Methodenartikel

Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

DOI:

10.3791/62843

⸱

12 augustus 2021

 ,  , 
1Department of Evolutionary Ecology, Institute of Organismic and Molecular Evolution, Johannes Gutenberg University, 2Department of Insect Symbiosis, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3Department of Plant and Environmental Sciences, Section for Organismal Biology, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit is een aangepaste methode voor het identificeren van kandidaat-insectenkolonisatiefactoren in een Burkholderia gunstige symbiont. De kevergastheer is geïnfecteerd met een willekeurige mutantenbibliotheek gegenereerd via transposonmutagenese en de complexiteit van de bibliotheek na kolonisatie wordt vergeleken met een controle die in vitrois gekweekt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het afleiden van de functie van genen door hun activiteit te manipuleren is een essentieel hulpmiddel voor het begrijpen van de genetische onderbouwing van de meeste biologische processen. Vooruitgang in de moleculaire microbiologie heeft geleid tot de opkomst van diverse mutagenesetechnieken voor de manipulatie van genen. Onder hen is transposon-insertion sequencing (Tn-seq) een waardevol hulpmiddel om tegelijkertijd de functionaliteit van veel kandidaatgenen op een ongerichte manier te beoordelen. De techniek is de sleutel geweest om moleculaire mechanismen te identificeren voor de kolonisatie van eukaryote gastheren in verschillende pathogene microben en een paar nuttige symbionten.

Hier is Tn-seq vastgesteld als een methode om kolonisatiefactoren te identificeren in een mutualistische Burkholderia gladiolensymbiont van de kever Lagria villosa. Door conjugatie wordt Tn5 transposon-gemedieerde insertie van een antibioticaresistentiecassette uitgevoerd op willekeurige genomische locaties in B. gladiolen. Om het effect van genverstoringen op het vermogen van de bacteriën om de kevergastheer te koloniseren te identificeren, wordt de gegenereerde B. gladiolen transposon-mutantbibliotheek ingeënt op de kevereieren, terwijl een controle in vitro wordt gekweekt in een vloeibaar kweekmedium. Na voldoende tijd voor kolonisatie wordt DNA geëxtraheerd uit de in vivo en in vitro gekweekte bibliotheken. Volgens een DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol worden de DNA-monsters voorbereid voor transposon-insertiesequentie. DNA-fragmenten die de transposon-insert rand en flankerend bacterieel DNA bevatten, worden geselecteerd en de mutatieplaatsen worden bepaald door sequencing weg van de transposon-insert rand. Ten slotte kan door het analyseren en vergelijken van de frequenties van elke mutant tussen de in vivo en in vitro bibliotheken, het belang van specifieke symbiontgenen tijdens keverkolonisatie worden voorspeld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burkholderia gladiolen kunnen een symbiotische associatie aangaan met Lagria villosa-kevers en een belangrijke rol spelen bij de verdediging tegen microbiële antagonisten van de insectengastheer4,5,6. Vrouwelijke kevers huisvesten verschillende stammen van B. gladiolen in gespecialiseerde klieren die accessoire zijn voor het voortplantingssysteem. Bij het leggen van eieren smeren vrouwtjes B. gladiolencellen op het eioppervlak waar antimicrobiële verbindingen geproduceerd door B. gladiolen infecties door entomopathogene schimmels remmen4,6. Tijdens de late embryonale ontwikkeling of vroeg nadat de larven uitkomen, koloniseren de bacteriën cuticulaire invaginaties op het dorsale oppervlak van de larven. Ondanks deze gespecialiseerde lokalisatie en verticale transmissieroute van de symbionten, kan L. villosa vermoedelijk ook B. gladiolen horizontaal uit de omgeving verkrijgen4. Verder zijn ten minste drie stammen van B. gladiolen gevonden in verband met L. villosa4,6. Onder deze, B. gladiolen Lv-StA is de enige die vatbaar is voor teelt in vitro.

B. gladiolen Lv-StA heeft een genoomgrootte van 8,56 Mb6 en bevat 7.468 genen. Welke van deze genen zijn belangrijk voor B. gladiolenbacteriën om de kevergastheer te koloniseren? Om deze vraag te beantwoorden, gebruikten we transposon-insertion sequencing (Tn-seq), een exploratieve methode om voorwaardelijk essentiële microbiële genen1,2,3te identificeren. Een mutantenbibliotheek van B. gladiolen Lv-StA werd gemaakt met behulp van een Tn5-transposon. Door conjugatie van Escherichia coli donorcellen naar B. gladiolen Lv-StA werd een pRL27 plasmide met het Tn5 transposon en een antibioticaresistentiecassette geflankeerd door omgekeerde herhalingen overgebracht(Figuur 1). Daarbij werd een set mutanten gegenereerd die individueel verstoringen van 3.736 symbiontengenen dragen(figuur 2).

De mutantenpool werd geïnfecteerd op kevereieren om de kolonisatiefactoren te identificeren en werd als controle ook in vitro gekweekt in King's B (KB) medium. Na voldoende tijd voor kolonisatie te hebben gegeven, werden uitgekomen larven verzameld en samengevoegd voor DNA-extractie. Fragmenten van DNA met de transposon insert en het flankerende genomische gebied van B. gladiolen Lv-StA werden geselecteerd met behulp van een gemodificeerd DNA-bibliotheekpreparaatprotocol voor sequencing. Lees kwaliteitsverwerking gevolgd door analyse met DESeq2 werd uitgevoerd om specifieke genen te identificeren die cruciaal zijn voor B. gladiolen Lv-StA om L. villosa-larven te koloniseren wanneer ze via het eioppervlak worden overgedragen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Media- en buffervoorbereiding

