Synthetische antigeencontroles voor immunohistochemie

Samenvatting

Dit werk documenteert een eenvoudige methode om synthetische antigeencontroles voor immunohistochemie te creëren. De techniek is aanpasbaar aan een verscheidenheid aan antigenen in een breed scala aan concentraties. De monsters bieden een referentie waarmee de intra- en intertestprestaties en reproduceerbaarheid kunnen worden beoordeeld.

Samenvatting

Immunohistochemie (IHC) assays bieden waardevolle inzichten in eiwitexpressiepatronen, waarvan de betrouwbare interpretatie goed gekarakteriseerde positieve en negatieve controlemonsters vereist. Omdat geschikte weefsel- of cellijncontroles niet altijd beschikbaar zijn, kan een eenvoudige methode om synthetische IHC-controles te maken nuttig zijn. Een dergelijke methode wordt hier beschreven. Het is aanpasbaar aan verschillende antigeentypen, waaronder eiwitten, peptiden of oligonucleotiden, in een breed scala van concentraties. Dit protocol legt de stappen uit die nodig zijn om synthetische antigeencontroles te creëren, met als voorbeeld een peptide uit het menselijke erytroblastische oncogen B2 (ERBB2 / HER2) intracellulaire domein (ICD) herkend door een verscheidenheid aan diagnostisch relevante antilichamen. Seriële verdunningen van het HER2 ICD-peptide in boviene serumalbumine (BSA) oplossing worden gemengd met formaldehyde en gedurende 10 minuten verwarmd bij 85 °C om het peptide/BSA-mengsel te stollen en te kruisen. De resulterende gel kan worden verwerkt, gesneden en gekleurd als een weefsel, wat een reeks monsters van bekende antigeenconcentraties oplevert die een breed scala aan kleuringsintensiteiten omvatten.

Dit eenvoudige protocol is consistent met routinematige histologische laboratoriumprocedures. De methode vereist alleen dat de gebruiker een voldoende hoeveelheid van het gewenste antigeen heeft. Recombinante eiwitten, eiwitdomeinen of lineaire peptiden die coderen voor relevante epitopen kunnen lokaal of commercieel worden gesynthetiseerd. Laboratoria die interne antilichamen genereren, kunnen aliquots van het immuniserende antigeen reserveren als het synthetische controledoel. De mogelijkheid om goed gedefinieerde positieve controles te creëren over een breed scala aan concentraties stelt gebruikers in staat om de prestaties van intra- en interlaboratoriumtests te beoordelen, inzicht te krijgen in het dynamische bereik en de lineariteit van hun assays en de testomstandigheden te optimaliseren voor hun specifieke experimentele doelen.

Inleiding

Immunohistochemie (IHC) maakt de gevoelige en specifieke, ruimtelijk nauwkeurige detectie van doelantigenen in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties mogelijk. IHC-kleuringsresultaten kunnen echter worden beïnvloed door meerdere variabelen, waaronder warme en koude ischemietijd, weefselfixatie, weefselvoorbehandeling, antilichaamreactiviteit en -concentratie, testdetectiechemie en reactietijden¹. Dienovereenkomstig vereisen reproduceerbare prestaties en interpretatie van IHC-reacties een rigoureuze controle van deze variabelen en het gebruik van goed gekarakteriseerde positieve en negatieve controlemonsters. Vaak gebruikte controles omvatten paraffine-ingebedde weefsels of gekweekte cellijnen die bekend zijn van onafhankelijke analyses om het antigeen van belang uit te drukken, maar dergelijke monsters zijn niet altijd beschikbaar¹. Bovendien worden de expressieniveaus van de doelantigenen in weefsels en cellijncontroles over het algemeen alleen kwalitatief begrepen en kunnen ze variabel zijn. Controles die reproduceerbare, nauwkeurig bekende concentraties van doelantigeen bevatten, kunnen helpen bij de optimalisatie van IHC-reactieomstandigheden. Een algemene methode, aanpasbaar aan een verscheidenheid aan antigeentypen in een fysiologisch relevant bereik van concentraties om synthetische IHC-controlemonsters te creëren, is beschreven door de auteurs². Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor het maken en gebruiken van dit type standaard.

