Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Samenvatting

Een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie voor de absolute kwantificering van inositolpyrosfaten uit zoogdiercelextracten wordt beschreven.

Samenvatting

Inositol pyrofosfaten (PP-InsPs) zijn een belangrijke groep van intracellulaire signaalmoleculen. Afgeleid van inositolfosfaten (InsP's), deze moleculen kenmerken de aanwezigheid van ten minste één energetisch pyrofosfaat deel op de myo-inositol ring. Ze bestaan alomtegenwoordig in eukaryoten en werken als metabole boodschappers die fosfaathomeostase, insulinegevoeligheid en cellulaire energielading onderzoeken. Vanwege de afwezigheid van een chromofoor in deze metabolieten, een zeer hoge ladingsdichtheid en een lage abundantie, vereist hun analyse radioactieve tracer, en dus is het ingewikkeld en duur. Hier presenteert de studie een gedetailleerd protocol om absolute en hoge doorvoerkwantificering van inositolpyrofosfaten uit zoogdiercellen uit te voeren door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie (CE-ESI-MS). Deze methode maakt de gevoelige profilering van alle biologisch relevante PP-InsPs-soorten in zoogdiercellen mogelijk, waardoor basisscheiding van regio-isomeren mogelijk wordt. Absolute cellulaire concentraties van PP-Insp's, inclusief kleine isomeren, en monitoring van hun temporele veranderingen in HCT116-cellen onder verschillende experimentele omstandigheden worden gepresenteerd.

Inleiding

Sinds de eerste ontdekking van myo-inositol pyrofosfaten (PP-Insp's) in 1993 ^1,2, is aanzienlijke vooruitgang geboekt om hun biosynthese, omzet en functies op te helderen³. Inositolpyrosfaten komen alomtegenwoordig voor in eukaryote cellen⁴ en dienen als metabole signaalmoleculen die kritisch betrokken zijn bij bijvoorbeeld fosfaathomeostase ^5,6, insulinegevoeligheid⁷, calciumoscillaties ^8,9, vesiculaire handel¹⁰, apoptose¹¹, DNA-reparatie¹², immuunsignalering¹³ , en anderen. De overvloed aan belangrijke processen onder de controle van inositol pyrofosfaten vraagt om een dieper begrip van hun cellulaire overvloed, fluctuatie, en lokalisatie.

Hoewel Insp's en PP-Insp's de aandacht trokken in verschillende disciplines, wordt de analyse van hun abundantie routinematig uitgevoerd met behulp van een methode die in de jaren '80 is ontwikkeld, bestaande uit het labelen van cellen met tritiated inositol, waarbij de geëxtraheerde PP-InsP's worden opgelost door sterke anionenuitwisselingschromatografie Sax-HPLC met daaropvolgende scintillatietelling. Nieuwere methoden op basis van massaspectrometrie worden nog steeds geconfronteerd met aanzienlijke uitdagingen: inositolpyrofosfaat met maximaal acht fosfaateenheden herbergen fosfaatesters en anhydriden, wat leidt tot een aanzienlijke negatieve lading en potentieel fosfaatverlies tijdens ionisatie. Er zijn vier belangrijke soorten PP-Insp's gevonden bij zoogdieren (figuur 1): 1,5-(PP)2-InsP₄ (of 1,5-InsP₈), 5-PP-InsP₅ (of 5-InsP₇), 1-PP-InsP₅ (of 1-InsP₇) en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ (of 5-PP-InsP₄)^3,14. De fysiologische niveaus van PP-Insp's liggen meestal in het nano- tot lage micromolaire bereik, met 5-PP-InsP₅ als de meest voorkomende met cellulaire concentraties van 0,5 - 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP₄ en 1-PP-InsP₅ worden verondersteld tot ongeveer 10% van de 5-PP-InsP_5-pool te zijn en blijven moeilijk te traceren in veel cellen¹⁵. 5-PP-InsP₄ met een vrije OH-groep is nog lager in overvloed en wordt meestal alleen detecteerbaar wanneer fosfaathydrolasen worden geremd met natriumfluoride (NaF)¹⁶.

