Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem

Summary

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel met uiteenlopende toepassingen. Dit protocol demonstreert hoe licht-induceerbare genexpressie in zebravisembryo's kan worden bereikt met behulp van het blauw licht-responsieve TAEL / C120-systeem.

Abstract

Induceerbare genexpressiesystemen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologische processen. Optogenetische expressiesystemen kunnen nauwkeurige controle bieden over de timing, locatie en amplitude van genexpressie met behulp van licht als het inducerende agens. In dit protocol wordt een optogenetisch expressiesysteem gebruikt om licht-induceerbare genexpressie te bereiken in zebravisembryo's. Dit systeem vertrouwt op een gemanipuleerde transcriptiefactor genaamd TAEL op basis van een natuurlijk voorkomende lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis. Wanneer het wordt verlicht met blauw licht, dimt TAEL, bindt het zich aan het verwante regulerende element C120 en activeert het transcriptie. Dit protocol maakt gebruik van transgene zebravisembryo's die de TAEL-transcriptiefactor tot expressie komen onder controle van de alomtegenwoordige ubb-promotor. Tegelijkertijd drijft het C120-regulerende element de expressie van een fluorescerend reporter-gen (GFP) aan. Met behulp van een eenvoudig LED-paneel om activerend blauw licht te leveren, kan de inductie van GFP-expressie eerst worden gedetecteerd na 30 minuten verlichting en bereikt een piek van meer dan 130-voudige inductie na 3 uur lichtbehandeling. Expressie-inductie kan worden beoordeeld door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is een veelzijdige en eenvoudig te gebruiken aanpak voor optogenetische genexpressie.

Introduction

Induceerbare genexpressiesystemen helpen de hoeveelheid, timing en locatie van genexpressie te beheersen. Het bereiken van exacte ruimtelijke en temporele controle in meercellige organismen was echter een uitdaging. Temporele controle wordt meestal bereikt door toevoeging van verbindingen met kleine moleculen¹ of activering van hitteschokpromotors². Toch zijn beide benaderingen kwetsbaar voor problemen met timing, inductiesterkte en stressreacties buiten het doel. Ruimtelijke controle wordt voornamelijk bereikt door het gebruik van weefselspecifieke promotors³, maar deze aanpak vereist een geschik....

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California Merced.

1. Zebraviskruising en embryoverzameling

1. Onderhoud afzonderlijke transgene zebravislijnen die de TAEL-transcriptionele activator of het C120-gecontroleerde reporter-gen bevatten om onechte activering te minimaliseren.
2. Kruis 6-8 volwassen zebravissen van elke lijn met behulp van standaardmethoden⁹ om dubbele transgene embryo's te produceren die zowel de TAEL- als de C120-componenten bevatten(figuur 1B).
   OPMERKING: Als alte....

Results

Voor deze demonstratie werd een C120-responsieve GFP-reporterlijn (Tg (C120F: GFP)^ucm107) gekruistmet een transgene lijn die TAEL-N alomtegenwoordig uitdrukt van de ubiquitine b (ubb) promotor (Tg (ubb: TAEL-N)^ucm113)) om dubbele transgene embryo's te produceren die beide elementen bevatten. 24 uur na de bevruchting werden de embryo's blootgesteld aan het activeren van het blauwe licht, gepulseerd met een frequentie van 1 uur op / 1 uur uit. Inductie van GFP-expre.......

Discussion

Dit protocol beschrijft het gebruik van het optogenetische TAEL/C120-systeem om blauw licht-induceerbare genexpressie te bereiken. Dit systeem bestaat uit een transcriptionele activator, TAEL, die dimeriseert bij verlichting met blauw licht en transcriptie activeert van een gen van belang stroomafwaarts van een C120-regulerend element. Geïnduceerde expressie van een GFP-reporter kan worden gedetecteerd na slechts 30 minuten blootstelling aan licht, wat suggereert dat deze aanpak relatief snelle en responsieve kinetiek be.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender web-based science illustration tool	BioRender		https://biorender.com/
Color CCD digital camera	Lumenara	755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D
Excitation filter, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Healthcare	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Photoshop image procesing software	Adobe
Prism graphing and statistics software	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	A28137
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source	Excelitas	010-00326R	Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+