Passende controles zijn essentieel voor de geldige interpretatie van IHC-assays ^1,3,4. Weefsels, gekweekte cellen en peptide-gecoate substraten zijn gebruikt als IHC-controles volgens de specifieke behoeften van de onderzoekers. De voordelen en beperkingen die inherent zijn aan het gebruik van weefsels als IHC-controles zijn uitgebreid besproken ^1,4. Voor veel antilichamen kunnen geschikte controles worden gekozen uit geselecteerde normale weefsels die celpopulaties bevatten die het doelantigeen over een breed dynamisch bereik tot expressie brengen. Weefselcontroles zijn minder geschikt wanneer het doelantigeen niet goed wordt gekarakteriseerd met betrekking tot expressieplaats of abundantie, of wanneer potentieel kruisreagerende antigenen co-expressie zijn in dezelfde cellen of weefselplaatsen. In deze contexten kunnen blokken gekweekte cellijnen die het antigeen van belang uitdrukken nuttig zijn. Om verder bewijs van doelspecificiteit te leveren, kunnen cellijnen worden ontworpen om doelantigenen te over- of onderexpressie te geven. Een dergelijke benadering werd bijvoorbeeld onlangs gebruikt om een verscheidenheid aan anti-PD-L1-testen te evalueren met behulp van een weefselmicroarray van isogene cellijnen die een bereik van PD-L1-antigeen⁵ tot expressie brengen. Praktische beperkingen aan het routinematige gebruik van cellijnblokken zijn onder meer de kosten en tijd die nodig zijn om voldoende celaantallen te produceren en het feit dat de expressie van sommige antigenen mogelijk niet betrouwbaar consistent is, zelfs niet binnen klonale cellijnen⁶. Synthetische peptiden zijn een derde optie voor IHC-controles voor antilichamen die korte lineaire epitopen herkennen. Steven Bogen en collega's hebben uitgebreid gepubliceerd over het gebruik van peptiden gekoppeld aan het oppervlak van glazen dia's ^7,8 en glaskralen⁹. Een studie door deze groep toonde aan dat kwantitatieve analyse van op peptiden gebaseerde IHC-controles kleuringsprocesvariatie kon detecteren die werd gemist door kwalitatieve evaluatie van weefselcontroles die parallel¹⁰ werden geanalyseerd. Hoewel normen met behulp van op kralen gebaseerde antigenen op grote schaal toepasbaar kunnen zijn, zijn veel details eigendom van de auteurs, waardoor wijdverspreide acceptatie wordt beperkt.

Een andere benadering van IHC-normen omvat doelantigenen in kunstmatig gemaakte eiwitgels. Dit concept werd voor het eerst gedemonstreerd door Per Brandtzaeg in 1972 in een studie waarin normaal konijnenserum werd gepolymeriseerd met behulp van glutaaraldehyde¹¹. Kleine blokken van de resulterende gel werden vervolgens gedurende 1-4 weken gedrenkt in oplossingen die de immunoglobuline-antigenen van belang in verschillende concentraties bevatten. Na alcoholfixatie en inbedding van paraffine bleken delen van de resulterende controles te vlekken met intensiteiten die overeenkomen met de logaritme van de antigeenoplossingen waarin ze waren gedrenkt. Later bereidden onderzoekers glutaaraldehydeconjugaten van specifieke aminozuren in verdunde BSA- of hersenhomogenaatoplossingen als positieve controles in immuun-elektronenmicroscopiestudies ^12,13. Meer recent werk onderzocht het gebruik van gels gemaakt van formaldehyde-vaste eiwitoplossingen als surrogaten voor FFPE-weefsel in massaspectrometrie-analyse¹⁴. Een ander recent werk onderzocht de structuur en eigenschappen van gels gevormd door het verwarmen van menselijke of runderserumalbumine-oplossingen in verschillende concentraties en pH¹⁵. Deze auteurs ontdekten dat serumalbumine drie soorten gels vormt die verschillen in mechanische elasticiteit, behoud van secundaire structuren en vetzuurbindend vermogen, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Samen tonen deze papers de algemene haalbaarheid aan van de hier gehanteerde aanpak. Eiwitoplossingen met een gedefinieerde samenstelling creëren weefselachtige gels die verder kunnen worden verwerkt, gesneden en gekleurd met behulp van routinematige histologische methoden.