De hoge ladingsdichtheid van PP-Insp's maakt hun scheiding moeilijk, en het optreden van PP-InsP-regio-isomeren bemoeilijkt deze inspanningen verder. Als gevolg hiervan vertrouwden de meeste experimenten op kwantificering door metabole radioactieve etikettering van cellen met behulp van [³H] -inositol, omdat achtergrond uit de matrix is uitgesloten en hoge gevoeligheid wordt bereikt^17,18. Deze methode is echter kostbaar, tijdrovend en maakt het niet mogelijk om gerelateerde PP-InsP-regio-isomeren goed te onderscheiden. Bovendien, [³H] -inositol etikettering is niet verantwoordelijk voor endogene inositol synthese uit glucose. Een op polyacrylamide gel-elektroforese (PAGE) gebaseerde methode is een veel toegepast goedkoop alternatief, maar beperkt in zijn gevoeligheid 19,20,21,22. Andere benaderingen die radiolabeling vermijden, zijn gepubliceerd, waaronder ionchromatografie gevolgd door postkolomderivatisatie UV-detectie²³, hydrofiele interactiechromatografie (HILIC)²⁴ of zwakke anionenuitwisseling (WAX) in combinatie met massaspectrometrie (MS)²⁵. Ze zijn echter (nog) niet op gelijke voet met het klassieke [³H]-inositol SAX-HPLC protocol.

Onlangs werd capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie (CE-ESI-MS) geïntroduceerd als een transformatieve strategie voor de analyse van Insp's en PP-InsPs metabolisme, die voldoen aan alle vereisten die hierboven¹⁶ zijn besproken. In combinatie met de huidige state-of-the-art InsP-extractie door perchloorzuur gevolgd door verrijking met titaandioxidekorrels²⁶, slaagde CE-ESI-MS in elk tot nu toe getest organisme, van gist tot planten en zoogdieren. Gelijktijdige profilering van Insp's en PP-Insp's, inclusief alle mogelijke regio-isomeren, was gemakkelijk te bereiken. Stabiele interne standaarden (SIL) met isotooplabel maakten een snelle en nauwkeurige absolute kwantificering mogelijk, ongeacht matrixeffecten. Omdat MS isotopische massaverschillen kan opvangen, kan CE-ESI-MS ook worden toegepast om gecompartimenteerde cellulaire syntheseroutes van InsP's en PP-Insp's te bestuderen, bijvoorbeeld door cellen te voeden met [¹³C₆]-myo-inositol of [¹³C₆]-D-glucose.

Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol beschreven voor de absolute kwantificering van PP-Insp's en Insp's uit zoogdiercellen door CE-ESI-MS. Naast het belangrijkste 5-PP-InsP₅ isomeer, worden ook 1,5-(PP)2-InsP₄ en 1-PP-InsP₅ gekwantificeerd in deze studie, ondanks hun lagere abundantie. Twee HCT116-cellijnen van verschillende laboratoria (NIH, UCL) worden bestudeerd en er is gevalideerd dat HCT116^UCL-cellen 7-voudig hogere niveaus van 1,5-(PP)2-InsP₄ bevatten dan gevonden in HCT116^NIH, terwijl 5-PP-InsP_{5-concentraties} vergelijkbaar zijn. Bovendien is de 1-PP-InsP_5-synthese in HCT116^UCL niet significant verhoogd. Ook wordt de toename van PP-InsP-niveaus door hun defosforylering met natriumfluoride kwantitatief bestudeerd.

Protocol

1. Opzetten van het CE-ESI-MS-systeem

1. Zet een CE-ESI-MS-systeem op dat bestaat uit een commercieel CE-systeem - en een drievoudige quadrupole tandem massaspectrometer, uitgerust met een Agilent Jet Stream (AJS) elektrospray ionisatie (ESI) bron. Een CE-ESI-MS spuitset en een isocratische LC (Liquid Chromatography) pomp zijn vereist.
2. Sluit de manteldebiet 1:100 splitter (meegeleverd in de CE-MS spuitset) en de isocratische LC pompuitlaat aan.
3. Zorg ervoor dat de injectieflacon van het CE-systeem zich op dezelfde hoogte bevindt als de sproeipunt van de massaanalysator.
4. Gebruik het MassHunter Workstation (versie 10.1) of vergelijkbare MS-software om het hele systeem te besturen en voor gegevensverzameling en -analyse.