  1. Bereid KB- en LB-media en agarplaten zoals opgegeven in tabel 1en autoclaaf bij 121 °C, 15 psi, 20 min.
    1. Voeg 50 μg/ml filtergesteriliseerd kanamycine en 300 μM filtergesteriliseerd 2,6-diaminopimelzuur (DAP) toe aan het geautoclaveerde LB-medium voordat u E.coli WM3064 + pRL27 kweekt.
    2. Voeg 50 μg / ml filter-gesteriliseerd kanamycine toe aan de geautoclaveerde KB-agar om platen te gieten die nodig zijn voor het selecteren van succesvolle B. gladiolen Lv-StA transconjuganten.
  2. Bereid 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door de volgende componenten te mengen: NaCl 8 g/L, KCl 0,201 g/L, Na2HPO4 1,42 g/L en KH2PO4 0,272 g/L. Los de zouten op in gedestilleerd water en autoclaaf het mengsel bij 121 °C, 15 psi, 20 min voor gebruik. Bewaren bij kamertemperatuur.
  3. Bereid een bind- en wasbuffer van 2x door de volgende componenten op te lossen: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 2 M NaCl in gedestilleerd water. Filter-steriliseer het mengsel voor gebruik. Bewaren bij kamertemperatuur.
  4. Bereid 1x Low-TE door 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 0,1 mM EDTA op te lossen in dubbel gedestilleerd water. Steriliseren door autoclaveren bij 121 °C, 15 psi, 20 min. Bewaren bij kamertemperatuur.

2. Conjugatie om de transposon mutant library te genereren

figure-protocol-1
Figuur 1: Stappen in het conjugatieprotocol. De conjugatieontvanger Burkholderia gladioli Lv-StA (rood) en donor Escherichia coli met het pRL27-plasmide (roze) worden gekweekt in respectievelijk KB-agar en LB, aangevuld met kanamycine en DAP. Na conjugatieve overdracht van het plasmide gedurende 12-18 uur bij 30 °C worden de transconjugante B. gladiolencellen geselecteerd op KB die kanamycine bevatten en samengevoegd. Afkortingen: DAP = 2,6-diaminopimelzuur; Kan = kanamycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Ent onder een steriele kap een verse donorkweek van Escherichia coli WM3064 + pRL27 in 10 ml LB-medium aangevuld met kanamycine en DAP. Ent Burkholderia gladiolen Lv-StA-ontvangstcellen in 5 ml KB-medium. Incubeer de culturen bij 30 °C een nacht op een shaker bij 250 rpm.
  2. Na nachtelijke groei centrifugeer 4 ml van elk van de culturen bij 9.600 × g gedurende 6 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi het supernatant weg.
  3. Was onder een steriele kap de gepelletiseerde celculturen in KB-medium dat DAP bevat en resuspend de culturen ten slotte afzonderlijk in 4 ml KB + DAP-medium.
  4. Meng in een verse buis van 15 ml 250 μL van de gewassen E. coli-donorcellen met 1 ml van de gewassen B. gladiolen Lv-StA-ontvangstcellen.
  5. Spot 10 μL van dit conjugatiecelmengsel op KB-agarplaten die DAP bevatten. Laat de plaat ongestoord in de steriele kap rusten bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Incubeer vervolgens de platen met de vervoegingsvlekken bij 30 °C gedurende 12-18 uur.
    OPMERKING: De vervoegingsperiode kan worden aangepast aan de doelsoort. Een lange conjugatieperiode verhoogt echter het risico op dubbele inserties of plasmide-integratie in het genoom. Houd voor langzaam groeiende bacteriën rekening met langere conjugatieperioden.
  6. Voeg na incubatie 2-4 ml 1x PBS toe aan de platen onder een steriele kap en gebruik een celschraper om de gekweekte bacteriële conjugatievlekken van de agar vrij te maken. Pipetteer het geconjugeerde celmengsel in 2 ml microfugebuizen.
  7. Pellet de cellen door centrifugeren met 9.600 × g gedurende 2 minuten. Gooi het supernatant weg en was de pellet tweemaal in 1 ml 1x PBS door op en neer te pipetteren. Resuspend de uiteindelijke pellet in 1200 μL van 1x PBS. Verdunningen vóór het plateren als het aantal cellen in het mengsel meer dan 1 × 104bedraagt.
  8. Meng goed en verdeel 200 μL van het celmengsel op grote KB-agarplaten (6 of meer, indien nodig) aangevuld met kanamycine en incubeer bij 30 °C gedurende de nacht.
    OPMERKING: Doelmutantkolonies verschijnen binnen 30 uur op de selectieve agarplaten. Vanwege de antibioticaresistentiemarker verschijnen alleen gemuteerde kolonies op de selectieve agarplaat. Daarom wordt van alle kolonies verwacht dat ze succesvolle transconjuganten zijn.
  9. Tel het totale aantal transconjugante kolonies op drie platen en extrapoleer om het geschatte aantal mutanten te berekenen dat in alle platen is verkregen. Om de kans op het verkrijgen van een representatieve bibliotheek te vergroten, moet u ervoor zorgen dat het totale aantal kolonies meerdere malen hoger is dan het totale aantal genen in het genoom. Om het succes van de conjugatie te bevestigen, voert u een PCR uit gericht op de inbrengcassette met behulp van 10-20 monsterkolonies, zoals beschreven in sectie 3.
    OPMERKING: Het doel is om ervoor te zorgen dat het aantal kolonies minstens 10-voudig is van het aantal genen in het hele genoom, in dit geval > 75.000 mutanten. Het is echter over het algemeen een uitdaging om het aantal kolonies dat overeenkomt met een volledig representatieve bibliotheek nauwkeurig in te schatten. Het aantal gemuteerde unieke genen is op dit moment niet duidelijk, aangezien verstoringen in essentiële genen niet worden vastgelegd, er vaak meerdere verschillende mutatieplaatsen voor hetzelfde gen zijn en mutaties gegenereerd met Tn5-transposons niet helemaal willekeurig zijn.
  10. Schraap onder een steriele kap kolonies van de platen door 1-2 ml 1x PBS op de agar toe te voegen. Pool het celmengsel dat van de platen is afgeschraapt in buizen van 50 ml. Vortex de bibliotheek om grondig te mengen en splits vervolgens 4 ml van de gepoolde mutantenbibliotheek in verschillende cryobuizen. Voeg 1 ml 70% glycerol toe aan de buisjes en bewaar bij -80 °C.

