Methodenartikel

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

DOI:

10.3791/62845

⸱

26 augustus 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) worden door alle celtypen vrijgegeven en spelen een belangrijke rol bij celsignalering en homeostase. De visualisatie van EV's vereist vaak indirecte methoden vanwege hun kleine diameter (40-250 nm), die onder de diffractielimiet van typische lichtmicroscopie ligt. We hebben een op superresolutiemicroscopie gebaseerde visualisatie van EV's ontwikkeld om de diffractielimiet in zowel twee als drie dimensies te omzeilen. Met behulp van deze aanpak kunnen we de driedimensionale vorm van EV's oplossen tot binnen +/- 20 nm resolutie op de XY-as en +/- 50 nm resolutie langs de Z-as. Concluderend stellen we voor dat superresolutiemicroscopie wordt beschouwd als een karakteriseringsmethode van EV's, inclusief exosomen, evenals omhulde virussen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraangebonden blaasjes die door alle celtypen worden afgegeven. Ze bevatten lipiden, eiwitten, metabolieten en nucleïnezuren en dragen deze materialen lokaal over tussen cellen en distaal tussen weefsels en organen. Er zijn drie primaire subtypen van EV's: apoptotische lichamen, microvesicles en exosomen1,2. Hier richten we onze discussie op exosomen en hun bijbehorende eiwitten.

Exosomen zijn uitgescheiden blaasjes afkomstig van de inwaartse ontluiking van vroege endosomen in het multivesiculaire lichaam (MVB). De MVB smelt vervolgens met het plasmamembraan, waardoor de exosomen in de extracellulaire ruimte vrijkomen om naar andere cellen te reizen3,4. Exosomen bestaan op een spectrum van groottes variërend van 40 tot 150 nm en zijn verrijkt met endosomale transmembraaneiwitten die bekend staan als tetraspaninen (CD9, CD63, CD81), membraangebonden endosomale sorteercomplex dat nodig is voor het transport (ESCRT) en lipide vlot-geassocieerde eiwitten1,2,5,6,7.

Het karakteriseren van de biochemische samenstelling van exosomen is een populair veld geworden voor onderzoekers om hun functionele aard beter te begrijpen. Er bestaan veel methoden voor het visualiseren en karakteriseren van exosomen, waaronder flowcytometrie op nanoschaal, nanodeeltjesvolganalyse (NTA), scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), oppervlakteplasmonresonantie, resistieve pulsdetectie en traditionele lichtmicroscopie, die elk intrinsieke voor- en nadelen bevatten8,9. TEM en cryo-EM kunnen een op nanometer gebaseerde resolutie bereiken, maar vereisen vaak uitdrogings- en vriesbreekstappen, waardoor EV's10, 11krimpen of liggen. NTA vertrouwt op lichtverstrooiing, waardoor de karakterisering van honderden EV's tegelijk mogelijk is, maar is een indirecte meting van de deeltjesgrootte en kan niet gemakkelijk onderscheid maken tussen EV's, virussen en eiwitaggregaten12,13,14,15,16. Nanoschaal flowcytometrie maakt gebruik van lichtverstrooiing van een excitatiepad, dat vervolgens kan worden vertaald in groottemetingen, maar is een opkomende technologie, en er is weinig consensus over welke grootte van deeltjes zich binnen het lineaire detectiebereik bevinden voor verschillende instrumenten12,17,18.

Traditionele lichtmicroscopie met behulp van fluorescerende eiwitten of kleurstoffen is een van de meest gebruikte technieken voor het visualiseren van subcellulaire compartimenten, eiwitcomplexen en signaleringsmachines in een cel. Hoewel deze techniek nuttig blijkt bij het visualiseren van de lokalisatie van complexen, voorkomt de diffractielimiet van traditionele lichtmicroscopie (ongeveer 250-400 nm) de duidelijke resolutie van eiwitten of structuren in het typische groottebereik van een exosoom (40-150 nm)12,19,20.

Superresolutiemicroscopie, namelijk directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM), onderscheidt zich van conventionele lichtmicroscopie door gebruik te maken van de fotoschakelbare eigenschappen van specifieke fluoroforen en deze knipperende gebeurtenissen te detecteren om beelden tot nanometerprecisie te reconstrueren21. Fotoswitchinggebeurtenissen worden verzameld met behulp van een detectiecamera met hoge framesnelheid in de loop van tienduizenden individuele belichtingen, en een puntspreidingsfunctie wordt gebruikt om met hoge betrouwbaarheid de exacte locatie van de fotoswitching fluorofoor19,20,22in kaart te brengen. Hierdoor kan dSTORM de diffractielimiet van lichtmicroscopie omzeilen. Verschillende groepen hebben het gebruik van superresolutietechnieken gemeld voor het visualiseren en volgen van exosomen en hun bijbehorende eiwitten22,23,24,25. De uiteindelijke resolutie hangt af van de biofysische eigenschappen van de fluorofoor, maar varieert vaak van +/-10-100 nm langs de XY-as, waardoor een resolutie van één molecuul mogelijk is.