2. Buffer-, capillair- en CE-MS-systeem voorbereiden

1. Ce-loopbuffer voorbereiden: Stel de pH van 40 mM ammoniumacetaat in op 9,0 met ammoniumhydroxide. Een maatkolf van 250 ml wordt aanbevolen. Filtreer de buffer van 250 ml met membraanfilters ter grootte van 0,2 μm. Zorg ervoor dat u alleen ultrazuiver gedeïoniseerd water en REAGENTIA van MS-kwaliteit gebruikt.
   OPMERKING: Deze buffer kan 2-3 weken of enkele maanden in een koelkast op kamertemperatuur worden bewaard.
2. Bereid mantelvloeistof: Meng 100 ml ultrazuiver water en 100 ml isopropanol van LC-MS-kwaliteit in een fles van 250 ml. Vervang de mantelvloeistof minstens één keer per week. Voeg massareferentie toe aan de mantelvloeistof bij gebruik van een massaspectrometer met hoge resolutie.
3. Mantelvloeistof installeren: spoel gedurende 5 minuten op 5 ml/min en stel het debiet in op 1 ml/min (10 μl/min in de CE-MS-sproeier). De pompdruk zal op ca. 180 bar liggen. Zorg ervoor dat de recyclebuis weer aansluit op de vloeibare fles om het oplosmiddel opnieuw te gebruiken.
4. Capillair bereiden: Koop een CE-MS capillair (50 μm i.d. en 365 μM o.d. met een lengte van 125 cm) met een UV-detectievenster. De gebruiker kan ook veel goedkopere staafgesmolten silicacapillairen verkrijgen bij gespecialiseerde distributeurs. Snijd een capillair met een lengte van 100 cm. Snijd beide capillaire uiteinden goed met een capillaire kolomsnijder met een roterend diamantblad en verwijder 2-3 cm polyimidecoating aan beide uiteinden met een aansteker. Reinig het capillaire oppervlak met isopropanol.
5. Capillair installeren: Giet het capillair in de CE-MS-cassette. Klik op de knop Cassette wijzigen en installeer de cassette in het CE-apparaat. Het inlaatuiteinde van het capillair is ongeveer 2 mm lager dan de elektrode. Zorg ervoor dat het inlaatuiteinde tijdens het injectieproces lager is dan het oppervlak van het monster.
6. Activeer capillair: Spoel het capillair voor het eerste gebruik door met 1 M NaOH, gevolgd door water gedurende 10 minuten en CE-loopbuffer gedurende 15 minuten.
7. Steek het capillaire uiteinde in de CE-MS-sproeier: plaats het capillair voorzichtig in de CE-MS-sproeier en zorg ervoor dat het capillaire uiteinde ongeveer 0,1 mm uit de spuitpunt steekt. Zorg ervoor dat u het capillaire uitlaateinde nauwkeurig afstelt met een vergrootglas en de stelschroef in de sproeier. Steek de sproeier terug in de ionenbron en raak de stelschroef niet aan. De MS staat in de stand-bymodus wanneer u deze bewerking uitvoert.
8. ESI-spray controleren: Controleer de stabiliteit van de ESI-sproeier in de volledige scanmodus. De fluctuatie van totale ionenelektroferogrammen moet binnen 5% liggen.
9. Voer een testrun uit met InsP-normen: gebruik een mengsel van 2 μM InsP 3-InsP_8-normen (aangepast door kwantitatieve ³¹P NMR^15,27) voor testruns met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s (10 nL). Stel de gedetailleerde ESI- en MS-parameters in zoals weergegeven in tabel 1. De CE-stroom is ca. 26 μA. De piekbreedte is ongeveer 0,4-0,5 min. Zorg ervoor dat de signaal-ruisverhouding ten minste 400 bereikt.

3. Extractie van oplosbare inositolfosfaten uit zoogdiercellen

OPMERKING: HCT116^NIH-cellen waren een vriendelijk geschenk van Stephen Shears²⁸. HCT116^UCL-cellen waren afkomstig uit Saiardi's Lab²⁶.

