op 512 x 512 pixels en de scanfrequentie op 800 Hz.
7. Selecteer 3D Timelapse Imaging-modus . Maak vervolgens een map en activeer Automatisch opslaan voor gegevens na elke acquisitie.
8. Monteer de verwarmingskamer en stel deze in op 28 °C. Wacht minstens 10 minuten tot de kamer en het doel opwarmen.

4. Montage van het embryo

1. Identificeer onder een fluorescentieseomicroscoop embryo's met 70% epibolie die GFP tot expressie brengen.
   OPMERKING: Selecteer embryo's met een helder signaal in het axiale mesoderm en geen achtergrondfluorescentie voor een betere beeldkwaliteit.
2. Breng drie tot vier geselecteerde embryo's over in de met agarose beklede schaal (stap 1.3) met behulp van een plastic Pasteur-pipet en dechorioneer ze zorgvuldig met een fijne tang.
   OPMERKING: Gedórioneerde embryo's zijn zeer delicaat en zullen barsten bij contact met lucht of plastic.
3. Giet 1 ml van 0,2% agarose in 1x penicilline-streptomycine EM in een kleine glazen injectieflacon. Plaats de injectieflacon in een voorverwarmde droge blokverwarmer van 42 °C.
   OPMERKING: De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd om embryo-oriëntatie mogelijk te maken voordat agarose ondergaat.
4. Breng een gedechorioneerd embryo over in de 0,2% agarose glazen injectieflacon met behulp van een vuurgepolijste glazen pipet. Zorg ervoor dat u niet te veel EM in de agarose toevoegt om te voorkomen dat deze verdunt. Gooi de resterende EM uit de pipet en anspirateer het embryo terug samen met voldoende agarose om de glijbaan van de glazen bodemschaal te bedekken voordat het embryo uit de pipet valt.
5. Blaas de agarose en het embryo op de glasplaat van de schaal. Zorg ervoor dat het embryo de lucht of de plastic kant van de schaal niet raakt. Vul vervolgens de kamer rond de glasplaat met agarose.
6. Gebruik een wimper om het embryo zo te oriënteren dat het beoogde gebied zich bovenaan bevindt (figuur 1B).
   OPMERKING: Let er bij het oriënteren van embryo's op dat u alleen het blastoderm aanraakt, niet de zeer fragiele dooier. Agarose zal in ongeveer 1 min ingaan, afhankelijk van de kamertemperatuur.
7. Wacht ~ 5 minuten tot de agarose volledig is uitgehard en voeg dan een paar druppels penicilline-streptomycine EM toe.

5. Lokalisering van het embryo en pre-ablatie beeldvorming

1. Plaats de glazen bodemschaal onder het objectief in de verwarmde kamer. Dompel het doel onder in penicilline-streptomycine EM en sluit de verwarmde kamer.
2. Verplaats de schuifregelaar om het lichtpad in te stellen op een oculair. Zoek vervolgens met behulp van oculairen, fluorescentielampen en podiumcontrole een embryo en stel de focus op het oppervlak van het embryo.
3. Schakel de fluorescentielamp uit, stel het lichtpad in op PMT's en sluit de zwarte kamer.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle lichtbronnen in de zwarte kamer uitschakelt, omdat dit de PMT's kan beschadigen.
4. Start live beeldvorming en lokalis mesoderm. Pas de groene/ablatie- en rode laserkrachten aan om een goed signaal te hebben (d.w.z. tussen 1.000 en 20.000 fotonen per pixel voor GFP-expressiegebieden). Gebruik het rode kanaal om het podium naar de top van het embryo te verplaatsen en stel deze positie in als Z = 0.
5. Kies een tijdstap van 1 min en een Z-stap van 2 μm. Een Z-kuur van 110 μm is voldoende om de hele polster te omvatten en wordt met deze instellingen in minder dan 1 minuut verkregen. Plaats de eerste plak 15 μm boven het axiale mesoderm (in het meer oppervlakkige ectoderm).
   OPMERKING: De polster beweegt langs een gebogen lijn, zodat het onderste deel van de Z-stack 30 μm dieper moet worden ingesteld dan de diepste positie van de polster om de beweging tijdens de time-lapse-beeldvorming mogelijk te maken (figuur 1E).
6. Neem 10-15 minuten pre-ablatiefilm op.