Het vermogen om individuele fluoroforen op deze schaal op de XY-as op te lossen, heeft een revolutie teweeggebracht in de microscopie. Er zijn echter weinig gegevens over de driedimensionale (3D) dSTORM van een exosoom. Daarom hebben we geprobeerd een standaard operationele procedure (SOP) vast te stellen voor dSTORM-gebaseerde visualisatie en karakterisering van gezuiverde EV's, inclusief exosomen tot nanometerprecisie in 3D.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Voortplanting en onderhoud van cellijnen

  1. Verkrijg menselijke osteosarcoomcellen (U2OS) en plaats de cellen in het groeimedium aangevuld met 10% exosoomvrij foetaal runderserum en 1x penicilline / streptomycine-oplossing.
    OPMERKING: Exosoomvrij foetaal runderserum werd gegenereerd volgens het protocol dat wordt gepresenteerd in McNamara et. al.26.
  2. Houd de U2OS-cellen in een met koper beklede incubator op 37 °C in 5% CO2 en doorgangscellen in T175-kolven26,27. De cellen moeten in het midden van de logaritmische groeifase worden gehouden om te voorkomen dat subpopulaties ontstaan of dat apoptotisch puin tijdens de stationaire fase ontstaat.

2 Exosoom isolatie en zuivering

  1. Kweek de U2OS-cellijnen tot volledige confluentie in 10 afzonderlijke T175-kolven met 50 ml media per kolf. Verwijder het celsupernatant en passeer het achtereenvolgens door een vacuümfiltratieapparaat van 0,45 μm en 0,22 μm.
  2. Onderwerp het supernatant aan crossflowfiltratie (ook bekend als tangentiële stroomfiltratie) op een filtratiesysteem uitgerust met de 750 kDa holle vezelpatroon om kleinere eiwitten of metabolieten te verwijderen28.
    1. Passeer het supernatant door de tangentiële flowfiltratieoperator met een constante voorwaartse druk van 30 psi, terwijl een retentiedruk van <20 psi wordt gehandhaafd om een Δ druk van 10 of meer psi te produceren. Plaats een magnetische roerstaaf in de retentate tank en stel in op 150 rpm26.
    2. Houd de toevoersnelheid op 40 ml/min of hoger. Verzamel het permeaat in een reservoir en gooi het weg.
  3. Concentreer het supernatant tot 30 ml en breng vervolgens in evenwicht met vier volumes van 1x PBS. Verzamel de crossflow gefilterde en gebalanceerde oplossing in een conische buis van 50 ml.
  4. Laat de EV's 's nachts neerslaan bij 4 °C in een eindconcentratie van 40 mg/ml polyethyleenglycol met een molecuulgewicht van 8.000 Da. Centrifugeer de EV's bij 1.200 x g bij 4 °C gedurende 1 uur en resuspend in 500 μL van 1x PBS.
  5. Incubeer de EV's met 50 μg/ml fotoschakelbare rode membraanintercalerende kleurstof en 50 μg/ml RNase A in 1x PBS bij 4 °C gedurende 1 uur.
  6. Verwijder overtollige kleurstof door een kolom op een eiwitzuiveringssysteem dat is bevestigd aan een fractiecollector. Identificeer EV-fracties door uv-absorptie en bundel ze in een microcentrifugebuis26.
  7. Affiniteit-selecteer in totaal 200 μL EV's met behulp van anti-CD81 magnetische kralen in evenwicht gebracht in 1x PBS.
    1. Verdun 100 μL van de anti-CD81 magnetische kralen in 1x PBS tot een totaal volume van 1 ml en laat ze binden bij 4 °C gedurende 2 uur in een microcentrifugebuis van 2 ml met continu schommelen.
  8. Was de anti-CD81 kralen en EV drie keer met 1x PBS. Elute CD81+ EV uit de oplossing met 100 mM Glycine bij pH 2,0 gedurende 30 min bij 37 °C.
  9. Pipetteer de gezuiverde CD81+ EV in een gelijk volume van 100 mM Tris-HCl bij pH 7,5 in 1x PBS.
    OPMERKING: Een aliquot van gezuiverde CD81 + EV-oplossing kan worden gereserveerd voor Nanoparticle Tracking Analysis of elektronenmicroscopie om de zuiverheid van de oplossing en de aanwezigheid van EV's te bevestigen26.