Dit protocol beschrijft de vorming van een synthetische IHC-controle gemaakt van runderserumalbumine (BSA) gepolymeriseerd met warmte en formaldehyde. De gels kunnen een breed scala aan antigenen bevatten, waaronder eiwitten over de volledige lengte, eiwitdomeinen en lineaire peptiden, evenals niet-eiwitantigenen, waaronder oligonucleotiden². Deze demonstratie gebruikt een voorbeeld van antigeen een lineair peptide dat codeert voor de C-terminale 16 aminozuren van het menselijke ERBB2 (HER2/neu) eiwit TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (zie Materiaaltabel). Deze sequentie omvat de epitopen die worden herkend door drie in de handel verkrijgbare, diagnostisch relevante antilichamen, waaronder het Herceptest polyklonale reagens (ENPEYLGLDVP) en de monoklonale antilichamen CB11 (AENPEYL) en 4B5 (TAENPEYLGL) (zie Materiaaltabel)¹⁶.

De hier gedemonstreerde methode maakt gebruik van direct beschikbare reagentia met behulp van processen en technieken die bekend zijn bij elk praktiserend histologisch laboratorium. De belangrijkste beperking is de noodzaak om de doelantigenen te identificeren en te kopen, wat in veel gevallen tegen relatief bescheiden kosten kan worden bereikt. Omdat deze synthetische regelaars van volledig gedefinieerde samenstelling zijn en met eenvoudige methoden zijn gemaakt, kunnen ze in veel laboratoria worden geïmplementeerd met reproduceerbare resultaten. Het gebruik ervan kan de objectieve, kwantificeerbare evaluatie van IHC-kleuringsresultaten vergemakkelijken en een grotere intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid mogelijk maken.

Protocol

1. Bereiding van voorraadoplossing en gereedschappen

1. Bereid 20 ml van een 25% w/v BSA-oplossing door 5 g BSA-poeder in 14 ml PBS, pH 7,2 in een conische buis van 50 ml te mengen totdat het gelijkmatig is gedispergeerd. Vortex indien nodig om het BSA-poeder te dispergeren.
   1. Houd de oplossing een nacht op 4 °C om volledige oplossing mogelijk te maken. Pas het uiteindelijke volume aan op 20 ml met PBS om een voorraadoplossing van 25% w/v te maken.
2. Bereid 20 ml van een 31,3% w/v BSA-oplossing door 6,26 g BSA-poeder te mengen in 13 ml PBS, pH 7,2 in een conische buis van 50 ml tot gelijkmatig gedispergeerd. Houd de oplossing een nacht op 4 °C om volledige oplossing mogelijk te maken. Pas het uiteindelijke volume aan op 20 ml met PBS om een voorraadoplossing van 31,3% w/v te maken.
3. Verwarm een warmteblok voor op 85 °C.
   OPMERKING: Het onderstaande protocol creëert peptide/ BSA-gels met volumes van 1,26-1,4 ml gevormd in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Om kleinere volumes te gebruiken, bijvoorbeeld wanneer de antigeenvoorraden beperkt zijn, bereidt u de gels in PCR-buizen voor en gebruikt u een thermocycler ingesteld op 85 °C als warmteblok.
4. Test of het BSA/formaldehydemengsel zoals verwacht een gel vormt door 700 μL 25% BSA-oplossing te mengen met 700 μL 37% formaldehyde. Meng goed door 5-10 s 5 keer op en neer te pipetteren. Vermijd het creëren van luchtbellen.
   LET OP: Geconcentreerd formaldehyde is giftig; gebruik met de juiste veiligheidsmaatregelen.
5. Plaats onmiddellijk na het mengen van de BSA- en formaldehyde-oplossingen de gesloten microcentrifugebuis gedurende 10 minuten in een warmteblok bij 85 °C. Haal de buis uit het warmteblok en laat deze afkoelen. Bevestig dat de gel zich heeft gevormd zoals verwacht.