1. Zaaicellen
   1. Kweek HCT116^NIH - of HCT116^UCL-cellen in T75-kolven bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer met een hoge luchtvochtigheid van 5% (verder aangeduid als standaardomstandigheden) in Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
   2. Was de HCT116^NIH - en HCT116^{UCL-stamculturen} met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (5 ml) en incubeer de cellen met trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (3 ml, 0,25%) onder standaardomstandigheden totdat ze volledig zijn losgemaakt. Doof trypsine-activiteit door medium (7 ml) toe te voegen, verzamel de cellen in een centrifugebuis en centrifugeer (200 x g, 3 min).
   3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in medium (10 ml). Tel de cellen en bepaal de levensvatbaarheid via trypan blue exclusion.
   4. Zaai de cellen (6 miljoen HCT116-cellen per test) in een schaal van 150 mm en pas in totaal 20 ml celkweekmedium aan. Meng het medium en de cellen in een centrifugebuis voordat u gaat zaaien om een gelijke verdeling van de cellen in de schotel te bereiken. Bereid een parallelle schotel wanneer normalisatie op celnummer vereist is.
   5. Kweek de cellen onder standaardomstandigheden gedurende 72 uur. De cellen bereiken ongeveer 80% -90% samenvloeiing.
2. Modulatie van inositolfosfaat niveaus met NaF en cel oogsten
   1. NaF-behandeling: Voeg NaF (10 mM) 1 uur toe voordat u het in het medium oogst. Meng het medium door de plaat/pipettering te draaien en incubeer de cellen gedurende 60 minuten onder standaardomstandigheden.
   2. Verwijder na de NaF-behandeling het medium uit de cellen en plaats de cellen op ijs.
   3. Was de cellen twee keer met PBS (5 ml, 4 °C) en verwijder de PBS volledig uit de schaal.
   4. Voeg perchloorzuur (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C) toe. Zorg ervoor dat u het hele oppervlak bedekt met PA (de cellen worden wit als eiwitten neerslaan). Incubeer de cellen gedurende 10 minuten op een kanteltafel bij 4 °C.
   5. Verzamel PA in een centrifugebuis en verwijder het verontreinigende vuil door centrifugering (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Voeg het supernatant toe aan de voorbereide TiO_2-kralen voor het afzetten van Insp's.
   6. Was de naextractieschaal tweemaal met PBS (5 ml, r.t.) voor ontzuring; verwijder PBS volledig uit de schaal.
   7. Verzacht de eiwitten op de plaat via de toevoeging van cellysisbuffer (1,5 ml, r.t.; 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS] in 0,1 M NaOH). Incubeer het gerecht gedurende 15 minuten op een kanteltafel bij r.t. Breng het cellysaat over in een centrifugebuis en centrifugeer (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Bewaar het supernatant bij -80 °C totdat de eiwitconcentratie wordt bepaald via de DC-eiwittest met runderserumalbumine als kalibratiestandaard (meestal bevat één schaal van 150 mm ongeveer 10 mg eiwitten).
   8. Bepaling van celaantallen uit parallelle schotels: Oogst de cellen van de parallelle schotel via trypsine zoals beschreven in stap 3.1.2 (gebruik 5 ml trypsine-EDTA voor de schaal van 150 mm) en verwijder het medium. Resuspendeer de celpellet in PBS (5 ml), meng goed en tel de cellen. Voer deze stap vlak voor de oogst uit via direct blussen om representatieve celtellingen te verkrijgen. Meet bovendien het volume van de cellen met een geschikte methode (bijvoorbeeld met een multisizermachine).
3. TiO₂ verrijking van inositolfosfaten
   OPMERKING: Om zure ontleding van gefosforyleerde verbindingen te voorkomen, voert u alle verrijkingsstappen uit tot elutie op ijs en koelt u alle reagentia af tot 4 °C. Beperk de tijd voor de extractie tot een minimum (1,5-2 uur). Voer alle extractiestappen uit met 1 M PA.
   1. Bereiding van kralen: Was TiO_2-kralen (5 mg per monster) met ddH₂O (1 ml) en centrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Verwijder ddH₂O en was de kralen met PA (1 ml). Verwijder PA door centrifugeren (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Resuspendeer de kralen in PA (50 μL per monster).
   2. Voeg het supernatant dat gefosforyleerde verbindingen bevat (vergelijk punt 3.2, stap 3.2.5) toe aan de kragelsuspensie, vortex en draai het monster vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C.
   3. Centrifugeer het monster (3.500 x g, 1 min, 4 °C) en gooi het supernatant weg. Was de kralen met PA (500 μL) en centrifugeer (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Gooi het supernatant weg en herhaal de wasstap.
   4. Voeg NH₄OH (200 μL, 3%) toe aan de kralen en resuspend. Draai het monster gedurende 5 minuten op r.t.
   5. Centrifugeer het monster (3.500 x g, 1 min) en breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis.
   6. Herhaal de elutiestappen 3.3.4 en 3.3.5 en combineer de eluenten. Gooi de kralen weg.
   7. Centrifugeer de gecombineerde eluenten (17.000 x g, 1 min, 4 °C) om eventuele onoplosbare residuen te verwijderen.
   8. Droog het supernatant volledig onder vacuümverdamping (70 min, 60 °C, V-AQ). Voeg ddH₂O (50 μL) toe aan de gedroogde extracten die InsP's bevatten. Vortex om het monster te mengen tot het volledig is opgelost. Bewaar het monster bij -20 °C tot de CE-ESI-MS-analyse.

