Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tuberculose (tbc), was tot de komst van COVID-19 wereldwijd de belangrijkste infectieziektemoordenaar. Mtb is geëvolueerd om te blijven bestaan in zijn intracellulaire omgeving, gastheerafweer te ontwijken en heeft resistentie ontwikkeld tegen veel anti-tuberculaire geneesmiddelen. Een benadering voor het oplossen van resistentie is het identificeren van bestaande goedgekeurde geneesmiddelen die de immuunrespons van de gastheer op Mtb zullen stimuleren. Deze geneesmiddelen kunnen vervolgens worden hergebruikt als aanvullende gastheergerichte therapieën (HDT) om de behandelingstijd te verkorten en antibioticaresistentie te helpen overwinnen.
Kwantificering van intracellulaire Mtb-groei in macrofagen is een cruciaal aspect van het beoordelen van potentiële HDT. De gouden standaard voor het meten van Mtb-groei is het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op agarplaten. Dit is een langzame, arbeidsintensieve test die zich niet leent voor snelle screening van geneesmiddelen. In dit protocol is een geautomatiseerd, op bouillon gebaseerd kweeksysteem, dat vaker wordt gebruikt om Mtb in klinische monsters te detecteren, aangepast voor preklinische screening van gastheergerichte therapieën. De capaciteit van het vloeistofkweektestsysteem om intracellulaire Mtb-groei te onderzoeken in macrofagen behandeld met HDT werd geëvalueerd. De HDT's die werden getest op hun vermogen om mtb-groei te remmen, waren all-trans retinoïnezuur (AtRA), zowel in oplossing als ingekapseld in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microdeeltjes en de combinatie van interferon-gamma en linezolid. De voordelen van deze geautomatiseerde op vloeistofcultuur gebaseerde techniek ten opzichte van de CFU-methode zijn eenvoud van installatie, minder arbeidsintensieve voorbereiding en snellere tijd tot resultaten (5-12 dagen in vergelijking met 21 dagen of meer voor agarplaten).
Inleiding
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tbc, was in 2019 wereldwijd de belangrijkste infectieziektedoder1. Om de afweer van de gastheer te ontwijken, ondermijnt Mtb de mycobactericide activiteit van aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen (DC's), waardoor het intracellulair kan blijven bestaan en2 kan repliceren. Het ontbreken van een effectief vaccin om volwassen long-tbc te voorkomen en de toenemende opkomst van resistente stammen benadrukken de dringende behoefte aan nieuwe therapieën.
Adjuvante gastheergerichte therapieën (HDT) kunnen de behand....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd met behulp van de verzwakte H37Ra-stam mtb, die kan worden behandeld in een laboratorium met containmentniveau 2. Alle manipulaties van levende mycobacteriën werden uitgevoerd in klasse II biologische veiligheidskast (BSC). Experimentele procedures werden ontworpen om de generatie van aerosolen te minimaliseren. Eukaryote celkweek (THP-1 cellen) werd ook uitgevoerd in een klasse II BSC. Het laboratorium voerde een risicobeoordeling uit en zorgde ervoor dat alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale biologische veiligheidsvoorschriften. De menselijke mono....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het geautomatiseerde vloeistofkweekinstrument dat in deze studie wordt gebruikt, bewaakt elke 10 minuten de CO2-niveaus . Een kleurverandering in de sensor aan de onderkant van de instrumentfles wordt colorimetrisch gemeten en uitgedrukt als reflectie-eenheden. De instrumentsoftware past vervolgens detectiealgoritmen toe om de tijd tot positiviteit (TTP) te berekenen, d.w.z. het aantal dagen vanaf inenting totdat culturen als positief worden gemarkeerd (figuur 1A). Een omgekeerde .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De auteurs hebben de in dit protocol beschreven vloeistofkweekmethode gebruikt om de Mtb-groei te volgen in van monocyten afgeleide macrofagen en alveolaire macrofagen en THP-1-cellen gedifferentieerd met PMA 11,16,17. Deze techniek kan ook worden aangepast voor gebruik met niet-adherente cellen12. Meer recent werd het instrument ook gebruikt in preklinische studies om geïnhaleerd all-trans retinoïnezuur .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), de Health Research Board in Ierland [HRA-POR/2012/4 en HRA-POR-2015-1145] en Royal City of Dublin Hospital Trust.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detectie en beeldvorming |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, steriele | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infectie van macropahgen |
| 5 mL spuit, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infectie van macropahgen/CFU |
| 50 mL buis, steriele | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infectie van macropahgen |
| all-trans-Retinoic Zuur (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Gastgerichte therapiekandidaat |
| BacT/ALERT 3D Microbiologisch detectiesysteem | Biomerieux (Hampshire, UK) | 247001 | Bouillongebaseerd colormetrisch detectiesysteem |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP voedingssupplement | Biomerieux (Hampshire, UK) | 414997 | Bouillongebaseerde colormetrische detectietest |
| BACT/ALERT MP kweekflesjes | Biomerieux (Hampshire, UK) | 419744 | Bouillongebaseerde colormetrische detectietest |
| BD BBL Middlebrook ADC Verrijking, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| BD BBL Middlebrook OADC Verrijking, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Kolonievormende eenheden |
| Celschraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Oogst van lmacrofaaglysaten |
| Corning Spuitfilter, 0,2 µm | Corning Incorporated, Duitsland | 431219 | Sterilisatie van lyseringsbuffer |
| Dekglas (borosilicaat), 24 x 50 mm, #1.5 dikte | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, van microbiële | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Kolonievormende eenheden |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade montagemedium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infectie van macropahgen |
| Fetaal bovien serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrofaagcelcultuur |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Kolonievormende eenheden |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Kernkleurstof |
| IFNγ, recombinant humaan | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Gastgerichte therapiekandidaat |
| Labtek 2-well kamerslide, steriele, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infectie van macropahgen |
| L-Asparagine, anhydrisch | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Kolonievormende eenheden |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibioticum |
| Microlance Hypodermische Naald 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infectie van macropahgen/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Basis | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Kolonievormende eenheden |
| Middlebrook 7H9 Broth Basis | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| Gemodificeerde Auramine O Kleur- en Ontkleurder | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB-kleuring |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infectie van macropahgen |
| Petrischalen, 92 x 16mm (20/zak) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Kolonievormende eenheden |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrofaagcelcultuur |
| Polysorbaat 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrofaagcelcultuur |
| Steriele Celverspreider, L-vormig | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Kolonievormende eenheden |
| T25 TC fles, hoekige hals, filterdop, steriele, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| THP-1 cellijn | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrofaagcelcultuur |
Referenties
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , Geneva. (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