3. PCR en gel-elektroforese om succesvolle inserties in B. gladiolen Lv-StA te bevestigen

  1. Om de aanwezigheid van de insertie te bevestigen, kiest u individuele mutantenkolonies uit de selectieplaten in stap 2.9 en voert u een PCR uit gericht op de insertiecassette met behulp van de primers in tabel 2. Bereid de PCR-mastermix volgens tabel 3 en stel de voorwaarden in de thermische cycler in zoals beschreven in tabel 4.
  2. Voer de PCR-producten uit op een 1,6% agarosegel door elektroforese (250 V, 40 min) om te controleren of de versterkte DNA-fragmenten de verwachte lengte van 1580 bp hebben.

4. Mutante zwembadinfectie op kevereieren

  1. Stappen voor het wassen van de bibliotheek
    1. Ontdooi een aliquot van de geprepareerde mutantenbibliotheek op ijs. Centrifugeer bij 2.683 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Was de cellen onder een steriele kap met 4 ml 1x PBS om het resterende medium uit de cellen te verwijderen. Resuspend de cellen in 4 ml van 1x PBS.
    2. Tel het aantal cellen in een aliquot van de bibliotheek met behulp van een celtelkamer. Verdun een deel van de bibliotheek tot 2 × 106 cellen/μL in 1x PBS.
    3. Vortex de bibliotheek grondig om de hele bibliotheek homogeen te mengen voordat het vereiste volume wordt genomen.
  2. Sterilisatie van de eicelkoppeling en in vivo infectie
    1. Selecteer een L. villosa eierkoppeling. Tel het aantal eieren en ga verder als de koppeling meer dan 100 eieren bevat.
    2. Steriliseer de hele eikoppeling.
      1. Voeg 200 μL 70% ethanol toe en was de eieren voorzichtig gedurende 5 minuten. Verwijder de ethanol en was de eieren twee keer met geautoclaveerd water.
      2. Voeg 200 μL 12% bleekmiddel (NaOCl) toe en was de eieren voorzichtig gedurende 30 s. Verwijder het bleekmiddel onmiddellijk en was de eieren drie keer opnieuw met 200 μL geautoclaveerd water.
    3. Infecteer 2 × 106 cellen/μL van de gewassen mutantenbibliotheek op het gesteriliseerde eikoppeling (2,5 μL per ei).
    4. Twee dagen nadat de geïnfecteerde keverlarven uitkomen, verzamelt u 1002e instarlarven per 1,5 ml microfugebuis en bewaart u deze bij -80 °C.
  3. Controle van in vitro mutantenbibliotheek
    1. Ent onder een steriele kap 250 μL van 2 × 106 cellen/μL van de gewassen mutantenbibliotheek in 10 ml KB-medium dat kanamycine bevat.
    2. Incubeer de in vitro mutantcultuur bij 30 °C gedurende 20 uur.
      OPMERKING: Bereken de incubatieduur om overeen te komen met het geschatte aantal generaties WT B. gladiolen Lv-StA in vivo tijdens kolonisatie.
    3. Voeg na de incubatietijd van 20 uur een gelijk volume van 70% glycerol toe aan de in vitro mutantcultuur en bewaar dit bij -80 °C.

5. Geïnfecteerde kevers en in vitro mutant bibliotheek DNA extractie

OPMERKING: DNA-extracties werden uitgevoerd met behulp van een DNA- en RNA-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant dat hieronder kort wordt beschreven.

  1. Homogeniseer gepoolde larven (maximaal 4 mg per microfugebuis) door 1-2 ml vloeibare stikstof toe te voegen en te pletten met een stamper.
  2. Ontdooi de in vitro gekweekte mutantculturen uit glycerolvoorraden op ijs. Pellet de cellen door centrifugeren bij 9.600 × g gedurende 10 minuten voor de cellyse.
  3. Voeg 300 μL weefsel- en cellyseoplossing toe aan de in vitro en in vivo monsters. Voeg 5 μL van 10 mg/ml Proteinase K toe, incubeer het mengsel bij 60 °C gedurende 15 minuten en leg het vervolgens op ijs gedurende 3-5 min.
  4. Voeg 150 μL eiwitnecipitatiereagens toe aan de lysaten en vortex grondig. Pellet het eiwitafval door het gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 9.600 × g.
  5. Breng het supernatant over in een microfugebuis van 1,5 ml. Voeg 500 μL isopropanol toe aan het supernatant en keer de buisjes ten minste 40 keer voorzichtig om voordat u gedurende 1 uur of een nacht bij -20 °C incubeert.
  6. Pellet het neergeslagen DNA door het te centrifugeren bij 9.600 × g gedurende 10 minuten. Gooi het bovennatuurlijke abergstof weg en voeg ijskoude 70% ethanol toe aan de DNA-pellet.
  7. Centrifugeer bij ≥10.000 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en laat de monsters ten minste 1 uur aan de lucht drogen.
  8. Resuspend het DNA van de in vitro en in vivo monsters in 100 μL Low-TE buffer.
  9. Bewaar de monsters bij -20 °C.

