Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tuberculose (tbc), was tot de komst van COVID-19 wereldwijd de belangrijkste infectieziektemoordenaar. Mtb is geëvolueerd om te blijven bestaan in zijn intracellulaire omgeving, gastheerafweer te ontwijken en heeft resistentie ontwikkeld tegen veel anti-tuberculaire geneesmiddelen. Een benadering voor het oplossen van resistentie is het identificeren van bestaande goedgekeurde geneesmiddelen die de immuunrespons van de gastheer op Mtb zullen stimuleren. Deze geneesmiddelen kunnen vervolgens worden hergebruikt als aanvullende gastheergerichte therapieën (HDT) om de behandelingstijd te verkorten en antibioticaresistentie te helpen overwinnen.
Kwantificering van intracellulaire Mtb-groei in macrofagen is een cruciaal aspect van het beoordelen van potentiële HDT. De gouden standaard voor het meten van Mtb-groei is het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op agarplaten. Dit is een langzame, arbeidsintensieve test die zich niet leent voor snelle screening van geneesmiddelen. In dit protocol is een geautomatiseerd, op bouillon gebaseerd kweeksysteem, dat vaker wordt gebruikt om Mtb in klinische monsters te detecteren, aangepast voor preklinische screening van gastheergerichte therapieën. De capaciteit van het vloeistofkweektestsysteem om intracellulaire Mtb-groei te onderzoeken in macrofagen behandeld met HDT werd geëvalueerd. De HDT's die werden getest op hun vermogen om mtb-groei te remmen, waren all-trans retinoïnezuur (AtRA), zowel in oplossing als ingekapseld in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microdeeltjes en de combinatie van interferon-gamma en linezolid. De voordelen van deze geautomatiseerde op vloeistofcultuur gebaseerde techniek ten opzichte van de CFU-methode zijn eenvoud van installatie, minder arbeidsintensieve voorbereiding en snellere tijd tot resultaten (5-12 dagen in vergelijking met 21 dagen of meer voor agarplaten).
Inleiding
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tbc, was in 2019 wereldwijd de belangrijkste infectieziektedoder1. Om de afweer van de gastheer te ontwijken, ondermijnt Mtb de mycobactericide activiteit van aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen (DC's), waardoor het intracellulair kan blijven bestaan en2 kan repliceren. Het ontbreken van een effectief vaccin om volwassen long-tbc te voorkomen en de toenemende opkomst van resistente stammen benadrukken de dringende behoefte aan nieuwe therapieën.
Adjuvante gastheergerichte therapieën (HDT) kunnen de behandelingstijd verkorten en helpen weerstand te overwinnen3. Preklinische beoordeling van HDT-kandidaten in vitro om mycobactericide activiteit binnen macrofagen te bepalen, is vaak afhankelijk van de kwantificering van Mtb-groei door kolonievormende eenheden (CFU) op vaste agarplaten. Dit is een langzame, arbeidsintensieve test die zich niet leent voor snelle screening van geneesmiddelen. In de handel verkrijgbare geautomatiseerde, op bouillon gebaseerde microbiële detectiesystemen worden vaker gebruikt in klinische microbiologische laboratoria voor detectie en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen van Mtb en andere mycobacteriële soorten in klinische monsters4. Deze instrumenten meten de groei indirect op basis van de bacteriële metabole activiteit die leidt tot fysieke veranderingen in de kweekmedia (verandering in CO2- of O2-niveaus of druk) die in de loop van de tijd worden gevolgd5. De uitlezing is time-to-positivity (TPP), waarvan eerder is aangetoond dat het correleert met Mtb CFU in sputummonsters van tbc-patiënten als reactie op behandeling 6,7 en in lysaten van geïnfecteerde muizenlong en milt8. Daarnaast zijn vloeistofkweekdetectiesystemen gebruikt om het effect van conventionele pathogeengerichte therapieën op de groei van mycobacteriën in axenische cultuur en gekweekte macrofagen te meten 9,10. Het instrument is ook gebruikt om het aangeboren vermogen van dendritische cellen en van alveolaire macrofagen te onderzoeken om de intracellulaire groei van Mtb 11,12 te beheersen. Dit experimentele protocol toont aan dat een vloeistofkweekdiagnostisch systeem kan worden aangepast om preklinische screening van HDT op tbc in gekweekte macrofagen uit te voeren. In vergelijking