4. Uitvoeren van de CE-ESI-MS runs

1. Bereid een mengsel van interne standaarden met 40 μM [¹³C₆]1,5-(PP)2-InsP₄, 80 μM [¹³C₆]5-PP-InsP₅, 80 μM [¹³C₆]1-PP-InsP₅, 400 μM [¹³C₆]InsP₆ en 400 μM [¹³C₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅. Bepaal de concentraties van SIL IS-oplossingen met kwantitatieve ³¹P en ¹H NMR, met behulp van een gecertificeerde referentiestandaard, d.w.z. fosfazijnzuur.
   OPMERKING: Alle boven SIL interne normen (IS) met zuiverheiden hoger dan 96% werden gesynthetiseerd en geleverd door Fiedler groep^15,27. Net als bij nucleotiden kunnen deze IS veel kristalwatermoleculen en diverse tegenionen dragen. In plaats van de stof te wegen en de concentratie te berekenen, wordt aanbevolen de concentratie te bepalen met ¹³C₆ standaardoplossingen met kwantitatieve ³¹P NMR.
2. Meng 10 μL van het monster met 0,5 μL intern standaardmengsel in een injectieflacon met CE-monster. 2 μM [¹³C₆]1,5-(PP)2-InsP₄, 4 μM [¹³C₆]5-PP-InsP₅, 4 μM [¹³C₆]1-PP-InsP₅, 20 μM [¹³C₆]InsP₆ en 20 μM [¹³C₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅ zijn de eindconcentraties in de monsters.
3. Wanneer u het bevoorradingssysteem gebruikt, klikt u op de knop Fles wijzigen , plaatst u de voorbereide 250 ml CE-loopbuffer in de elektrolytfles en klikt u op Schone buizen. Bewaar de vulnaald in een injectieflacon met water.
4. Stel ESI- en MS-parameters in zoals weergegeven in tabel 1. Optimaliseer de bronparameters met behulp van een Source Optimizer met een mengsel van inositol polyfosfaat normen. Verkrijg de mrm-instellingen (multiple reaction monitoring) met Masshunter Optimizer met alle standaarden. Pas de ESI- en MS/MS-instellingen aan voor verschillende instrumentatie.
5. Voer een run uit voor de InsP-extracten en controleer het resultaat (figuur 2). Stel een volgorde in wanneer er meer voorbeelden zijn.
6. Laat de MS na metingen in de stand-bymodus staan. Schakel de LC-pomp niet uit. De stroom van mantelvloeistof beschermt de spuitnaald. Vervang de CE-ESI-MS-sproeier door een LC-ESI-MS-sproeier wanneer er geen toevoer van mantelvloeistof is.

5. Data-analyse

1. Open kwantitatieve analyse (voor QQQ) software, maak een batch voor alle monsters.
2. Maak een nieuwe methode op basis van de verkregen MRM-gegevens. Stel de [¹³C₆]Insp's in als interne standaarden - (ISTD). Controleer mrm compound setup, retention time setup, ISTD setup, concentration setup en qualifier setup. Geef de validatie door en sluit af om de methode toe te passen op de huidige batch. Sla de methode op.
3. Controleer of elke piek in de batch goed is geïntegreerd; anders de piek handmatig integreren.
4. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet. Voer de kwantificering van inositol (pyro)fosfaten uit door de analytpiekrespons te vergelijken met de respectieve piekrespons van SIL IS met bekende concentraties. Theoretische en experimentele kalibratiecurven zijn weergegeven in tabel 2 voor 5-PP-InsP₅, InsP₆ en Ins(1,3,4,5,6)P₅ met het lineaire bereik.
   OPMERKING: De voorwaarde voor het toepassen van de theoretische kalibratiecurve is het gebruik van een hoogwaardig isotopisch patroon van gerichte analyten en met een geloofwaardige concentratie. Evalueer het lineaire bereik. Een kalibratiecurve is essentieel voor absolute kwantificering wanneer de volledige verwerving van de bovengenoemde isotopische normen onpraktisch is.
5. Bereken met de gemeten concentratie in de InsP-extractoplossing en het volume ervan de absolute hoeveelheden. Normaliseer verder de hoeveelheid door celtellingen of eiwitgehalte. Bereken de cellulaire concentratie op basis van het aantal cellen en het gemiddelde celvolume van HCT116 (1,68 fL).

Resultaten

De hier getoonde resultaten zijn bedoeld om het potentieel van CE-ESI-MS-analyse te illustreren. De gerapporteerde cijfers beschrijven een technisch foutloze CE-ESI-MS-run. Ten eerste wordt een mengsel van inositolpyrofosfaatnormen (figuur 1) en een zoogdiercelextract (figuur 2) gepresenteerd. Ten tweede wordt een vergelijking gegeven van twee HCT116-cellijnen (figuur 3) en met NaF behandelde HCT116 (figuur 4) cellen.