6. Sequencing bibliotheekvoorbereiding

OPMERKING: Het protocol en de reagentia voor de voorbereiding van de DNA-bibliotheek zijn aangepast en aangepast aan de instructies van de fabrikant van de DNA-bibliotheekvoorbereidingskit.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schema van de voorbereidingsstappen van de DNA-bibliotheek. Na het scheren en het afzonderen van de adapter bevat het aangepaste protocol een streptavidin-kraalselectiestap om DNA-fragmenten met de inbrengcassette te verrijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Verdun de monsters tot een concentratie van 20 ng/μL en een volume van 100 μL en bewaar ze op ijs.
  2. Schuif in vivo en in vitro monster DNA met behulp van een ultrasoonapparaat. Stel de ultrasoonapparaat in op 70% vermogen. Vortex de monsters kort en schuif gedurende 1 min 30 s.
    OPMERKING: De instellingen voor de ultrasonicator verschillen per instrument. In dit geval was de fragmentgrootte 200-400 bp, wat geschikt is voor deze sequencingbenadering van 150 bp, gepaard einde (zie stap 9.1). De schuifparameters kunnen worden aangepast aan de vereisten van de experimentator.
  3. Controleer of het DNA is afgescheerd tot het gewenste groottebereik (in dit geval 200-400 bp). Belasting 5 μL van het ongehoorde en gescheurde DNA na vermenging met gel loading dye in een 1:1 verhouding op een 1,6% agarose gel run op 250 V gedurende 40 min (Figuur 3A,B).
  4. Voorbereiding van fragmentuiteinden die nodig zijn voor adapterligatie
    1. Voeg aan 50 μL van het gescheurde DNA de reagentia van het eindpreparaat toe die in de bibliotheekpreparaatkit zijn gegeven: 3 μL van het enzymmengsel en 7 μL reactiebuffer en meng goed door pipetteren. Zet een thermische cycler met een verwarmd deksel op ≥ 75 °C en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 20 °C en 30 minuten bij 65 °C. Houd bij 4 °C.
  5. Adapter ligatie
    1. Voeg voor adapterligatie de volgende reagentia toe aan de producten van de eindvoorbereidingsstap: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer en 2,5 μL verdunde adapter. Meng grondig door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 20 °C in de thermische cycler met het verwarmde deksel eraf.
    2. Voeg na 15 min 3 μL van het enzym toe (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII) (zie de Tabel met Materialen). Meng goed door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 37 °C in een thermische cycler met het deksel verwarmd tot ≥47 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan bij deze stap worden gepauzeerd en de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.
  6. Grootteselectie van adapter-geligeerd DNA gericht op fragmenten van 250 bp
    1. Vortex de magnetische kraaloplossing (zie de tabel met materialen)en plaats deze voor gebruik gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
    2. Voeg 0,3x kralen toe aan 96,5 μL van het geligeerde DNA-mengsel en meng door grondig te pipetteren. Incubeer het kralenmengsel gedurende 5 min.
      OPMERKING: De aanwezigheid van zouten en polyethyleenglycol in het kralenmengsel vergemakkelijkt de neerslag van DNA-fragmenten op de kralen. Een lage verhouding van kralen tot DNA-moleculen leidt tot de binding van alleen grotere DNA-fragmenten aan de kralen. In dit geval zijn DNA-fragmenten van meer dan 250 bp lang gebonden aan de kralen.
    3. Plaats de buizen op een magnetische standaard om de kralen naar beneden te trekken en DNA-fragmenten van ongewenste grootte te verwijderen. Laat de kralen 5 minuten bezinken en breng dan het heldere supernatant over naar een nieuwe microfugebuis (bewaar het supernatant).
    4. Voeg 0,15x verse kralen toe aan het supernatant en meng door goed te pipetteren. Incubeer het kralenmengsel gedurende 5 minuten en plaats de buizen vervolgens op een magnetische standaard om de kralen die aan het doel-DNA zijn gebonden naar beneden te trekken. Wacht 5 minuten en gooi dan het supernatant weg (bewaar de kralen).
      OPMERKING: Deze verhouding van kralen tot DNA leidt tot het binden van fragmenten van de gewenste 250 bp grootte.
    5. Voeg met de kralen op de magnetische standaard 200 μL 80% ethanol (vers bereid) toe en wacht op 30 s. Pipetteer uit en gooi de ethanolwas voorzichtig weg zonder de kralen op de magnetische standaard te verstoren. Herhaal deze stap.
    6. Verwijder na de laatste wasbeurt sporen van ethanol uit de kralen en droog de kralen vervolgens gedurende 2 minuten aan de lucht totdat ze glanzend lijken maar niet volledig zijn uitgedroogd. Droog de kralen niet te veel.
    7. Verwijder de buizen van de magnetische standaard en voeg 17 μL van 10 mM Tris-HCl of 0,1x TE (Low-TE) toe. Meng door ~10 keer te pipetteren en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    8. Plaats de buizen terug op de magnetische standaard en wacht 5 minuten. Zodra de kralen zijn neergedaald, breng je het DNA-supernatant over naar een nieuwe buis.
  7. PCR I om biotinetag toe te voegen aan DNA-fragmenten die de inbrengcassette bevatten
    1. Voeg een gebiotinyleerde primertag toe aan de DNA-fragmenten die de Tn5-insertiecassette bevatten met behulp van de transposonspecifieke gebiotinyleerde primer (tabel 5) en een indexprimer. Bereid de PCR-mastermix volgens tabel 6 en volg de PCR-omstandigheden voor de thermische cycler in tabel 7.
  8. Opschonen van PCR I zonder maatkeuze
    1. Vortex 0,9x kralen en plaats ze minstens 30 minuten op kamertemperatuur voordat je ze opruimt.
    2. Voeg 0,9x kralen toe aan de PCR-producten en meng grondig.
    3. Plaats de kralen op een magnetische standaard om de kralen naar beneden te trekken.
    4. Verwijder het heldere supernatant en was het parelgebonden DNA tweemaal met 200 μL vers bereide 80% ethanol.
    5. Verwijder de ethanol na de wasstappen en droog de kralen aan de lucht tot ze er glanzend uitzien, maar niet te droog.
    6. Voeg 32 μL van 10 mM Tris-HCl of 0,1X TE (Low-TE) toe en incubeer de kralen gedurende 5 min. Plaats het mengsel terug op de magnetische standaard en breng het supernatant over in een verse microfugebuis.
  9. Binding van gebiotinyleerde DNA-fragmenten aan streptavidin-kralen
    1. Resuspend 32 μL streptavidin kralen in 1x Bind-and-wash buffer. Was de kralen drie keer met de buffer terwijl ze op een magnetische standaard worden geplaatst.
    2. Voeg 32 μL 2x Bind-and-wash buffer toe en resuspend de kralen. Voeg hieraan 32 μL van de opgeschoonde PCR 1-producten toe. Meng grondig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    3. Plaats het kraal-DNA mengsel gedurende 2 minuten op een magnetische standaard. Pipetteer het supernatant als biotine-gelabeld DNA met de inbrengrand bindt aan streptavidin op de kralen.
    4. Was de kralen met 500 μL 1x Bind-and-wash buffer en was de kralen vervolgens met 200 μL Low-TE. Resuspend de DNA-gebonden kralen in 17 μL Low-TE.
  10. PCR II om adapters toe te voegen aan de fragmenten met de rand van de insteekcassette
    1. Bereid een mastermix, zoals weergegeven in tabel 8,met behulp van de indexprimers en gemodificeerde universele PCR-primers die zijn vermeld in tabel 5. Voeg 15 μL van de DNA-gebonden streptavidin-kralen uit de vorige stap toe aan de PCR-mix. Zie tabel 7 voor de omstandigheden van de thermische cycler.
  11. Reinig de PCR-producten zonder maatkeuze zoals opgegeven in stap 6.8 van dit protocol. Eluteer de uiteindelijke DNA-producten in 30 μL water van moleculaire kwaliteit.
  12. Bewaar de monsters bij -20 °C en gebruik ze voor sequencing.

