Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Extracellulaire blaasjes (EV's) worden door alle celtypen vrijgegeven en spelen een belangrijke rol bij celsignalering en homeostase. De visualisatie van EV's vereist vaak indirecte methoden vanwege hun kleine diameter (40-250 nm), die onder de diffractielimiet van typische lichtmicroscopie ligt. We hebben een op superresolutiemicroscopie gebaseerde visualisatie van EV's ontwikkeld om de diffractielimiet in zowel twee als drie dimensies te omzeilen. Met behulp van deze aanpak kunnen we de driedimensionale vorm van EV's oplossen tot binnen +/- 20 nm resolutie op de XY-as en +/- 50 nm resolutie langs de Z-as. Concluderend stellen we voor dat superresolutiemicroscopie wordt beschouwd als een karakteriseringsmethode van EV's, inclusief exosomen, evenals omhulde virussen.
Inleiding
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraangebonden blaasjes die door alle celtypen worden afgegeven. Ze bevatten lipiden, eiwitten, metabolieten en nucleïnezuren en dragen deze materialen lokaal over tussen cellen en distaal tussen weefsels en organen. Er zijn drie primaire subtypen van EV's: apoptotische lichamen, microvesicles en exosomen1,2. Hier richten we onze discussie op exosomen en hun bijbehorende eiwitten.
Exosomen zijn uitgescheiden blaasjes afkomstig van de inwaartse ontluiking van vroege endosomen in het multivesiculaire lichaam (MVB). De MVB smelt vervolgens met het....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Voortplanting en onderhoud van cellijnen
- Verkrijg menselijke osteosarcoomcellen (U2OS) en plaats de cellen in het groeimedium aangevuld met 10% exosoomvrij foetaal runderserum en 1x penicilline / streptomycine-oplossing.
OPMERKING: Exosoomvrij foetaal runderserum werd gegenereerd volgens het protocol dat wordt gepresenteerd in McNamara et. al.26. - Houd de U2OS-cellen in een met koper beklede incubator op 37 °C in 5% CO2 en doorgangscellen in T175-kolven26,27. De cellen moeten in het midden van de logaritmische groeifase worden gehouden om te voorkomen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het doel van deze studie was om de effectiviteit van superresolutiemicroscopie te evalueren bij het visualiseren van individuele EV's met nanometerresolutie in drie dimensies (3D). Om de vorm en grootte van individuele EV's te analyseren, gebruikten we fotoschakelbare kleurstof en incubeerden we de EV's met een verrode, membraanintercalerende kleurstof en verwijderden we overtollige kleurstof door middel van chromatografie29. De affiniteit-vastgelegde anti-CD81 en roodgekleurde EV's werden vervolg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
EV's zijn een populair studiegebied geworden vanwege hun belangrijke rol in veel intracellulaire processen en cel-naar-cel signalering1,30. Hun visualisatie blijkt echter moeilijk te zijn omdat hun kleine formaat onder de diffractielimiet van lichtmicroscopie valt. Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) is een directe visualisatiemethode die de diffractielimiet omzeilt door fotoswitchinggebeurtenissen van individuele fluoroforen in de lo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
M.G.C. heeft geen belangenconflicten te melden. R.P.M en D.P.D. ontvangen materiële steun van Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. en Cytiva Inc. (voorheen GE Healthcare). R.P.M. en D.P.D. verklaren tegenstrijdige belangen voor de mogelijke commercialisering van een deel van de gepresenteerde informatie. Deze worden beheerd door de Universiteit van North Carolina. De financieringsbronnen waren niet betrokken bij de interpretaties of het schrijven van dit manuscript.
Dankbetuigingen
We willen Oxford Nanoimaging bedanken voor hun constructieve feedback en begeleiding. Dit werk werd gefinancierd door de 5UM1CA121947-10 aan R.P.M. en de 1R01DA040394 aan D.P.D.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin oplossing | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conische buis | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuümfiltratieapparaat | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa holle-vezel cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetische kralen | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fractiecollector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Kolom | Cytiva | 17548151 | |
| Moleculair Biologie Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Aangepast | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethyleenglycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasken | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microsferen | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
Referenties
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