met CFU-inventarisatie is het belangrijkste voordeel van deze techniek dat het de experimentele arbeid en tijd die nodig is om intracellulaire mycobacteriële groei / overleving te kwantificeren aanzienlijk vermindert. Deze techniek is gebaseerd op toegang tot een geautomatiseerd kweekinstrument dat kan worden gebruikt om de intracellulaire mycobacteriële overleving te beoordelen in immuuncellen die worden behandeld met een breed scala aan farmacologische reagentia die gericht zijn op cellulaire functies om de immuniteit van de gastheer te vergroten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd met behulp van de verzwakte H37Ra-stam mtb, die kan worden behandeld in een laboratorium met containmentniveau 2. Alle manipulaties van levende mycobacteriën werden uitgevoerd in klasse II biologische veiligheidskast (BSC). Experimentele procedures werden ontworpen om de generatie van aerosolen te minimaliseren. Eukaryote celkweek (THP-1 cellen) werd ook uitgevoerd in een klasse II BSC. Het laboratorium voerde een risicobeoordeling uit en zorgde ervoor dat alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale biologische veiligheidsvoorschriften. De menselijke monocytische THP-1 cellijn werd gebruikt om de methode uit te voeren zoals beschreven (stap 1). Cellen worden gedifferentieerd in macrofagen na stimulatie met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) vóór infectie met mycobacteriën.
1. Celkweek
- Vermeerdering van H37Ra-zaadvoorraad tot logfase in Middlebrook 7H9 (MB) bouillon aangevuld met albumine-dextrose-catalase (ADC) verrijking (10%) en 0,05% polysorbaat 80. Bewaar H37Ra voorraad in 1 ml aliquots in een -80 °C vriezer voor maximaal 1 jaar.
- Ontdooi een injectieflacon mtb-H37ra van 1 ml en breng deze ongeveer 1 week voor het geplande experiment over in een T25-kolf met een filterdop met 9 ml MB aangevulde bouillon. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 dagen in een statische incubator.
- Kweek THP-1 cellen in RPMI-1640 aangevuld met niet-warmtedodend 10% foetaal kalfsserum (compleet (c)RPMI) in een T75 kolf in een CO2 bevochtigde incubator bij 5% CO2/37 °C en subcultuur tweemaal per week om een dichtheid van minder dan 1 x 106 cellen/ml te behouden.
- Differentieer THP-1-cellen in macrofagen 3 dagen voor infectie door cellen meerdere keren voorzichtig te pipetteren met behulp van een serologische pipet in T75-kolven om eventuele klonten te verspreiden en in een conische buis van 50 ml te plaatsen.
- Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, decanteer het supernatant en resuspenseer de pellet voorzichtig in 2 ml RPMI. Voer het aantal cellen uit om cellen/ml te schatten.
- Zaad 2 ml THP-1 macrofagen in 12-well weefselkweekplaten met een dichtheid van 100.000 cellen / ml in cRPMI met 100 ng / ml PMA gedurende 72 uur. Verwijder PMA-bevattend medium uit cellen en vul aan met verse cRPMI vóór Mtb-infectie.
- Stel afzonderlijke platen in voor elk vereist tijdstip.
- Zaadcellen met dezelfde dichtheid (100.000 cellen / ml) in 2-well glazen kamerglaasjes om de multipliciteit van infectie (MOI) te bepalen.
- Plaats in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen bij 37 °C.
2. Kwantificering van mtb-opname
- Bepaling van mtb-opname door macrofagen (MOI)
- Stel de biologische veiligheidskast klasse II (BSC) op de dag van infectie in en werk aan twee lagen tissuepapier om eventuele morsen op te vangen. Stel afvalcontainers in volgens de lokale regelgeving.
- Verwijder 6-8 ml mycobacteriële cultuur uit de T25-kolf en breng deze over in een polypropyleenbuis van 15 ml.
OPMERKING: Buizen met een kleiner volume kunnen worden gebruikt voor kleinere experimenten. - Centrifugeer de buis in een benchtopcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 2890 x g.
- Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge en breng deze over naar de biologische veiligheidskast. Wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Giet het supernatant af in de desinfecterende weggooicontainer, recap-buis en resuspenseer de bacteriën in het resterende medium door op de zijkant van de buis te tikken. Wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Voeg 2 ml voorverwarmd cRPMI toe, meng voorzichtig en breng over in een conische buis van 50 ml.