2. Bereiding en verdunning van peptiden

1. Verkrijg 5-20 mg gelyofiliseerd peptide van de gewenste sequentie.
   OPMERKING: De C-terminal 16 aminozuren van het menselijke ERBB2 intracellulaire domein herkend door 4B5 is TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
   1. Voeg 4 aminozuren toe aan de N-terminus, acetyl-YGSG en C-terminus, GSGC-amide om cross-linking van het peptide naar BSA te vergemakkelijken en afstand te bieden tussen het BSA-molecuul en het peptide-epitoop.
      OPMERKING: De volledige sequentie is: acetyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide.
   2. Gebruik indien gewenst andere N- en C-terminale aminozuursequenties om het kernpeptide-epitoop uit te breiden.
      OPMERKING: De impact van verschillende sequenties varieert met verschillende combinaties van antilichamen en epitoop. De toevoeging van het C-terminale peptide vermindert de binding van sommige antilichamen aan C-terminale epitopen. Laat in dergelijke gevallen deze volgorde achterwege.
   3. Bevestig dat peptiden uit commerciële bronnen worden geleverd met >95% zuiverheid, waarvan de samenstelling wordt bevestigd door HPLC en massaspectrometrie-analyse.
2. Bereken de benodigde volumes voor de 5x (1,25 E-2 M) peptide stock oplossingen. Onder verwijzing naar tabel 1, kolommen C-E, voert u waarden in voor het molecuulgewicht van het antigeen (g/mol), het percentage antigeenzuiverheid (0-100) en de antigeenmassa (mg).
   OPMERKING: Het volume oplosmiddel (in μL) om het monster te resuspenderen om een stamoplossing van 1,25 E-2 M te bereiken, is 800 x antigeenmoleculaire gewicht x procent antigeenzuiverheid / antigeenmassa.
   1. Bereid acht microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor en label deze duidelijk.
      OPMERKING: De buizen bevatten 5x peptidevoorraad in een oplosmiddel, 1x peptidevoorraad in een oplosmiddel, vijf 10x seriële verdunningen van 2,5 E-4 M tot 2,5 E-8 M peptide / BSA / formaldehydegel en een negatieve controlegel met BSA / formaldehyde zonder toegevoegd antigeen. Alle gelmonsters zien er identiek uit. Wanneer u meerdere sets peptideverdunningen tegelijk bereidt, moet u ervoor zorgen dat u alle buizen en verwerkingscassettes correct labelt en identificeert. Gebruik waar mogelijk kleurgecodeerde microcentrifugebuizen en verwerkingscassettes om verkeerde identificatie te minimaliseren.
3. Bereid een 5x peptide stock oplossing op 1,25 E-2 M door de volledige massa van gelyofiliseerd peptide (20 mg voor de ERBB2 peptiden) te resuspenderen in 60 μL van het juiste oplosmiddel.
   OPMERKING: In dit voorbeeld is dimethylformamide (DMF) rechtstreeks aan de container van de leverancier toegevoegd.
   1. Inspecteer de oplossing om er zeker van te zijn dat het peptide volledig is opgelost. Voeg indien nodig extra oplosmiddel toe en/of soniceer het monster totdat het peptide volledig is opgelost, waarbij u ervoor moet zorgen dat het in tabel 1 berekende volume voor de 5x peptidevoorraad niet wordt overschreden.
      LET OP: DMF is giftig; gebruik met de juiste voorzorgsmaatregelen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de aminozuursequentie en de bijbehorende hydrofobiciteit en lading, kunnen peptiden oplosbaar zijn in DMF, dimethylsulfoxide (DMSO), zuiver water of verdunde oplossingen van azijnzuur, mierenzuur of ammoniumbicarbonaat. Peptidekenmerken kunnen worden berekend met behulp van een verscheidenheid aan online tools¹⁷. Sommige peptideverkopers kunnen oplosmiddelen voorstellen die geschikt zijn voor specifieke sequenties.
   2. Voeg zo nodig oplosmiddel toe om het volume van de 5x peptidevoorraad op het uiteindelijke volume te brengen dat in tabel 1 is berekend. Vortex voor 5 s en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 5000 x g gedurende 5 s. Peptide stock oplossingen kunnen worden bewaard bij -80 °C.
4. Onder verwijzing naar tabel 2, kolom C, bereidt u 150 μL 1x peptide stockoplossing (2,5 E-3 M) door 30 μL van de 5x peptidevoorraad te verdunnen tot 120 μL oplosmiddel (DMF dit voorbeeld). Vortex voor 5 s en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 5000 x g gedurende 5 s.
5. Onder verwijzing naar tabel 2, kolom D, bereidt u 700 μL 5 E-4 M peptide/BSA-oplossing (verdunning 1) door 140 μL 1x peptidevoorraad te verdunnen tot 560 μL van 31,3% BSA/PBS, pH 7,2. Vortex voor 5 s en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 5000 x g gedurende 5 s.
   OPMERKING: De uiteindelijke BSA-concentratie van deze oplossing is 25% (w/v).
6. Verwijzend naar tabel 2, kolommen E-H, bereidt u vier opeenvolgende 10x seriële verdunningen van de 5 E-4 M peptide/BSA-voorraad door 70 μL peptide/BSA-oplossing toe te voegen aan 630 μL van 25% BSA/PBS, pH 7,2. Vortex voor 5 s en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 5000 x g gedurende 5 s.
   OPMERKING: Na deze stap zijn er vijf 10-voudige seriële verdunningen van peptide (5 E-4 M tot 5 E-8 M) in 25% BSA / PBS, pH 7,2. De eerste vier monsters bevatten 630 μL. Het laatste monster bevat 700 μL.
7. Onder verwijzing naar tabel 2, kolom I, bereidt u een BSA-monster met negatieve controle op 700 μL van 25% BSA/PBS, pH 7.2 (figuur 1A).

