Methodenartikel

Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem

DOI:

10.3791/62818

⸱

19 augustus 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel met uiteenlopende toepassingen. Dit protocol demonstreert hoe licht-induceerbare genexpressie in zebravisembryo's kan worden bereikt met behulp van het blauw licht-responsieve TAEL / C120-systeem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induceerbare genexpressiesystemen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologische processen. Optogenetische expressiesystemen kunnen nauwkeurige controle bieden over de timing, locatie en amplitude van genexpressie met behulp van licht als het inducerende agens. In dit protocol wordt een optogenetisch expressiesysteem gebruikt om licht-induceerbare genexpressie te bereiken in zebravisembryo's. Dit systeem vertrouwt op een gemanipuleerde transcriptiefactor genaamd TAEL op basis van een natuurlijk voorkomende lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis. Wanneer het wordt verlicht met blauw licht, dimt TAEL, bindt het zich aan het verwante regulerende element C120 en activeert het transcriptie. Dit protocol maakt gebruik van transgene zebravisembryo's die de TAEL-transcriptiefactor tot expressie komen onder controle van de alomtegenwoordige ubb-promotor. Tegelijkertijd drijft het C120-regulerende element de expressie van een fluorescerend reporter-gen (GFP) aan. Met behulp van een eenvoudig LED-paneel om activerend blauw licht te leveren, kan de inductie van GFP-expressie eerst worden gedetecteerd na 30 minuten verlichting en bereikt een piek van meer dan 130-voudige inductie na 3 uur lichtbehandeling. Expressie-inductie kan worden beoordeeld door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is een veelzijdige en eenvoudig te gebruiken aanpak voor optogenetische genexpressie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induceerbare genexpressiesystemen helpen de hoeveelheid, timing en locatie van genexpressie te beheersen. Het bereiken van exacte ruimtelijke en temporele controle in meercellige organismen was echter een uitdaging. Temporele controle wordt meestal bereikt door toevoeging van verbindingen met kleine moleculen1 of activering van hitteschokpromotors2. Toch zijn beide benaderingen kwetsbaar voor problemen met timing, inductiesterkte en stressreacties buiten het doel. Ruimtelijke controle wordt voornamelijk bereikt door het gebruik van weefselspecifieke promotors3, maar deze aanpak vereist een geschikt promotor- of regulerend element, dat niet altijd beschikbaar is en niet bevorderlijk is voor inductie op subweefselniveau.

In tegenstelling tot dergelijke conventionele benaderingen hebben lichtgeactiveerde optogenetische transcriptionele activatoren het potentieel voor fijnere ruimtelijke en temporele controle van genexpressie4. Het blauw licht-responsieve TAEL/C120 systeem is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik in zebravis embryo's5,6. Dit systeem is gebaseerd op een endogene lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis7,8. Het TAEL/C120-systeem bestaat uit een transcriptionele activator genaamd TAEL die een Kal-TA4-transactivatiedomein, een blauw licht-responsief LOV-domein (light-oxygen-voltage sensing) en een helix-turn-helix (HTH) DNA-bindend domeinbevat 5. Wanneer ze worden verlicht, ondergaan de LOV-domeinen een conformatieverandering waardoor twee TAEL-moleculen kunnen dimmeriseren, binden aan een TAEL-responsieve C120-promotor en transcriptie van een downstream-gen van belang kunnen initiëren5,8. Het TAEL/C120-systeem vertoont een snelle en robuuste inductie met minimale toxiciteit en kan worden geactiveerd door verschillende lichtafgiftemodaliteiten. Onlangs zijn verbeteringen aan het TAEL/C120-systeem aangebracht door een nucleair lokalisatiesignaal toe te voegen aan TAEL (TAEL-N) en door het C120-regulerende element te koppelen aan een cFos basale promotor (C120F) (Figuur 1A). Deze aanpassingen verbeterden de inductieniveaus met meer dan 15-voudig6.

In dit protocol wordt een eenvoudig LED-paneel gebruikt om het TAEL/C120-systeem te activeren en de alomtegenwoordige expressie van een reporter-gen, GFP, te induceren. Expressie-inductie kan kwalitatief worden gemonitord door fluorescentie-intensiteit te observeren of kwantitatief door transcriptniveaus te meten met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Dit protocol demonstreert het TAEL/C120-systeem als een veelzijdig, gebruiksvriendelijk hulpmiddel dat een robuuste regulatie van genexpressie in vivomogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California Merced.

1. Zebraviskruising en embryoverzameling

  1. Onderhoud afzonderlijke transgene zebravislijnen die de TAEL-transcriptionele activator of het C120-gecontroleerde reporter-gen bevatten om onechte activering te minimaliseren.
  2. Kruis 6-8 volwassen zebravissen van elke lijn met behulp van standaardmethoden9 om dubbele transgene embryo's te produceren die zowel de TAEL- als de C120-componenten bevatten(figuur 1B).
    OPMERKING: Als alternatief kunnen beide componenten tijdelijk tot expressie worden gebracht door micro-injectie van mRNA of plasmide-DNA met behulp van standaardmethoden10.
  3. Verzamel embryo's in petrischalen met eiwater (60 μg / ml Instant Ocean zeezout opgelost in gedestilleerd water), met ongeveer 30 embryo's per aandoening die moeten worden getest.
  4. Plaats de schotels in een lichtdichte doos of dek af met aluminiumfolie om onbedoelde activering door omgevingslicht te minimaliseren (zie tabel 1).