7. Sequencing en analyse

  1. Sequentieer de bibliotheek met behulp van high-throughput sequencing-technologie. Pas de sequencingdiepte aan afhankelijk van de grootte van de transposonbibliotheek, zoals hieronder wordt vermeld. Beoordeel de leeskwaliteit met FastQC7. Selecteer reads met de Tn5-insertierand aan het 5'-uiteinde van de read en verwijder de invoegrandvolgorde met Cutadapt8 en/of Trimmomatic9.
    OPMERKING: Hier werd een paired-end sequencing-benadering gebruikt om 150 bp per lees en een totaal van 8 Mio-reads te targeten. Om een representatieve dataset te verkrijgen, moet u ervoor zorgen dat het totale aantal gesequencede reads het maximaal mogelijke aantal mutanten in de bibliotheek overschrijdt, d.w.z. het totale geschatte aantal kolonies uit stap 2.9. Als referentie streefde dit protocol naar 40-voudige van de maximaal mogelijke bibliotheekgrootte. Andere succesvolle studies met Tn-seq voor een soortgelijk doel sequentieerden een totaal aantal metingen in de buurt van 25-voudig van het werkelijke aantal unieke inserties in de overeenkomstige mutantenbibliotheek22,23.
  2. Aangezien mutaties aan de uiteinden van genen niet functioneel verstorend zijn, moet u 5% van beide uiteinden van genannotaties van het referentiegenoom-SFF-bestand trimmen. Breng de bijgesneden reads in kaart met het referentiegenoom met Behulp van Bowtie210.
  3. Bereken het aantal inserties uit het aantal unieke 5'-posities in het bam-bestand.
  4. Gebruik FeatureCounts11 omhet aantal hitgenen voor elk replicerenmonster te verkrijgen.
  5. Bereken met behulp van het DESeq212-pakket in RStudio het verschil in mutante abundanties tussen verschillende omstandigheden.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastheer-geassocieerde bacteriën kunnen verschillende factoren gebruiken om een associatie tot stand te brengen, waaronder die welke adhesie, motiliteit, chemotaxis, stressreacties of specifieke transporters bemiddelen. Hoewel factoren die belangrijk zijn voor pathogene-gastheerinteracties zijn gemeld voor verschillende bacteriën13,14,15,16,17,18,waaronder leden van het geslacht Burkholderia19,20,hebben minder studies de moleculaire mechanismen onderzocht die door gunstige symbionten worden gebruikt voor kolonisatie21,22,23 . Met behulp van transposon insertion sequencing was het doel om moleculaire factoren te identificeren die B. gladiolen in staat stellen om L. villosa-kevers te koloniseren.

Transposon-gemedieerde mutagenese werd uitgevoerd met behulp van het pRL27-plasmide, dat een Tn5-transposon en een kanamycineresistentiecassette draagt, geflankeerd door omgekeerde herhalingsplaatsen. Het plasmide werd ingebracht in de doel B. gladiolen Lv-StA-cellen door conjugatie met de plasmidedonor E. coli WM3064-stam (zoals weergegeven in figuur 1). Na conjugatie werd het conjugatiemengsel met B. gladiolenontvanger en E. coli-donorcellen geplateerd op selectieve agarplaten die kanamycine bevatten. De afwezigheid van DAP op de platen elimineerde de donor E. coli-cellen en de aanwezigheid van kanamycine geselecteerd voor succesvolle B. gladiolen Lv-StA-transconjuganten. De gepoolde B. gladiolen Lv-StA mutantenbibliotheek verkregen uit het oogsten van de 100.000 transconjugante kolonies werd voorbereid voor sequencing met behulp van een aangepaste DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en aangepaste primers. Figuur 2 toont de voorbereidingsstappen van de DNA-bibliotheek. Sequencing leverde 4 Mio gepaarde reads op; 3.736 genen van de 7.468 genen in B. gladiolen Lv-StA waren verstoord.

Om mutanten te identificeren die kolonisatie-defect waren in de gastheer, werd de B. gladiolen Lv-StA mutantenbibliotheek geïnfecteerd op de kevereieren en in vitro gekweekt in KB-medium als een controle. De in vivo kolonisatieknelpuntgrootte werd vóór het experiment berekend. Een bekend aantal B. gladiolen Lv-StA-cellen was geïnfecteerd op kevereieren en het aantal koloniserende cellen in vers uitgekomen eerste instarlarven werd verkregen door een suspensie van elke larve te platen en kolonievormende eenheden per individu te tellen. Deze berekeningen werden gedaan om ervoor te zorgen dat het aantal koloniserende cellen voldoende is om alle of een hoog percentage van de mutanten in de bibliotheek te beoordelen op hun vermogen om de gastheer te koloniseren. Bovendien werd de groeitijd tussen in vitro en in vivo omstandigheden genormaliseerd op basis van het aantal bacteriële generaties om deze monsters vergelijkbaar te maken.