3. BSA-peptide gels voorbereiden

1. Controleer of het warmteblok of de thermocycler stabiel is bij 85 °C.
2. Zie tabel 3, kolommen B-E. Werk één monster per keer en voeg aan het eerste 25% BSA / peptidemonster (verdunning 1) 630 μL van 37% formaldehyde toe. Meng goed door 5-10 s 5 keer op en neer te pipetteren. Vermijd het creëren van luchtbellen.
   LET OP: Geconcentreerd formaldehyde is giftig; gebruik met de juiste veiligheidsmaatregelen.
   1. Plaats na het mengen van de peptide/BSA- en formaldehyde-oplossingen de gesloten microcentrifugebuis gedurende 10 minuten in een warmteblok bij 85 °C.
      OPMERKING: Meng de BSA-peptide-oplossing en formaldehyde grondig, maar besteed niet meer dan 10 s pipetteer het mengsel voordat u het monster op warmte plaatst. Omdat formaldehyde cross-linking onmiddellijk begint, kan de gel zich anders vormen als de procedure voor verschillende monsters wordt gevarieerd. De uiteindelijke BSA-concentratie in deze gels is 12,5% (w/v). Uiteindelijke BSA-concentraties van minder dan 10% kunnen gels opleveren die niet stollen; uiteindelijke BSA-concentraties van meer dan 16% kunnen gels produceren die brozer en moeilijker te doorsnijden zijn na verwerking.
   2. Herhaal stap 3.2 en 3.2.1 voor elk van de verdunningen 2-4.
   3. Herhaal stap 3.2 en 3.2.1 voor verdunning 5, maar voeg 700 μL 37% formaldehyde toe, een volume gelijk aan de 700 μL BSA-antigeenoplossing.
   4. Zie tabel 3 kolom G; herhaal stap 3.2 en 3.2.1 voor het negatieve controlemonster en voeg 700 μL 37% formaldehyde toe, een volume gelijk aan de 700 μL BSA-oplossing met negatieve controle.
3. Verwijder de buizen na 10-12 min uit het warmteblok. De opwarmtijd moet voor elk monster zo consistent mogelijk zijn. Laat de gels 5-10 minuten afkoelen op de benchtop (figuur 1B).
4. Verwijder met behulp van een schone, flexibele wegwerplaboratoriumspatel het gelmonster in één stuk uit de microcentrifugebuis en plaats het in een verzegelde container met ten minste 15 ml neutraal gebufferd formaline (NBF), met behulp van een afzonderlijke container NBF voor elk monster.
   1. U kunt ook de onderkant van de microcentrifugebuis afsnijden met een nieuw scheermesje met één rand en de gel van de bodem naar buiten duwen met lucht of een geschikte sonde (figuur 1C-G).
      OPMERKING: De gestolde formaldehyde/BSA-gels kunnen tot 24 uur bij kamertemperatuur in de microcentrifugebuizen blijven. Als u de gels langer dan 24 uur in de microcentrifugebuis laat zitten, kunnen ze broos worden en moeilijker te verwerken en door te snijden.