2. Globale lichtinductie

  1. Gebruik een blauw licht (465 nm) LED-paneel om activerend blauw licht aan meerdere embryo's tegelijk te leveren.
  2. Plaats het LED-paneel ten opzichte van de petrischalen met embryo's zo dat de werkelijke lichtkracht die door de embryo's wordt ontvangen ongeveer 1,5 mW / cm2 is, gemeten door een lichtvermogens- en energiemeter (figuur 2A).
  3. Pulseer het licht met intervallen van 1 uur aan / 1 uur uit met behulp van een timerrelais als het langer dan 3 uur verlicht om het risico op fotoschade voor de TAEL transcriptionele activator5,8te verminderen.
    OPMERKING: De exacte duur van de verlichting moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor specifieke toepassingen. In dit protocol worden voorbeelden gegeven van verlichtingsduur van 30 minuten, 1 uur, 3 uur en 6 uur.
  4. Verwijder de deksels van petrischaaltjes om lichtverstrooiing door condensatie te minimaliseren.
  5. Plaats petrischaaltjes met controle-embryo's in een lichtdichte doos of dek af met aluminiumfolie voor donkere controles.

3. Kwantitatieve beoordeling van inductie door qRT-PCR

  1. Verwijder embryo's van verlichting na de gewenste activeringsduur.
  2. Extraheer totaal RNA uit 30-50 lichtgeactiveerde en 30-50 donkere embryo's met behulp van een RNA-isolatiekit volgens de instructies van de kit.
    1. Breng embryo's terug naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verwijder overtollig eiwater. Voeg lysisbuffer toe en homogeniseer de embryo's met een plastic stamper.
    2. Breng het lysaat over naar een door de kit meegeleverde kolom en ga verder met de instructies van de kit. Ga onmiddellijk verder met stap 3.3 of bewaar gezuiverd RNA bij -20 °C tot -80 °C.
  3. Gebruik 1 μg totaal RNA voor cDNA-synthese met behulp van een cDNA-synthesekit volgens de instructies van de kit.
    1. Neem een dunwandige 0,2 ml PCR-buis, voeg 1 μg RNA toe aan 4 μL 5x cDNA-reactiemastermix (met geoptimaliseerde buffer, oligo-dT en willekeurige primers en dNTPs), 1 μL 20x reverse transcriptase-oplossing en nucleasevrij water tot een totaal volume van 20 μL.
    2. Plaats de buis in een thermocycler die als volgt is geprogrammeerd: 22 °C gedurende 10 minuten, 42 °C gedurende 30 minuten, 85 °C gedurende 5 minuten en houd deze vervolgens op 4 °C. Ga onmiddellijk verder met stap 3.4 of bewaar cDNA bij -20 °C.
  4. Bereid qPCR-reacties voor die SYBR groene enzymmastermix, 5-voudig verdund cDNA (stap 3.3) en 325 nM van elke primer voor GFP bevatten.
    OPMERKING: Primers die in dit protocol als volgt worden gebruikt. GFP voorwaarts: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP omgekeerd: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a voorwaarts 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a omgekeerd: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. Voer qPCR-reacties uit in een real-time PCR-machine.
    OPMERKING: PCR-programma: initiële activering bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 95 °C, 30 s bij 60 °C en 1 min bij 72 °C.
  6. Voer een smeltcurveanalyse uit zodra de PCR is voltooid om de reactiespecifiekheid te bepalen. Voer drie technische replicaties uit voor elk monster.
  7. Bereken lichtgeactiveerde inductie als vouwverandering ten opzichte van embryo's die in het donker worden gehouden met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 11. Statistische significantie kan worden bepaald met een statistisch softwarepakket.

4. Kwalitatieve beoordeling van inductie door fluorescentiemicroscopie

  1. Verwijder de embryo's uit de verlichting na de gewenste activeringsduur.
  2. Immobiliseer embryo's voor beeldvorming in 3% methylcellulose met 0,01% tricaïne in glazen depressieglaasjes.
  3. Verkrijg fluorescentie- en brightfieldbeelden op een fluorescerende stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera met behulp van standaard GFP-filterinstellingen. Gebruik identieke instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen voor alle voorbeelden.
  4. Voeg brightfield- en fluorescentiebeelden na de acquisitie samen met beeldverwerkingssoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor deze demonstratie werd een C120-responsieve GFP-reporterlijn (Tg (C120F: GFP)ucm107) gekruistmet een transgene lijn die TAEL-N alomtegenwoordig uitdrukt van de ubiquitine b (ubb) promotor (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113)) om dubbele transgene embryo's te produceren die beide elementen bevatten. 24 uur na de bevruchting werden de embryo's blootgesteld aan het activeren van het blauwe licht, gepulseerd met een frequentie van 1 uur op / 1 uur uit. Inductie van GFP-expre...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het gebruik van het optogenetische TAEL/C120-systeem om blauw licht-induceerbare genexpressie te bereiken. Dit systeem bestaat uit een transcriptionele activator, TAEL, die dimeriseert bij verlichting met blauw licht en transcriptie activeert van een gen van belang stroomafwaarts van een C120-regulerend element. Geïnduceerde expressie van een GFP-reporter kan worden gedetecteerd na slechts 30 minuten blootstelling aan licht, wat suggereert dat deze aanpak relatief snelle en responsieve kinetiek be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werden geen belangenconflicten aangegeven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Stefan Materna en leden van de Woo- en Materna-laboratoria voor nuttige suggesties en opmerkingen over dit protocol. We bedanken Anna Reade, Kevin Gardner en Laura Motta-Mena voor waardevolle discussies en inzichten tijdens het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) en de University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) aan S.W.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioRender web-based science illustration toolBioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD digital cameraLumenara755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Excitation filter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmable digital timer switchAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mixQuantabio101414-286
Photoshop image procesing softwareAdobe
Prism graphing and statistics softwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light sourceExcelitas010-00326RDiscontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

Gerelateerde artikelen