Nadat de eieren waren uitgekomen, werden 1.296 larven verzameld in 13 poelen. De overeenkomstige in vitro mutantculturen werden gekweekt en opgeslagen als glycerolvoorraden. DNA van de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken werd geëxtraheerd en gefragmenteerd in een ultrasoonapparaat. Figuur 3 toont de grootteverdeling van het gescheurde DNA, waarbij het merendeel van de fragmenten zich, zoals verwacht, tussen de 100 en 400 bp uitstrekt. Deze stap werd gevolgd door het aangepaste DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol voor sequencing. Bij elke stap van het protocol werd de concentratie van het resterende DNA gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de stappen correct werden uitgevoerd en om dna-verliezen te volgen. Een kwaliteitscontrole (zie de Tabel van Materialen) vóór sequencing onthulde dat de DNA-bibliotheken onverwacht grote (>800 bp) DNA-fragmenten bevatten, en dit was meer uitgesproken in de in vivo bibliotheken. Gezien de moeilijkheid om de clustering van fragmenten in de sequencing lanes te optimaliseren, was het noodzakelijk om de sequencingdiepte te verhogen tot 10 Mio gepaarde reads in de in vivo bibliotheken om het gewenste aantal reads te bereiken. Uit de analyse van de sequencingresultaten bleek dat gemiddeld 4 Mio reads in de in vivo libraries en 3,1 Mio reads in de in vitro libraries de Transposon edge aan het 5' einde van Read-1 (Tabel 9) bevatten, wat bevredigend was voor dit experiment. De verdeling van de 24.224 unieke inserties over het B. gladiolen genoom in de oorspronkelijke bibliotheek is weergegeven in figuur 4. Een analyse uitgevoerd met DESeq2 toonde aan dat de abundanties van 271 mutanten significant verschilden tussen de in vivo en in vitro omstandigheden.

figure-results-1
Figuur 3: Agarose gels van een mutant en DNA bibliotheken. (A) Agarose gel met ongehoord DNA van een mutant in lane x en een 1 kbp ladder voor schaal. (B) Gel met gescheurde DNA-bibliotheek. De bandmaten van de ladder in de eerste rijstrook zijn aan de linkerkant aangegeven. De eerste drie rijstroken a, b en c bevatten gescheurde DNA-fragmenten van de in vivo bibliotheken. Lanes d, e, f en g bevatten gescheurde DNA-fragmenten van de in vitro bibliotheken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Locatie van unieke insertieplaatsen in de oorspronkelijke bibliotheek over de vier replicons in het Burkholderia gladioli Lv-StA genoom. Elke balk langs de x-as bevindt zich op een invoegplaats. De hoogte van een balk langs de y-as komt overeen met het aantal leesopnamen dat aan die site is gekoppeld. Merk op dat de twee chromosomen en twee plasmiden over de volledige lengte worden weergegeven en dus verschillende schalen op de x-as hebben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

King's B medium/ agar
Peptone (sojabonen)20 gr/l
K2HPO4 1,5 g/l
MgSO4.7H2O1,5 g/l
Agar-agar15 g/l
Opgelost in gedestilleerd water
LB medium/agar
Trypton10 gr/L
Gist extract5 g/l
NaCl10 gr/L
Opgelost in gedestilleerd water

Tabel 1: Mediacomponenten.

Nee.InleidingenVolgordePCR gloeitemperatuur. (°C)
1tpnRL17-1RC5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'58.2
2tpnRL13-2RC5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'

Tabel 2: Primers om het succes van conjugatie te bevestigen.

BestanddeelVolume (μL)
HPLC-gezuiverd water4.92
10x Buffer S (hoge specificiteit)1
MgCl2 (25 mM)0.2
dNTPs (2 mM)1.2
Primer 1 (10 pmol/μL)0.8
Primer 2 (10 pmol/μL)0.8
Taq (5 U/µL)0.08
Mastermix totaal9
Sjabloon1

Tabel 3: PCR-mastermix om het succes van de conjugatie te bevestigen. Afkortingen: HPLC = high-performance vloeistofchromatografie; dNTPs = deoxynucleosidetrifosfaat.

StappenTemperatuur °CTijdCycli
Initiële denaturatie953 min.1
Denaturatie9540 s
Annealing58.240 s30 tot 35
Extensie721-2 min
Definitieve uitbreiding724 min.1
Houden4∞

Tabel 4: PCR-voorwaarden om het succes van de conjugatie te bevestigen.

InleidingenVolgordeTm °CGebruikenBron
Transposon-specifieke gebiotinyleerde primer5'-Biotine-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG
-3'		63.56.7.1. PCR IGewoonte
Gemodificeerde Universele PCR primer5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC
TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT
GGTTGAGATGTGT - 3'		626.10.1. PCR IIGewoonte
IndexprimerRaadpleeg de handleiding van de fabrikant6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR IINEBNext Multiplex Oligos voor Illumina (Index primers set 1)
AdapterRaadpleeg de handleiding van de fabrikant6.5. AdapterligatieNEBNext Ultra II DNA bibliotheek prep kit voor Illumina

Tabel 5: Primers en adapter voor PCR I en II tijdens de voorbereiding van de DNA-bibliotheek.

PCR-mix(μL)
Adapter-geligeerde DNA-fragmenten15
NEBNext Ultra II Q5 master mix25
Indexprimer (10 pmol/ μL)5
Transposon specifieke gebiotinyleerde primer (10 pmol/ μL)5
Totaal volume50

Tabel 6: DNA-bibliotheekvoorbereiding-PCR I mastermix.

StappenTemperatuurTijdCycli
Initiële denaturatie98 °C30 s1
Denaturatie98 °C10 s6 tot 12
Annealing65 °C30 s
Extensie72 °C30 s
Definitieve uitbreiding72 °C2 min.1
Houden16 °C∞

Tabel 7: DNA-bibliotheekvoorbereiding -PCR I- en II-voorwaarden.

PCR-mix(μL)
Dna dat op kralen is geselecteerd15
NEBNext Ultra II Q5 master mix25
Indexprimer5
Gemodificeerde universele PCR primer5
Totaal volume50

Tabel 8: DNA-bibliotheekvoorbereiding -PCR II-mastermix.