Geëxtraheerde ionenelektroferogrammen (EIE's) van inositol (pyro)fosfaatstandaarden met een concentratie van 2 μM zijn weergegeven in figuur 1. Metabolisme van inositolpyrosfaten bij zoogdieren met hun vereenvoudigde structuren wordt ingevoegd. De vier inositolpyrosfaten bij zoogdieren, 1,5-(PP)2-InsP₄, 5-PP-InsP₅, 1-PP-InsP₅ en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ worden goed onderscheiden met behulp van de beschreven methode. Een CE-ESI-MS run van HCT116^UCL is afgebeeld in figuur 2. Met behulp van stabiele interne standaarden met isotooplabel (SIL) kan een absolute kwantificering gemakkelijk worden bereikt door de signaalrespons te vergelijken met de spiked-in SIL van de bekende concentratie. De geïntegreerde EIE's van het inositolfosfaat van InsP₅ tot (PP)2-InsP₄ en niet-geïntegreerde EIE's van hun isotopische patronen worden weergegeven. RSD's van alle analyten van zes technische herhalingen liggen binnen 4%. Met de gemeten concentratie en het volume van extracten kan de hoeveelheid analyten worden berekend. Met het celaantal en het celvolume, of eiwitgehalte, zijn absolute cellulaire concentratie (μM) of hoeveelheid genormaliseerd door eiwitgehalte (pmol / mg eiwit) meestal de uiteindelijke uitkomsten van een dergelijke analyse.

Volgens een eerdere studie hebben twee batches van diverged HCT116-cellen een variatie van InsP_8-niveaus, HCT116^UCL-cellen bevatten 6-voudig hogere niveaus van InsP₈ dan HCT116^{NIH-cellen 29}. Met de CE-MS-methode kan 1,5-(PP)2-InsP₄ in HCT116^NIH gemakkelijk worden gekwantificeerd (figuur 3) en HCT116^UCL-cellen bevatten 7-voudig hogere niveaus van InsP₈ dan in HCT116^NIH. Bovendien wordt een significante accumulatie van 1,5-(PP)2-InsP₄ in HCT116^UCL-cellen parallel getrokken door een significant verhoogde 1-PP-InsP₅, die nu kwantitatief wordt weergegeven in figuur 3.

PP-InsP-niveaus nemen toe door hun defosforylering te remmen met behulp van natriumfluoride. CE-ESI-MS-analyse van met NaF behandelde HCT116^NIH-cellen toonde de -5-PP-InsP_5-verhoging aan, samen met een vermindering van InsP₆ en een verschijning van 5-PP-Ins (1,3,4,6) P₄ (figuur 4). Bovendien is de verhoging van InsP_8-niveaus merkbaar, terwijl 1-PP-InsP₅ tot op zekere hoogte afneemt. 1-PP-InsP₅ is niet volledig afwezig bij met NaF behandelde HCT116^NIH, maar meestal onder de detectiegrens of kwantificering.

Figuur 1: Typische geëxtraheerde ionenelektroferogrammen (EIE's) van inositol (pyro)fosfaatnormen in CE-ESI-MS-analyse met behulp van het beschreven protocol. De concentratie van elke analyt is 2 μM. Het geïnjecteerde monstervolume is ca. 10 nL met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s. Inserts tonen het metabolisme van inositol pyrofosfaten bij zoogdieren. IPPK: inositol pentakisfosfaat 2-kinase, IP6K: inositol hexakisfosfaatkinase, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfaatkinase, DIPP1: difosfoinositolpolyfosfaatfoshydrolase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatief InsP-profiel van HCT116^UCL-cellen. (A) EIE's van de belangrijkste inositol (pyro)fosfaten in HCT116^NIH en spiked SIL ISs 2 μM [¹³C₆]1,5-(PP)2-InsP₄ (1), 4 μM [¹³C ₆]5-PP-InsP₅ (2), 4 μM [¹³C₆]1-PP-InsP₅ (3), 20 μM [¹³C₆]InsP₆ (4), en 20 μM [¹³C₆]Ins(1,3,4,5,6)P₅ (5). Inserts tonen zes technische herhalingen van InsP-analyse door CE-ESI-MS, gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD. (B) Cellulaire concentratie van PP-InsP's en InsP's in menselijke cellijnen HCT116^UCL en (C) PP-InsP's en InsP's hoeveelheid genormaliseerd door eiwitgehalte. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Variatie in InsP₈ niveaus tussen twee diverged HCT116 cellen. A) EIEs van inositolpyrofosfaat inHCT116^UCL en HCT116^NIH. InsP₈ in HCT116^UCL is aanzienlijk overvloediger dan in HCT116^NIH. (B) Verhouding van inositolpyrofosfaat tot InsP₆ (%) in beide HCT116-cellen. HCT116^UCL-cellen bevatten 7-voudig hogere niveaus van InsP₈ in vergelijking met in HCT116^NIH, terwijl de 5-PP-InsP_5-niveaus gelijk zijn. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Inositol (pyro)fosfaat niveaus in HCT116^NIH cellen, met NaF behandeling. (A) EIE's van inositol (pyro)fosfaat in HCT116^NIH met natriumfluoridebehandeling (NaF, 10 mM). Niveaus van inositolpyrofosfaat, waaronder 1,5-(PP)2-InsP₄, 5-PP-InsP₅ en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 verhogen via_het blokkeren van hun defosforylering met behulp van NaF. (B) Inositol (pyro)fosfaat niveaus (hoeveelheden worden genormaliseerd door eiwitgehalte) in onbehandelde en NaF-behandelde HCT116^NIH cellen. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: CE-ESI-MS parameterinstellingen. Source parameter en iFunnel parameters worden geoptimaliseerd door Source en iFunnel Optimizer. MSM parameter instellingen voor inositol (pyro)fosfaten worden geoptimaliseerd door MassHunter Optimizer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Theoretische en experimentele regressievergelijking. De concentratie van [¹³C₆]5-PP-InsP₅ [¹³C₆]InsP₆ en [¹³C₆]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P₅ is respectievelijk 4 μM, 20 μM en 20 μM. Voor regressievergelijking is de 5-PP-InsP_{5-concentratie} op 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP₆ en Ins (1, 3, 4, 5, 6)P₅ concentratie is op 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x is concentratie, y is (Area InsP)^12C/(Area InsP)^13C. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Hier gepresenteerd is een praktische en gevoelige methode voor de kwantificering van sterk geladen inositol pyrofosfaten in zoogdiercellen. Door deze analysebenadering te combineren met de huidige state-of-the-art InsP-extractie met perchloorzuur gevolgd door verrijking met TiO₂, heeft CE-ESI-MS-analyse ongekende voordelen. Met betrekking tot de doorvoer, gevoeligheid, stabiliteit, absolute kwantificering, isomeeridentificatie en matrixafhankelijkheid onderscheidt deze methode zich in vergelijking met andere benaderingen. Dit protocol is van toepassing op zoogdiercellen, maar deze strategie slaagt inderdaad in veel verschillende monsters (bijv. Gist, planten, parasieten, muizenweefsels, enz.).