4. BSA-gels bijsnijden, verwerken en insluiten

1. Snijd de gelkegel in cilindrische schijven van ongeveer 5 mm dik met een schoon scheermes met één rand (figuur 1H, I). Wikkel de schijven in een biopsiewikkel, plaats één grotere gelschijf in één cassette (te gebruiken in de pilotstudie in stap 5) en de resterende gelschijven samen in een tweede cassette (figuur 2A, E) voor gebruik in weefselmicroarray (TMA) constructie in stap 6. Plaats de ingepakte gelschijven in duidelijk gelabelde weefselverwerkingscassettes.
   1. Plaats de cassettegels in ten minste 15 ml NBF per gelmonster voordat u ze verwerkt, met behulp van een afzonderlijke container NBF voor elk monster. Gels kunnen 6-48 uur in 10% NBF blijven.
2. Verwerk de gels in een geautomatiseerde histologie weefselprocessor, volgens een groot weefselschema met druk en vacuüm. Elke stap duurt 1 uur: 10% NBF, 70% ethanol, 95% ethanol (herhaal twee keer), 100% ethanol (herhaal twee keer), xylenen (herhaal drie keer), paraffine bij 60 °C (herhaal drie keer).
   OPMERKING: Voor onderzoekers die ervoor kiezen om monsters handmatig te verwerken, volgt u dezelfde volgorde van reagentia en tijden.
3. Wanneer de monsterverwerking is voltooid, verwijdert u de cassettes uit de weefselprocessor en verplaatst u ze naar het paraffine-insluitcentrum.
4. Pak gels uit de biopsiewikkel en sluit de gels in paraffine. Voor elk monster plaatst u één schijf gel in een kleine mal van 15 mm x 15 mm (figuur 2B-D) en de resterende gelschijven samen in een tweede grotere mal (figuur 2F-H). Het eerste blok met één monster zal worden gebruikt om de peptidegel te testen in een pilotstudie. Het tweede blok kan worden gebruikt voor TMA-constructie.