BibliothekenInvivo-1Invivo-2Invivo-3Invitro-1Invitro-2Invitro-3Originele bibliotheek
Nee. aantal reads (PE)56,57,71039,19,05130,65,84935,73,49428,83,44036,61,95646,09,410
Nee. aantal reads met Tn – rand op 5' einde van Read-154,15,88037,31,16929,36,24733,00,49927,35,70533,50,40241,53,270
Bowtie2 totale uitlijningssnelheid (%) (alleen Read-1)95.53%83.71%89.87%80.79%78.00%73.06%74.92%
Aantal unieke inserties8,5394,1347,18318,93018,42120,43824,224
Aantal getroffen genen157599314502793259730373736

Tabel 9: Samenvatting van de sequencing output en transposon insertie frequentie per bibliotheek. Afkorting: PE = paired-end.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een B. gladiolen transposon mutant bibliotheek werd gegenereerd om belangrijke gastheer kolonisatie factoren in de symbiotische interactie tussen L. villosa kevers en B. gladiolen bacteriën te identificeren. De belangrijkste stappen in het protocol waren conjugatie, gastheer-infectie, DNA-bibliotheekvoorbereiding en sequencing.

Omdat veel stammen van Burkholderia vatbaar zijn voor genetische modificatie door conjugatie24,25,werd het plasmide met de transposon- en antibioticuminbrengcassette met succes geconjugeerd in de doel B. gladiolen Lv-StA-stam van E. coli. Eerdere pogingen tot transformatie door elektroporatie leverden zeer lage tot bijna geen B. gladiolentransformaties op. Het is raadzaam om de transformatietechniek voor het doelorganisme te optimaliseren om efficiënt een groot aantal transformanten op te leveren.

Eén conjugatieronde en 40 conjugatievlekken verstoorden 3.736 genen in B. gladiolen Lv-StA. Achteraf gezien zouden meerdere conjugatierondes nodig zijn om de meeste van de 7.468 genen te verstoren en een verzadigde bibliotheek te verkrijgen. Met name de incubatietijd tijdens conjugatie mocht niet langer zijn dan 12-18 uur, wat het einde is van de exponentiële groeifase van B. gladiolen. Het toestaan van conjugatie voorbij de exponentiële groeifase van bacteriële cellen vermindert de kans op succes van het verkrijgen van transconjuganten26. Daarom moet de conjugatieperiode worden aangepast aan de groei van de bacteriesoort.

Om met succes een experiment uit te voeren met de infectie van mutantenbibliotheken in een gastheer, is het belangrijk om de knelpuntgrootte van de bacteriële populatie tijdens kolonisatie en de diversiteit van mutanten in de bibliotheek vóór infectie te beoordelen1,2,27. Ter voorbereiding op het experiment schatten we het minimale aantal kevers dat moet worden geïnfecteerd om een grote kans te hebben dat elke mutant in de bibliotheek wordt bemonsterd en mag koloniseren. De geschatte in vivo bacteriële generatietijd en het aantal generaties voor de duur van het experiment werden ook berekend. De in vitro kweek werd vervolgens tot een vergelijkbaar aantal generaties opgekweekt door de incubatietijd aan te passen. Voor een vergelijkbaar infectie-experiment in andere niet-modelgastheren is het vermogen om een laboratoriumcultuur en een constante bron van de gastheerorganismen te behouden wenselijk.

Na de groei van de mutantenbibliotheek in vivo en in vitro en monsterverzameling, werd een aangepast DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol voor transposon insertie sequencing uitgevoerd. De wijziging in het protocol omvatte het ontwerpen van aangepaste PCR-primers en het toevoegen van PCR-stappen om te selecteren op DNA-fragmenten die de inbrengcassette bevatten. Omdat het protocol was aangepast, verhoogden extra PCR-cycli in het protocol het risico op oververmplificatie en het verkrijgen van gehybridiseerde adapter-adapterfragmenten in de eindbibliotheken. Daarom wordt een laatste opschoningsstap (zonder grootteselectie) na de twee PCR's aanbevolen, omdat dit helpt bij het verwijderen van deze fragmenten. De grootteverdeling van de DNA-bibliotheken was nog steeds breder dan verwacht. Het verhogen van de sequencingdiepte leverde echter voldoende gegevens op die werden gefilterd tijdens bioinformatica-analyse, waardoor bevredigende resultaten werden verkregen.

Omdat transposon-gemedieerde mutagenese duizenden willekeurige inserties genereert in een enkel experiment, is het mogelijk om een verzadigde bibliotheek van mutanten te genereren die alle behalve die mutanten bevat waar genen die essentieel zijn voor bacteriegroei zijn verstoord. We hebben hoogstwaarschijnlijk niet gewerkt met een verzadigde mutantenbibliotheek, gezien de schattingen van essentiële genen in andere studies over Burkholderia sp. 28,29. Een niet-verzadigde bibliotheek helpt niettemin bij het verkennen van verschillende kandidaat-genen voor verdere studies met behulp van gerichte mutagenese. Vóór de experimenten is het ook belangrijk om te onthouden dat sommige transposons specifieke insertiedoelplaatsen hebben die de overvloed aan mutanten bij bepaalde loci in het genoom verhogen30. Van marinertranspononen is bekend dat ze zich richten op AT-locaties voor insertie31,en Tn5-transposons hebben een GC-bias32,33. Het opnemen van stappen tijdens bioinformatica-analyse om hotspots voor transposon-inserties te herkennen, zal helpen bij het beoordelen van eventuele distributiebias.

Hoewel gevoelig voor tegenslagen, kan een goed ontworpen transposon insertion sequencing-experiment een krachtig hulpmiddel zijn om veel voorwaardelijk belangrijke genen in bacteriën binnen één experiment te identificeren. Bijvoorbeeld, een dozijn genen in Burkholderia seminalis belangrijk voor de onderdrukking van orchideeblad necrose werden geïdentificeerd door transposon mutagenese en genomics te combineren34. Naast Burkholderiazijn verschillende adhesie- en motiliteitsgenen en transporters geïdentificeerd als belangrijke kolonisatiefactoren in Snodgrassella alvi-symbionten van Apis mellifera (Honeybee)22en in de Vibrio fischerii-symbionten van Euprymna-scolopes (Hawaiiaanse bobtailinktvis)23 met behulp van de transposon-insertie mutagenese-benadering.