3 Fixatie en voorbereiding

  1. Plaats affiniteitsgezuiverde EV's op μ 8-putplaten met glazen bodem in een totaal volume van 200 μL (kan EV-monster verdunnen in 100 mM Tris-HCl bij pH 7,5 in 1x PBS) en laat het oppervlak 's nachts bij 4 °C hechten.
  2. Zonder de bestaande oplossing van de 8-putplaat te verwijderen, bevestigt u EV's op de platen door 200 μL 4% paraformaldehyde in 1x PBS toe te voegen aan de EV-bevattende oplossing in elke put en laat u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur21incuberen .
  3. Verwijder zorgvuldig paraformaldehyde en overtollige oplossing met een micropipette om de EV's niet te storen. Was de EV met 1x PBS om overtollig paraformaldehyde te verwijderen. Voer de wasprocedure drie keer uit. Verwijder overtollige 1x PBS.
  4. Bereid 250 μL dSTORM B-cubed bufferoplossing per monster door een oplossing van 5 mM protocatechuaatdioxygenase (deel A) verdund in beeldvormingsbuffer (deel B) te maken volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: De concentratie van het enzym in de buffer kan worden verdubbeld tot 10 mM als fotobleeken optreedt.
    1. Voeg 250 μL van de voorbereide buffer toe aan elke put volgens het protocol van de fabrikant gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u zich afbeeldt om oxiderende moleculen op te ruimen.
      OPMERKING: De EV kan dan onmiddellijk worden bekeken of maximaal een week bij 4 °C worden bewaard. Vervang de buffer na opslag vóór elke visualisatie.

4 Directe stochastische optische reconstructie microscopie kalibratie

  1. Bereid de kralen voor die nodig zijn voor de kalibratie van de superresolutiemicroscoop door microsferen van 100 nm te verdunnen tot een concentratie van 0,5% in water van moleculair biologische kwaliteit en 200 μL te pipetteren in elke put van een glazen bodem μ-slide 8-well plaat.
    1. Laat de kralen 1 uur bij kamertemperatuur in de putten bezinken.
  2. Voeg zonder de bestaande oplossing te verwijderen 200 μL 4% paraformaldehyde in PBS toe aan elke put aan de kalibratiepareloplossing en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  3. Verwijder voorzichtig de paraformaldehyde met een micropipette om de kralen niet te storen en was de kralen drie keer met 1x PBS. Bereid de buffer voor volgens stap 3.4.
  4. Verwijder 1x PBS en voeg 250 μL van de voorbereide buffer toe aan elk putje. Laat de buffer 20 minuten zitten voordat u gaat visualiseren.
  5. Voordat u iets op het podium plaatst, maakt u verbinding met de 3D-microscoop met behulp van de knop De microscoop verbinden. Voeg 100x olie toe aan het objectief en plaats het midden van de put bovenop het objectief. Schakel in de instelling Acquire de excitatielasers van 473 en 640 nm in en klik op Weergeven.
    1. Zonder dat de 3D-lens is geactiveerd, bekijkt u de kralen onder de instelling voor fotonenverzadiging door te klikken op Het aantal fotonen in de opties voor beeldweergave. Stel de initiële laservermogens in op 8,4 mW voor de 473 nm laser en op 11,6 mW voor de 640 nm laser.
    2. Verlaag de focus van de laser tot ongeveer -300 nm of het brandpuntsvlak van de kalibratieparels om een duidelijke resolutie van de afzonderlijke kralen te produceren. Zodra het Z-vlak is scherpgesteld, past u de laservermogensniveaus verder aan om rekening te houden met variatie in elk gezichtsveld.
  6. Onder de instrumentfuncties, volledige 3D-mappingkalibratie en kanaalmappingkalibratie om de fouten op de X-, Y- en Z-as te verkrijgen. Stel het maximale aantal FOV's in op 20, het doelaantal punten op 4.000, de maximale afstand tussen kanalen op 5,0 pixels en de uitsluitingsradius tussen kanalen op 10,0 pixels tijdens de kalibratie van kanaaltoewijzing.
  7. Zorg ervoor dat de kalibratie een puntdekking van >90% oplevert en een kaartkwaliteit die goed is. Sla de gegeven kalibratiegegevens op voor toekomstige beeldacquisities.