Het toegepaste extractieprotocol herstelt PP-InsP's en InsP₆ volledig uit zoogdiercelextracten^16,19. Het zal ook vele andere anionische metabolieten extraheren, met name fosfaatbevattende soorten, bijvoorbeeld suikerfosfaten en nucleotiden. Evaluatie van het herstel en de ontbinding voor de analyten van de gebruiker met dit protocol zou noodzakelijk zijn.

Over het algemeen werkt het CE-ESI-MS-systeem soepel en biedt het plaats aan ongeveer 200 monsters per week met behulp van dit protocol. In tegenstelling tot HPLC wordt CE echter al lange tijd beschouwd als een methode voor experts en gespecialiseerde personen, waardoor de markt werd beperkt en de toepassing ervan werd beperkt. Een CE-ESI-MS-apparaat is dus meestal afwezig in analytische vermogens. Mensen die CE-ESI-MS-analyses willen uitvoeren, hebben waarschijnlijk geen CE-ervaring en zullen meer tijd besteden aan het oplossen van problemen. Hier worden de kritieke stappen gemarkeerd. Eerst en vooral is de kwaliteit van de capillaire snede. De gevoeligheid en stabiliteit van ESI-spray zijn meestal afhankelijk van een eersteklas capillaire snede. Ten tweede moet het capillaire uitlaatuiteinde precies 0,1 mm uit de spuitpunt liggen. De spuitnaald en het CE-capillair moeten in de axiale richting zijn. De kwaliteit van de ESI-spray is van cruciaal belang voor kwantificering; er moeten technische runs worden uitgevoerd om de herhaalbaarheid te evalueren.

Met het beschreven protocol is de limiet van kwantificering (LOQ) voor PP-Insp's 40 nM met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s (10 nL). Er zijn verschillende benaderingen om de gevoeligheid van de methode verder te verhogen. Ten eerste zal een injectie op 100 mbar gedurende 20 s (40 nL) nog steeds resulteren in een goede piekvorm en voldoende resolutie voor regio-isomeren 5-PP-InsP₅ en 1-PP-InsP₅. Ten tweede kunnen InsP-extracten worden opgelost in een kleinere hoeveelheid water. Ten derde kan de verblijftijd worden verlengd wanneer minder MRM-overgangen worden gebruikt voor kwantificering. Bovendien zou een CE-MS-ionenbron met behulp van een ultralage mantelvloeistofstroom de gevoeligheid aanzienlijk verhogen.