- Resuspendeer de mycobacteriën zeer voorzichtig met behulp van een naald van 25 G en een spuit van 5 ml. Om te resuspenderen, trekt u de mycobacteriënsuspensie in de spuit en werpt u heel voorzichtig de zijwand van de buis uit om de aerosolproductie te minimaliseren. Herhaal dit 6-8 keer.
OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig, want dit is een cultuur van mycobacteriën met een hoge dichtheid. Om het risico op prikaccidenten te voorkomen, gebruikt u waar mogelijk stompe naalden en Luer-slotspuiten. - Gooi de naald en spuit weg in een naaldencontainer in de BSC.
- Breng de suspensie over in een microfugebuis van 2 ml (met schroefdop) en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 100 x g om eventuele resterende klonten te pelleteren. Breng de buis terug naar de veiligheidskast en wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Breng de bovenste 1-1,5 ml van het supernatant over in een nieuwe buis. Gooi de originele buis weg in de afvalemmer met ontsmettingsmiddel. Meng goed en voeg verschillende hoeveelheden van de mycobacteriële suspensie (bijv. 5, 25, 50, 150 μL) toe aan de 2-well glazen kamerglaasjes en incubeer gedurende 3 uur in een CO2-incubator bij 37 °C.
- Kleuring voor zuurvaste bacteriën (AFB)
OPMERKING: Na 3 uur incubatie worden de macrofagen gewassen en gefixeerd met paraformaldehyde om mycobacteriën te inactiveren. De dia's worden vervolgens gekleurd met behulp van een modified Auramine O-kit (zie tabel met materialen) om mycobacteriën fagocytosed per cel te schatten. Door hun wasachtige celwand behouden mycobacteriën de Auramine-kleurstof na een zuur-alcoholwasbeurt. De macrofaagkernen worden dan tegengesteld met Hoechst. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal fagocytose bacteriën per cel te tellen en wordt gebruikt om de multipliciteit van infectie (MOI) van de macrofagen te bepalen.- Verwijder het medium uit de glazen kamerschuif nadat u drie keer op en neer hebt gepipetteerd om bacteriën te verdrijven die niet zijn gefagocyteerd.
- Eenmaal wassen met 2 ml PBS op kamertemperatuur.
- Bewaar voorraden van 4% paraformaldehyde, opgelost in PBS in aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Ontdooi een aliquot van 4% paraformaldehyde vlak voor gebruik. Verdun tot 2% paraformaldehyde met PBS en voeg 2 ml per put toe.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De glaskamerschuif kan in dit stadium uit de veiligheidskast worden verwijderd voor vlekken.
- Was de glijbaan onder een zachte stroom kraanwater.
- Doseer voldoende Auramine op de dia om de cellen te bedekken met een plastic transferpipet en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur in het donker (afdekken met aluminiumfolie).
- Was overtollige kleurstof van de glijbaan met kraanwater en voeg de ontkleurer/blusser gedurende 1 minuut toe in het donker.
- Was het teveel af met leidingwater en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met Hoechst 33342 (10 μg/ml in PBS) in het donker.
- Was de Hoechst-vlek af met kraanwater, verwijder de kamers, giet overtollig water af van de glijbaan, voeg een druppel antifade en coverslip toe en droog aan de lucht.
- Bekijk de dia onder de fluorescerende microscoop met behulp van het 100x olieobjectief. Mycobacteriën fluoresceren groen onder het FITC-filter. De kernen fluoresceren blauw onder het DAPI-filter (figuur 1C).
- Bepaal de MOI door het aantal mycobacteriën fagocytosed per cel en het percentage geïnfecteerde cellen te tellen.
- Bereken het volume mycobacteriële suspensie dat nodig is om de vereiste MOI te bereiken op basis van het oppervlak van een put in de plaat; het oppervlak van de glazen kamerdia's die in dit experiment worden gebruikt, is bijvoorbeeld 4 cm2. Lage MOI (ongeveer 1-2 bacillen/cellen) is wenselijk voor experimenten die gedurende meerdere dagen (bijv. 5 dagen) worden uitgevoerd.
- Infectie van macrofagen
- Meng de mycobacteriën suspensie goed en voeg de hoeveelheid die nodig is toe aan de cellen op 12-well platen zodra het volume dat nodig is om de gewenste MOI te bereiken is bepaald.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur om mycobacteriën te laten fagocyteren.