5. Pilootevaluatie van de peptideverdunningsreeks

1. Plan voor elke peptideverdunningsreeks twee glazen dia's met in totaal 6 afzonderlijke secties: één sectie van elk van de vijf verdunningsreeksmonsters, plus één sectie van het BSA-only negatieve controlemonster.
   1. Knip op de eerste glasplaat een 4 μm dik gedeelte uit elk van de kleinere blokken met één gelschijf met de drie hoogste peptideconcentraties (2,5 E-4 M tot 2,5 E-6 M).
   2. Snijd op een tweede dia een 4 μm dik gedeelte uit elk blok met de twee laagste peptideconcentraties (2,5 E-7 M en 2,5 E-8 M) en één sectie uit het BSA-only controleblok. Noteer de volgorde van de monsters op de dia's.
      OPMERKING: Verwacht dat de in paraffine ingebedde gels soepel snijden en uniforme secties produceren zonder fragmentatie, scheuren of kletsende artefacten. Als bepaalde paraffine-ingebedde gelmonsters moeilijk te doorsnijden zijn, week het blokvlak dan kort in ijskoud gedestilleerd water voordat u het snijdt. Experimenteer indien nodig met verschillende weektijden of met verschillende oplossingen (bijv. Ammoniakwater).
   3. Droog na het snijden de dia's bij kamertemperatuur (ongeveer 23 °C) gedurende 24 uur, gevolgd door 60 °C gedurende 30 minuten.
2. Kleur de twee dia's die voor elk peptide zijn voorbereid met het gewenste antilichaam volgens standaard IHC-protocollen.
   OPMERKING: De primaire antilichaam-on-slide concentratie gebruikt voor konijn monoklonale 4B5 in deze demonstratie was 1,5 ug / ml.
   1. Verwacht een relatief uniform signaal te zien binnen elke gelsectie, waarbij de verschillende gelmonsters een bereik van signaalintensiteit vertonen dat overeenkomt met de peptideverdunningen.
3. Als de resultaten voor de pilotstudie bevredigend zijn, construeer dan een TMA uit de geldonorblokken die verschillende concentraties peptide-antigeen bevatten, zoals beschreven in de volgende stappen van het protocol.

6. BSA gel TMA constructie

1. Construeer een weefselmicroarray met dubbele kernen met een diameter van 1 mm uit donorblokken die alleen BSA-gel bevatten en BSA-gels die alle vijf verdunningen van ERBB2-peptide bevatten.
   OPMERKING: Neem indien gewenst BSA-gels op die dezelfde vijf verdunningen van een niet-doelpeptide bevatten als aanvullende negatieve controles. Neem indien gewenst kernen van representatieve ERBB2-tot expressie brengende cellijnen op als positieve controles.
2. Snijd 4 μm dikke delen van de TMA en bevlek met 1,5 ug/ml anti-ERBB2/HER2/neu konijn monoklonaal 4B5 (zie Materiaaltabel) volgens laboratoriumstandaardprotocollen.
3. Beoordeel de resulterende vlekintensiteit kwalitatief door inspectie of kwantitatief door digitale beeldscanning en -analyse (figuur 3A, B).
   OPMERKING: Aangezien digitale beeldanalyse niet de focus van dit protocol is, worden deze stappen overgelaten aan de lezer om uit te voeren volgens zijn voorkeur.

Resultaten

Peptiden moeten volledig oplossen in een geschikt oplosmiddel bij kamertemperatuur om een optisch heldere oplossing te vormen. Als er na 30-60 minuten nog steeds zichtbaar deeltjesmateriaal aanwezig is, kan het nuttig zijn om extra volumes van het oorspronkelijke oplosmiddel of een alternatief oplosmiddel toe te voegen dat het beoogde volume van de in tabel 1 berekende 5x-peptidevoorraadoplossing niet overschrijdt. Evenzo moet de gecombineerde peptide/BSA-oplossing doorschijnend blijven (

Discussie

Met deze methode kan de gebruiker uniforme monsters maken van bekende samenstelling en antigeenconcentratie als normen in IHC-reacties, met behulp van materialen en technieken die bekend zijn bij de meeste histologische laboratoria. De meest cruciale stap is het identificeren van het epitoop waaraan het antilichaam van belang bindt. Dit protocol beschrijft het gebruik van een lineair peptide-antigeen van de ERBB2/HER2 ICD. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om BSA-gels te vormen die oligonucleotiden, fluorescerende l...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Gebruikers moeten contact opnemen met peptideleveranciers voor details over massa, zuiverheid en kosten.
	Anaspec Peptide		Gebruikers moeten contact opnemen met peptideleveranciers voor details over massa, zuiverheid en kosten.
	CPC Scientific		Gebruikers moeten contact opnemen met peptideleveranciers voor details over massa, zuiverheid en kosten.
	New England Peptide		Gebruikers moeten contact opnemen met peptideleveranciers voor details over massa, zuiverheid en kosten.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088