Figuur 1: Succesvolle uitkomst van laserablaties. (A) Schema van een gastrulerend embryo bij 70% epibolie in dorsale weergave; pAM: posterieur axiale mesoderm; zwarte pijl markeert de richting van polstermigratie; zwart vierkant geeft een typisch gezichtsveld aan voor ablaties in de polster. (B) Schema voor het verzamelen van embryo's voor het scheiden van polster. Zijdelingse weergave. Het embryo is zo gemonteerd dat het vlak van de polster loodrecht staat op de optische as. (C) overleving en (D) morfologie van controle- en geableerde embryo's 24 uur na de bevruchting. Schaalbalk is 300 μm. (E) Tijdsequentie van laserablatie in de polster van een Tg (gsc: GFP) embryo dat Histone2B-mCherry tot expressie brengt. Weergaven met alleen het groene kanaal zijn maximale projecties. De close-up toont het opgeblazen gebied met celresten. Weergaven met groene en rode (weergegeven als magenta) kanalen zijn XY- en XZ-segmenten voor en na ablatie (de groene bliksemschicht staat voor ablatie). XZ-plakjes laten zien dat de bovenliggende weefsels (magentakernen zonder GFP-expressie) niet zijn aangetast door de ablatie van onderliggende structuren. Het gele vak met streepjes komt overeen met de ROI die is geselecteerd voor laserablatiebehandeling. De schaalbalk is 50 μm in grote weergaven en 25 μm in de close-up. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Doellocatie en laserablatie

1. Zoek de polstercontour op live imaging en teken met behulp van het gereedschap Electro-Optic Modulator Region of Interest (EOM ROI) een grote rechthoek van 20 pixels (15 μm) die de breedte van de polster overspant. Plaats deze rechthoek in het midden van de polster (figuur 1E).
2. Let op de axiale positie van het hoogste en laagste vlak dat polstercellen bevat. Ablaties zullen elke 10 μm tussen deze twee vlakken worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de ROI de dooiercel op geen van deze vlakken overlapt.
3. Plaats het podium op de laagste Z-positie van het interval. Ablaties moeten bottom-up worden uitgevoerd omdat vuil licht absorbeert.
4. Stel de golflengte van de groene/ablatielaser in op 820 nm en stel het vermogenspercentage in om een uitgangsvermogen van 300 mW te verkrijgen (stap 3.3).
5. Stel de beeldfrequentie in op 200 Hz.
6. Stel groene/ablatielaserbeeldvorming EOM in op 0 en selecteer ROI-Treat-modus .
7. Schakel de EOM in en stel de behandeling in om onmiddellijk te starten (na 0 frame).
8. Stel de beeldmodus in op Timelapse en schakel Automatisch opslaan uit.
9. Stel de tijdstap in op de snelle modus.
10. Stel het aantal behandelingsframes en het aantal frames in op de waarde die overeenkomt met de beoogde diepte (tabel 1).

Diepte (μm)	Behandelframes
-30	1
-35	1-2
-40	1-2
-45	2
-50	2-3
-55	3
-60	3-4
-65	4
-70	4
-75	4-5
-80	4-5
-85	5
-90	5
-95	5-6
-100	6
-105	6

Tabel 1: Voorgesteld aantal laserbehandelingsframes als functie van de beoogde celdiepte in het embryo (0 is het oppervlak van het embryo).

11. Begin met beeldvorming. De overname is zwart als de sluiter naar PMT sluit tijdens de EOM-behandeling.
12. Ga omhoog in het werkgebied naar de volgende Z-positie van de lijst (stap 6.2).
13. Herhaal stap 6.10 tot 6.12 totdat de bovenkant van de polster is bereikt.