- Verwijder extracellulaire bacteriën door de putjes meerdere keren te wassen met warme RPMI of HBSS.
- Laat de macrofagen in één putje (3 uur monster) lyseren om het percentage tijd tot positiviteit (TTP) van het initiële entmateriaal (3 h monster) te bepalen, zoals beschreven in stap 3 hieronder.
- Voeg verse cRPMI en de vereiste geneesmiddeldoses of voertuigcontrole toe aan de resterende putten, incubeer de platen in de CO2-incubator bij 37 °C gedurende de benodigde tijd (afhankelijk van het experimentele ontwerp, maar meestal met verschillende tussenpozen tussen 1 en 8 dagen).
3. Monsters oogsten voor het vloeistofkweekdetectiesysteem
OPMERKING: Op de dag van infectie worden extracellulaire mycobacteriën verwijderd door wassen en intracellulaire mycobacteriën worden geoogst door lysis van één put van macrofagen (3 uur monster) om de initiële hoeveelheid fagocytosed te bepalen als een basislijncontrole voor infectie. Op latere tijdstippen worden zowel het medium, cellysaat als wasbeurten gecombineerd om de totale mycobacteriële groei te meten. Extracellulaire en intracellulaire groei kunnen indien gewenst ook afzonderlijk worden beoordeeld.
- Monster van 3 uur om TTP te bepalen
- Spoel extracellulaire mycobacteriën uit alle putjes na de eerste 3 uur infectie zoals beschreven in stap 2.3.3. Voeg 1 ml verse media toe aan de 3-uursregeling om het lysaatvolume gelijk te maken met dat van latere tijdstippen.
OPMERKING: Zie stap 3.2.7 als extracellulaire mycobacteriën van de analyse moeten worden uitgesloten.
- Spoel extracellulaire mycobacteriën uit alle putjes na de eerste 3 uur infectie zoals beschreven in stap 2.3.3. Voeg 1 ml verse media toe aan de 3-uursregeling om het lysaatvolume gelijk te maken met dat van latere tijdstippen.
- Monsterverzameling
- Warme MB bouillon en instrument cultuur flessen om ze op kamertemperatuur te brengen.
- Breng het medium over van de 12-wells plaat naar de overeenkomstige gelabelde conische buizen.
- Voeg 500 μL steriele lysisbuffer (0,1% Triton x-100 in PBS gefilterd door een steriel filter van 0,2 μm) toe aan elk putje gedurende 10 minuten.
- Schraap de cellen voorzichtig uit de put met een steriele schraper en combineer met het medium in de juiste conische buis.
- Was de put met 0,5 ml steriel PBS en breng over in de juiste buis.
- Laat elk monster voorzichtig 6-8 keer door een naald en spuit (25 G) gaan om de klonten te breken. Verdun monsters 1:10 in MB bouillon; 100 μL monster + 900 μL MB medium.
- Oogst de resterende monsters op de vereiste tijden/dagen (meestal tussen 1 en 8 dagen) door de stappen 3.2.1-3.2.6 hierboven te volgen.
OPMERKING: Onderzoekers kunnen er de voorkeur aan geven om extracellulaire mycobacteriën uit te sluiten van hun analyse, in welk geval, in stap 3.2.2 hierboven, het medium uit elke put wordt weggegooid en macrofagen meerdere keren worden gewassen voordat lysisbuffer wordt toegevoegd.
- Inenten en laden van instrumentkweekflessen
OPMERKING: Details van het vloeistofkweekinstrument en de bijbehorende verbruiksartikelen zijn te vinden in de materiaaltabel.- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in het BSC. - Bereid flessen voor door voldoende voedingssupplementen voor alle monsters over te brengen in een conische buis (0,5 ml / fles). Gebruik een naald en spuit om 0,5 ml voedingssupplement in de instrumentcultuurfles te injecteren.
- Pipetteer 500 μL van het verdunde monster (1:10) in een buis met 1 ml V-bodem.
- Gebruik een naald en spuit om de 500 μL monster in de toegewezen instrumentkweekfles te injecteren.
- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen. Veeg de flessen af met vloeipapier gedrenkt in 70% alcohol voordat u ze uit de BSC verwijdert.
- Transporteer flessen zorgvuldig van de bioveiligheidskast naar het instrument om te laden.
- Druk op de laadknop op het geautomatiseerde microbiële detectiesysteem.
