Diepe en ruimtelijk gecontroleerde volume-ablaties met behulp van een twee-fotonenmicroscoop in de zebravis Gastrula

Summary

Embryonale ontwikkeling vereist grootschalige coördinatie van celbewegingen. Twee-foton excitatie gemedieerde laserablatie maakt de ruimtelijk gecontroleerde 3-dimensionale ablatie van grote groepen diepe cellen mogelijk. Bovendien kan deze techniek de reactie van collectief migrerende cellen in vivo op verstoringen in hun mechanische omgeving onderzoeken.

Abstract

Morfogenese omvat veel celbewegingen om cellen in weefsels en organen te organiseren. Voor een goede ontwikkeling moeten al deze bewegingen nauw worden gecoördineerd, en accumulerend bewijs suggereert dat dit, althans gedeeltelijk, wordt bereikt door mechanische interacties. Het testen hiervan in het embryo vereist directe fysieke verstoringen. Laserablaties zijn een steeds vaker gebruikte optie die het mogelijk maakt om mechanische beperkingen te verlichten of twee celpopulaties fysiek van elkaar te isoleren. Veel ablaties worden echter uitgevoerd met een ultraviolette (UV) laser, die een beperkte axiale resolutie en weefselpenetratie biedt. Hier wordt een methode beschreven om diepe, significante en ruimtelijk goed gedefinieerde volumes af te breken met behulp van een microscoop met twee fotonen. Ablaties worden gedemonstreerd in een transgene zebravislijn die het groene fluorescerende eiwit in het axiale mesendoderm tot expressie brengt en wordt gebruikt om het axiale mesendoderm af te snijden zonder het bovenliggende ectoderm of de onderliggende dooiercel te beïnvloeden. Het celgedrag wordt gevolgd door live beeldvorming voor en na de ablatie. Het ablatieprotocol kan worden gebruikt in verschillende ontwikkelingsstadia, op elk celtype of weefsel, op schalen variërend van enkele micron tot meer dan honderd micron.

Introduction

Cel-cel interacties spelen een vitale rol in de ontwikkeling. Cellen geven signalen die hun directe buren, of cellen verder weg, kunnen waarnemen, waardoor hun lot en/of gedrag wordt beïnvloed. Veel van deze signalen zijn chemisch van aard. Bijvoorbeeld, in de goed gekarakteriseerde inductiegebeurtenissen produceert een celgroep diffuusibele moleculen die het lot van een andere celpopulatie ^{beïnvloeden1}. Andere signalen zijn echter mechanisch; cellen oefenen krachten en beperkingen uit op hun buren, die de buren waarnemen en waarop ze ^reageren2.

Een manier om het belang van deze cel-cel intera....

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Ethische Commissie N 59 en het Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche onder het dossiernummer APAFIS#15859-2018051710341011v3. Sommige van de onderstaande stappen zijn specifiek voor onze apparatuur en software, maar kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende apparatuur.

1. Injectie voorbereiding

1. Bereid 75 ml 1% agarose-oplossing in Embryo Medium (EM).
2. Plaats de spuitvorm in een petrischaaltje van 90 mm en giet ongeveer 50 ml agarose, genoeg om de mal te laten drijven. Laat de agarose stollen en verwijder de spuitvorm.
....

Results

Om de polster in het midden te snijden, werd een Tg(gsc:GFP) embryo, geïnjecteerd met Histone2B-mCherry mRNA's gemonteerd in het 70% epiboly stadium, zoals beschreven in stap 4. De polster werd geïdentificeerd door GFP-expressie en het embryo werd zo gemonteerd dat het vlak van de polster loodrecht op de optische as staat (figuur 1B). Het kantelen van het embryo uit deze positie zal de procedure bemoeilijken. Het licht zal door meer weefsels moeten gaan om de ablatievlakken te berei.......

Discussion

Hier beschrijven we een protocol dat niet-lineaire optica gebruikt om diepe en ruimtelijk goed gedefinieerde volumeablaties uit te voeren. De meest kritieke stap van het protocol is het vinden van behandelingsomstandigheden die voldoende energie leveren om ablaties mogelijk te maken, maar niet te veel energie, om overmatig vuil of cavitatie te voorkomen. De hoeveelheid geleverde energie op de doellocatie hangt voornamelijk af van: (1) het laseruitgangsvermogen, (2) de kwaliteit van de laseruitlijning, (3) de aard van het.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agarose	PanReac AppliChem	A8963,0500
Data analysis software : Matlab	Math Works
Electro-optic modulator (EOM)	ConOptics	350-80LA
Embryo Medium (EM) solution			Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).
Environmental chamber chamber	Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM driver	ConOptics	302RM
Fluorescence source	Lumencor	SOLA
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Glass capillaries	Harvard Apparatus	300085	Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm
Glass pipettes	Volac	D810	Tip should be fire polished
Green/ablation laser	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012)
Image analysis software: IMARIS	Bitplane
ImSpector software	Abberior Instruments Development Team
Injection mold	Adapative Science Tools	I-34
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-151
Micropipette puller	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140-122	10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml
Photomultiplier tube (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (Air injector)	World Precision Instrument	PV820
Red laser	Spectra Physics	OPO/Insight DeepSee
RNAse free water for injection	Sigma	W3500
Spreadsheet software: Excel	Microsoft
Stereomicroscope	Nikon	SMZ18
Tg(gsc:GFP) zebrafish line			Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
TriM Scope II microscope	La Vision Biotech