7. Post-ablatie verificatie en beeldvorming

1. Stel de groen/ablatielaser in op 920 nm en 5% vermogen. Stel de groene/ablatie laser imaging EOM in op 100 en selecteer de Fullfield-modus .
2. Stel de beeldfrequentie in op 800 Hz. Schakel EOM uit.
3. Ga door de hele stapel in live-modus om te controleren of elk vliegtuig is geableerd. Als dit niet het geval is, gaat u terug naar stap 6.2.
   OPMERKING: Ablatie induceert soms een verticale verschuiving van naburige weefsels, zodat de Z-stack mogelijk opnieuw moet worden gedefinieerd.
4. Stel de beeldmodus in op 3D Timelapse en activeer Automatisch opslaan opnieuw. Neem 40-60 minuten post-ablatiefilm op.
5. Controleer in de post-ablatiefilm of de beoogde cellen effectief werden geableerd. Fluorescentieherstel, of gerichte cellen die ruimte innemen en voorkomen dat volgcellen er doorheen bewegen, geven aan dat gerichte cellen alleen gefotobleekt waren en niet opgeblazen (figuur 1E en figuur 2A).

Figuur 2: Negatieve resultaten van laserablaties. (A) Typische voorbeelden van mogelijke storingen in laserablatie. Grote XY-weergaven zijn maximale projecties, XZ-weergave is een gereconstrueerd gedeelte. Laserbehandeld gebied bevindt zich tussen de twee witte pijlpunten. Drie brandpuntsvlakken worden gemarkeerd in het gereconstrueerde gedeelte en aan de rechterkant weergegeven. Ze komen overeen met drie verschillende soorten mislukkingen. Vlak 1 laat zien dat cellen boven de polster zijn geableerd. Dit is te herkennen aan de aanwezigheid van autofluorescent puin op dit brandpuntsvlak (zie close-up) boven de polster (zie positie van vlak 1 op het gereconstrueerde gedeelte). Dit is waarschijnlijk het gevolg van een onjuiste definitie van de regio die moet worden geableerd. Vlak 2 toont cellen die gebleekt zijn maar niet geableerd. Ze kunnen worden geïdentificeerd omdat het lage fluorescentiesignaal nog steeds intacte celcontouren onthult (zie close-up). Vlak 3 toont intacte cellen, die nauwelijks zijn gebleekt door laserbehandeling. Dit kan het gevolg zijn van een onjuiste definitie van de regio die moet worden geableerd of van een slechte behandeling. In de situaties die in de vlakken 2 en 3 worden afgebeeld, is het mogelijk om de ablatiebehandeling opnieuw toe te passen op de niet-geableerde doelcellen. De schaalbalk is 50 μm in grote weergaven en 20 μm in close-ups. (B) Een typisch voorbeeld van bellen (gemarkeerd door witte sterretjes) gevormd door cavitatie als gevolg van een te intense laserbehandeling. Dergelijke bubbels zijn niet beperkt tot een Z-vlak, soms zelfs over de volledige hoogte van de polster, waardoor naburige weefsels worden vervormd. De schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Data-analyse

1. Open time-lapse-series met de beeldanalysesoftware en stel de juiste pixelgrootte in.
2. Stel in de spotfunctie de objectgrootte in op 10 μm, omdat dit de gemiddelde kerngrootte is tijdens gastrulatie. Voer vervolgens de spotfunctie uit om de kernen te detecteren en te volgen.
   OPMERKING: De detectie kan enigszins worden verbeterd door rekening te houden met de onderste axiale resolutie, passend bij een 12 μm lange ellipsoïdale vorm langs de Z-as.
3. Gebruik filters om valse positieven te verwijderen. In de Tg(Gsc:GFP)- lijn zijn cellen van de embryonale as en sommige endodermale cellen groen gelabeld. Daarom maakt filteren op groene intensiteit een snelle selectie van deze cellen mogelijk (figuur 3A).
4. Stel de maximale afstand tussen opeenvolgende punten in op een waarde die compatibel is met de snelheid van de cellen.
   OPMERKING: Houd rekening met het tijdsinterval tussen twee frames. Polstercellen migreren met 2,8 ± 0,8 μm/min. Daarom verwijdert het toestaan van 4 μm maximale verplaatsing gedurende een tijdstap van 1 minuut de meeste artefactuele sporen.
5. Het toestaan van hiaten over een of twee tijdspunten zorgt voor langere continue tracks, maar kan trackingfouten veroorzaken. Als een kern op een eenmalig punt niet correct wordt gedetecteerd, overweeg dan om spotdetectie opnieuw uit te voeren met verschillende parameters/filters.
6. Controleer tracks visueel en corrigeer ze indien nodig.
7. Exporteer de resultaten als een .xlsx bestand. Verwerk het bestand met behulp van gepubliceerde ^{spreadsheetroutines24} (figuur 3B) en aangepaste routines op data-analysesoftware (beschikbaar op aanvraag).