- Scan de barcodes op instrumentkweekflessen en plaats de flessen in de incubator van het detectiesysteem bij 37 °C gedurende maximaal 42 dagen. Lees en noteer de tijd die nodig is om positiviteit te bereiken vanaf het instrumentenscherm.
OPMERKING: Met de streepjescode kan het instrument de fles identificeren en reflectiemetingen koppelen aan een bepaalde fles. - Bereken de procentuele tijd tot positiviteit (TTP) door de TTP van het initiële intracellulaire entmateriaal (dag 0) te vergelijken met die van macrofagen gekweekt voor de aangegeven tijden. Een positieve verandering in percentage TTP betekent mycobacteriële groei13.
Bijvoorbeeld voor dag 3:
Procentuele verandering in tijd naar positiviteit =
- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het geautomatiseerde vloeistofkweekinstrument dat in deze studie wordt gebruikt, bewaakt elke 10 minuten de CO2-niveaus . Een kleurverandering in de sensor aan de onderkant van de instrumentfles wordt colorimetrisch gemeten en uitgedrukt als reflectie-eenheden. De instrumentsoftware past vervolgens detectiealgoritmen toe om de tijd tot positiviteit (TTP) te berekenen, d.w.z. het aantal dagen vanaf inenting totdat culturen als positief worden gemarkeerd (figuur 1A). Een omgekeerde ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De auteurs hebben de in dit protocol beschreven vloeistofkweekmethode gebruikt om de Mtb-groei te volgen in van monocyten afgeleide macrofagen en alveolaire macrofagen en THP-1-cellen gedifferentieerd met PMA 11,16,17. Deze techniek kan ook worden aangepast voor gebruik met niet-adherente cellen12. Meer recent werd het instrument ook gebruikt in preklinische studies om geïnhaleerd all-trans retinoïnezuur ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), de Health Research Board in Ierland [HRA-POR/2012/4 en HRA-POR-2015-1145] en Royal City of Dublin Hospital Trust.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detectie en beeldvorming |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, steriele | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infectie van macropahgen |
| 5 mL spuit, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infectie van macropahgen/CFU |
| 50 mL buis, steriele | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infectie van macropahgen |
| all-trans-Retinoic Zuur (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Gastgerichte therapiekandidaat |
| BacT/ALERT 3D Microbiologisch detectiesysteem | Biomerieux (Hampshire, UK) | 247001 | Bouillongebaseerd colormetrisch detectiesysteem |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP voedingssupplement | Biomerieux (Hampshire, UK) | 414997 | Bouillongebaseerde colormetrische detectietest |
| BACT/ALERT MP kweekflesjes | Biomerieux (Hampshire, UK) | 419744 | Bouillongebaseerde colormetrische detectietest |
| BD BBL Middlebrook ADC Verrijking, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| BD BBL Middlebrook OADC Verrijking, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Kolonievormende eenheden |
| Celschraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Oogst van lmacrofaaglysaten |
| Corning Spuitfilter, 0,2 µm | Corning Incorporated, Duitsland | 431219 | Sterilisatie van lyseringsbuffer |
| Dekglas (borosilicaat), 24 x 50 mm, #1.5 dikte | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, van microbiële | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Kolonievormende eenheden |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade montagemedium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infectie van macropahgen |
| Fetaal bovien serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrofaagcelcultuur |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Kolonievormende eenheden |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Kernkleurstof |
| IFNγ, recombinant humaan | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Gastgerichte therapiekandidaat |
| Labtek 2-well kamerslide, steriele, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infectie van macropahgen |
| L-Asparagine, anhydrisch | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Kolonievormende eenheden |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibioticum |
| Microlance Hypodermische Naald 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infectie van macropahgen/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Basis | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Kolonievormende eenheden |
| Middlebrook 7H9 Broth Basis | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| Gemodificeerde Auramine O Kleur- en Ontkleurder | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB-kleuring |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infectie van macropahgen |
| Petrischalen, 92 x 16mm (20/zak) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Kolonievormende eenheden |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrofaagcelcultuur |
| Polysorbaat 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrofaagcelcultuur |
| Steriele Celverspreider, L-vormig | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Kolonievormende eenheden |
| T25 TC fles, hoekige hals, filterdop, steriele, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium vloeistofcultuur |
| THP-1 cellijn | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrofaagcelcultuur |
Referenties
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , Geneva. (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184(2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237(2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