De CE-loopbuffer met pH 9 biedt de beste resolutie tussen InsP 6-InsP₈. Bij het verhogen van de pH tot 9,7 zal de resolutie onder InsP 3-InsP₆ aanzienlijk verbeteren. Vanwege de uitstekende resolutie wordt een kortere capillaire lengte van 72 cm aanbevolen voor het verder verhogen van de doorvoer. Bovendien verlaagt een hogere CE-cassettetemperatuur bij 40 °C de viscositeit van de waterige elektroforetische buffer en versnelt hun beweging onder EOF. Volgens verschillende onderzoeksvereisten kunnen wijzigingen van deze methode de Analyse van InsP's en PP-Insp's verder vergemakkelijken. Daarom hebben de beschreven CE-ESI-MS-protocollen het potentieel om nieuwe onderzoeksmogelijkheden te openen naar deze veelzijdige familie van signaalmoleculen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
1.5 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	616201	-
15 cm weefselkweek schalen	Thermo Fisher	168381	-
2.0 mL microcentrifuge tubes	Greiner Bio-One	623201	-
50 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One	227261	-
96-well platen	Thermo Fisher	260836	voor de DC eiwittest
CE gefuseerde silica capillaire	CS Chromatographie	105180	50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipet tips	Starlab	I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700	10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipet tips
Serologische pipetten	TPP	94550, 94525, 94010, 94005	50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serologische pipetten
T75 flessen	TPP	90076	-
Chemie en Reagentia
NaOH	AppliChem	A6829,0500	natriumhydroxide pellets voor moleculaire biologie, voor de bereiding van cel lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056	-
Ammonium acetate	Thermo Fisher	1677373	HPLC kwaliteit
BSA	Thermo Fisher	23209	albumine standaard (2.0 mg/mL) voor de bereiding van de standaardcurve
DC eiwittest	Biorad	5000116	DC eiwittest reagentia pakket
DMEM	Gibco	41966029	hoge glucose, pyruvate
FBS	Gibco	10270106, 10500064 (hitte geïnactiveerd)	10270106 voor HCT116UCL, 10500064 voor HCT116NIH
Isopropanol	Carl Roth	AE73.2	99.95% LC-MS kwaliteit
NH4OH, 10%	Carl Roth	6756.1	voor de bereiding van 3% NH4OH
PBS	Gibco	10010015	-
Perchloric zuur, 70%	Carl Roth	9216.1	voor de bereiding van 1 M perchloric zuur
SDS	SERVA	20760.02	voor de bereiding van cel lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma Aldrich	S7920	-
TiO2 korrels	GL Sciences	5020-75000	5 µm deeltjesgrootte
Trypan blauw oplossing	Gibco	15250061	trypan blauwe kleurstof (0.4%)
Ultrapuur (Type 1) water	Milli-Q	ZRQSVP3WW	model: Direct-Q 3 UV Waterzuiveringssysteem
Apparatuur
Analytische weegschaal	Mettler Toledo	30105893	model: XPE26; voor het wegen van korrels (5-6 mg per monster)
Automatische celteller	Logos Biosystems	L40002	model: LUNA-II Automatische Celteller
Centrifuge	Hettich	1401	model: UNIVERSAL 320
Centrifuge met koeling	VWR	521-1647P	model: Microstar 17R
CE systeem	Agilent	G7100A	-
CE/MS Adapter Kit	Agilent	G1603A	-
CE/MS Sproeier Kit	Agilent	G1607A	-
Celtelling slides	Logos Biosystems	L12001	LUNA Celtelling Slides
Centrifugale evaporator	Eppendorf	5305000304	model: Concentrator plus complete systeem
ESI bron	Agilent	AJS ESI	-
Super Support Film	Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo	647
Bevochtigde incubator	Binder	9040-0088	model: CB E6.1, voor de kweek van zoogdiercellen
IJsbox	-	-	moet voldoende ruimte bieden voor monsters, schalen, etc.
Isocratisch LC systeem	Agilent	G7110B 1260 Iso Pump	model: Infinity II Quaternary systeem
MSD	Agilent	G6495C	triple quadrupole
Multiplate reader	Tecan	30086375	model: SPARK 10 M
Pipet vuller	Thermo Fisher	10072332	voor serologische pipetten
Pipetten	Brand	705884, 705880, 705878, 705872, 705870	diverse pipetten
Rotator	Labnet	H5500	model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillaire kolom snijder	SGT	S0020	-
Testbuis shaker (vortex mixer)	Carl Roth	HXH6.1	model: Rotilabo-Mini Vortex
Kantelen tafel	Labnet	S0600	model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Waterbad	Thermo Fisher	FSGPD05	model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation	Agilent	Versie 10.1	-
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition	Agilent	Versie 10.1	-
MassHunter Workstation Optimizer	Agilent	Versie 10.1	-
MassHunter Workstation Kwalitatieve Analyse	Agilent	Versie 10.0	-
QQQ Kwantitatieve Analyse	Agilent	Versie 10.