Figuur 3: Isolatie van de voorste helft van de polster beïnvloedt de richting van de cel. (A) 3D reconstrueert een Tg(gsc:GFP) embryo dat Histone2B-mCherry tot expressie brengt (weergegeven in magenta), voor en na een laserablatie die de polster in het midden doorsnijdt. Kernen die tot de voorste helft van de polster behoren, zijn gemarkeerd met een magenta-stip en worden in de tijd voor en na ablatie gevolgd (zie Film S1). De schaalbalk is 50 μm. (B) Als maat voor migratiepersistentie, richtingsautocorrelatie van cellen die behoren tot het voorste deel van de polster voor en na ablatie. Cellen vertonen een continue beweging vóór ablatie, die drastisch afneemt na ablatie, wat wijst op verlies van collectief georiënteerde migratie. Richting auto-correlatie werd ook gemeten op cellen die de voorste helft van de polster van een niet-geableerd embryo vormden, als een controle. De grafiekenveloppen geven een standaardfout aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Om de polster in het midden te snijden, werd een Tg(gsc:GFP) embryo, geïnjecteerd met Histone2B-mCherry mRNA's gemonteerd in het 70% epiboly stadium, zoals beschreven in stap 4. De polster werd geïdentificeerd door GFP-expressie en het embryo werd zo gemonteerd dat het vlak van de polster loodrecht op de optische as staat (figuur 1B). Het kantelen van het embryo uit deze positie zal de procedure bemoeilijken. Het licht zal door meer weefsels moeten gaan om de ablatievlakken te berei...

Discussion

Hier beschrijven we een protocol dat niet-lineaire optica gebruikt om diepe en ruimtelijk goed gedefinieerde volumeablaties uit te voeren. De meest kritieke stap van het protocol is het vinden van behandelingsomstandigheden die voldoende energie leveren om ablaties mogelijk te maken, maar niet te veel energie, om overmatig vuil of cavitatie te voorkomen. De hoeveelheid geleverde energie op de doellocatie hangt voornamelijk af van: (1) het laseruitgangsvermogen, (2) de kwaliteit van de laseruitlijning, (3) de aard van het...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agarose	PanReac AppliChem	A8963,0500
Data analysis software : Matlab	Math Works
Electro-optic modulator (EOM)	ConOptics	350-80LA
Embryo Medium (EM) solution			Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).
Environmental chamber chamber	Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM driver	ConOptics	302RM
Fluorescence source	Lumencor	SOLA
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Glass capillaries	Harvard Apparatus	300085	Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm
Glass pipettes	Volac	D810	Tip should be fire polished
Green/ablation laser	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012)
Image analysis software: IMARIS	Bitplane
ImSpector software	Abberior Instruments Development Team
Injection mold	Adapative Science Tools	I-34
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-151
Micropipette puller	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140-122	10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml
Photomultiplier tube (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (Air injector)	World Precision Instrument	PV820
Red laser	Spectra Physics	OPO/Insight DeepSee
RNAse free water for injection	Sigma	W3500
Spreadsheet software: Excel	Microsoft
Stereomicroscope	Nikon	SMZ18
Tg(gsc:GFP) zebrafish line			Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
TriM Scope II microscope	La Vision Biotech