Als alternatieve benadering kan transposonmutagenese worden gevolgd door screening op individuele mutanten met behulp van selectieve media in plaats van sequencing. Fenotypische screening of bioassays om tekortkomingen te identificeren, zoals beweeglijkheid, productie van bioactieve secundaire metabolieten of specifieke auxotrofieën, zijn haalbaar. Bijvoorbeeld, screening van een Burkholderia insecticola (opnieuw toegewezen aan het geslacht Caballeronia35)transposon mutant bibliotheek is de sleutel geweest bij het identificeren dat de symbionten motiliteitsgenen gebruiken voor het koloniseren van Riptortus pedestris, hun insectengastheer36. Bovendien werd met behulp van transposonmutagenese en fenotypische screening het biosynthetische genencluster voor de bioactieve secundaire metaboliet caryoynencine geïdentificeerd in Burkholderia caryophylli37. Een auxotrofische mutant van Burkholderia pseudomallei werd geïdentificeerd na transposon mutagenese en screening en is een mogelijk verzwakt vaccinkandidaat tegen melioidosis, een gevaarlijke ziekte bij mens en dier38. Transposon mutagenese en sequencing is dus een waardevolle benadering bij het bestuderen van de moleculaire eigenschappen van bacteriën die belangrijk zijn voor de interacties met hun respectieve gastheren in pathogene of mutualistische associaties.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben met betrekking tot de studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Junbeom Lee dankbaar voor het leveren van de E. coli WM3064 + pRL27-stam voor conjugatie en begeleiding in de procedure, Kathrin Hüffmeier voor het helpen bij het oplossen van problemen tijdens het genereren van mutantenbibliotheken en Prof. André Rodrigues voor het ondersteunen van insectenverzameling en vergunningsverwerving. Ook bedanken we Rebekka Janke en Dagmar Klebsch voor de ondersteuning bij het verzamelen en kweken van de insecten. We erkennen de Braziliaanse autoriteiten voor het verlenen van de volgende vergunningen voor toegang, verzameling en export van insectenspecimens: SISBIO-autorisatie nr. 45742-1, 45742-7 en 45742-10, CNPq-proces nr. 01300.004320/2014-21 en 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF en 20BR035212/DF). Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 en KA2846/6-1.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,6- Diaminopimelic AcidAlfa AesarB22391Voor E.coli WM3064+ pRL27
Agar - AgarRoth5210
AgaroseBiozym840004
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)Beckman CoulterA63880Size selection in step 6.6
Bleich (NaOCl) 12%Roth9062
Bowtie2 v.2.4.2Bioinformatisch hulpmiddel voor read mapping. Referentie 10 in hoofdmanuscript.
Buffer-SPeqlabPEQL01-1020Voor PCRs
Cell scraperSarstedt83.1830
Cutadapt v.2.10Bioinformatic hulpmiddel voor het verwijderen van specifieke adaptersequenties uit de reads. Referentie 8 in hoofdmanuscript.
DESeq2RStudio-pakket voor het beoordelen van differentiële mutantenovervloed. Meestal gebruikt voor RNAseq-analyse. Referentie 12 in hoofdmanuscript.
DNA ladder 100 bpRothT834.1
dNTPsLife TechnologyR0182PCR voor bevestiging van de succesvolheid van conjugatie
EDTA, Di-NatriumzoutRoth8043
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification KitLucigenMC85200
EthidiumbromideRoth2218.1
FastQC v.0.11.8Bioinformatic hulpmiddel voor het beoordelen van de kwaliteit van sequencingdata. Referentie 7 in hoofdmanuscript.
FeatureCounts v.2.0.1Bioinformatic hulpmiddel om read tellen per genomisch kenmerk te verkrijgen. Referentie 11 in hoofdmanuscript.
GlycerolRoth7530
K2HPO4RothP749
KanamycinsulfaatServa26899
KClMerck4936
KH2PO4Roth3904
MgSO4.7H2ORothPO27
Na2HPO4RothP030
NaClMerck6404
NEBNext Multiplex Oligos voor Illumina (Index primers set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA library prep kit voor IlluminaNew England BiolabsE7645S
Peptone (soja)Roth2365Voor Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA PolymeraseVWRPEQL01-1020PCR voor bevestiging van de succesvolheid van conjugatie
Petri schotels - 145 x 20 mmRothXH90.1Voor het selecteren van transconjuganten
Petri schotels - 90 x 16 mmRothN221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Duitsland)Qualiteitscontrole na DNA bibliotheekvoorbereiding
StreptavidinebeadsRothHP57.1
Taq DNA polymeraseVWR01-1020
Trimmomatic v.0.36Bioinformatic hulpmiddel voor het trimmen van lage kwaliteit reads en ook adaptersequenties. Referentie 9 in hoofdmanuscript.
Tris-HClRoth9090.1
TryptoneRoth2366Voor Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium
UltrasonicatorBandelinGM 70 HDVoor scheren
USER enzym (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)New England BiolabsE7645SLigation step 6.5.2
GistextractRoth2363

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
  2. Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
  3. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  4. Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172(2017).
  5. Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
  6. Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478(2018).
  7. Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
  8. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  9. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  10. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  11. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129(2016).
  14. Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
  15. Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
  16. Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330(2016).
  17. Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965(2019).
  18. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  19. Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068(2010).
  20. Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515(2021).
  21. Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
  22. Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
  23. Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
  24. Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
  25. Garcia, E. C. Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation. Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).
  26. Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948(2020).
  27. Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
  28. Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
  29. Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288(2016).
  30. Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926(2014).
  31. Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842(2017).
  32. Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3(2012).
  33. Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
  34. Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
  35. Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
  36. Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
  37. Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
  38. Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tn Seqsymbiotische bacteri nmutantenbibliotheekgendisruptiegastheerkolonisatieantibioticaresistentiecassette

Gerelateerde artikelen