5 Visualisatie van EV in drie dimensies

  1. Voeg 100x olie toe aan het objectief en plaats de voorbereide EV's in de microscoop. Zonder de geactiveerde 3D-lens schakelt u de 640 nm excitatielaser in en verhoogt u deze in eerste instantie tot tussen 1,2 mW en 12,5 mW, afhankelijk van de intensiteit van het signaal en het gezichtsveld om het rode membraan te prikkelen dat kleurstof gekleurd EV's intercaleert.
    1. Schakel onder de opties voor beeldweergave de weergavemethode over van fotonenverzadiging naar percentielen om de EV's beter te visualiseren. Pas het laservermogen aan om ruis te minimaliseren en tegelijkertijd het signaal te maximaliseren. Onderhoud alle andere parameters.
    2. Pas de focus van het Z-vlak aan door op het pictogram omhoog of omlaag op de Z-as te klikken.
      OPMERKING: Het Z-vlak moet worden scherpgesteld tussen -200 en -350 nm, maar zal variëren afhankelijk van het gezichtsveld.
  2. Stel de belichtingstijd in op 20 ms, de frameopname op 10.000 frames en het initiële laservermogen op tussen 1,2 mW en 12,5 mW, of het laservermogen bepaald in stap 5.1, afhankelijk van de intensiteit van het signaal en het gezichtsveld.
    1. Activeer de 3D-lens met behulp van het pictogram en start de acquisitie door op de knop Verwerven te klikken.
  3. Verhoog tijdens de beeldacquisitie het laservermogen met 3 stappen van 10 om de 1000 frames, of genoeg om een hoge signaal-ruisverhouding te behouden. Pas het Z-vlak niet aan tijdens de aanschaf.
    OPMERKING: De laser mag worden verhoogd tot een laservermogen van maximaal 90 mW.

6 Modificatie na aankoop en EV-tracing

  1. Schakel na de afbeeldingsacquisitie over naar het weergavevenster Analyseren. Voer afwijkingscorrectie uit op de ongefilterde afbeelding en activeer vervolgens filters. Pas het aantal fotonen, de lokalisatieprecisie, sigma's en frame-index aan volgens tabel 1.
  2. Overlay een XYZ-vlakweergavetool langs de X-as van afzonderlijke EV's vanuit het gezichtsveld en exporteer . CSV-bestanden van fotoswitchinggebeurtenissen.
  3. Bisect individuele EV's op de XY-as in een X bij Y gezichtsveld met behulp van een lijnhistogramtool, die foto-schakelgebeurtenissen in ingestelde afstandsgroepen opslaat.
  4. Maak afbeeldingen van afzonderlijke EV's en sla ze op als .tiff bestanden.
  5. Maak 3D-video's van individuele EV's met behulp van een 3D-visualisatietool en kleur volgens plaatsing langs de Z-as.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie was om de effectiviteit van superresolutiemicroscopie te evalueren bij het visualiseren van individuele EV's met nanometerresolutie in drie dimensies (3D). Om de vorm en grootte van individuele EV's te analyseren, gebruikten we fotoschakelbare kleurstof en incubeerden we de EV's met een verrode, membraanintercalerende kleurstof en verwijderden we overtollige kleurstof door middel van chromatografie29. De affiniteit-vastgelegde anti-CD81 en roodgekleurde EV's werden vervolg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV's zijn een populair studiegebied geworden vanwege hun belangrijke rol in veel intracellulaire processen en cel-naar-cel signalering1,30. Hun visualisatie blijkt echter moeilijk te zijn omdat hun kleine formaat onder de diffractielimiet van lichtmicroscopie valt. Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) is een directe visualisatiemethode die de diffractielimiet omzeilt door fotoswitchinggebeurtenissen van individuele fluoroforen in de lo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.G.C. heeft geen belangenconflicten te melden. R.P.M en D.P.D. ontvangen materiële steun van Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. en Cytiva Inc. (voorheen GE Healthcare). R.P.M. en D.P.D. verklaren tegenstrijdige belangen voor de mogelijke commercialisering van een deel van de gepresenteerde informatie. Deze worden beheerd door de Universiteit van North Carolina. De financieringsbronnen waren niet betrokken bij de interpretaties of het schrijven van dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Oxford Nanoimaging bedanken voor hun constructieve feedback en begeleiding. Dit werk werd gefinancierd door de 5UM1CA121947-10 aan R.P.M. en de 1R01DA040394 aan D.P.D.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin oplossingGibco15140-122
50 mL conische buisThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuümfiltratieapparaatGenesee25-227
750 kDa holle-vezel cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetische kralenThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 FractiecollectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 KolomCytiva17548151
Moleculair Biologie Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingAangepast
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
PolyethyleenglycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlaskenGenesee25-211
Tetraspek microsferenInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262(2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866(2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949(2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474(2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020(2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016(2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561(2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511(2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138(2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344(2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279(2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251(2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969(2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424(2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23(2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellular VesiclesSuper Resolution MicroscopyDirect Stochastic Optical ReconstructionThree Dimensional ImagingdSTORM MicroscopyExosome VisualizationVirus Particle ImagingPhotoswitching EventsSize Distribution AnalysisCalibration Beads

Gerelateerde artikelen