Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Summary

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Abstract

Interbacteriële concurrentie kan direct van invloed zijn op de structuur en functie van microbiomen. Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopiebenadering die kan worden gebruikt om competitieve interacties tussen verschillende bacteriestammen op eencellig niveau te visualiseren en te kwantificeren. Het hier beschreven protocol biedt methoden voor geavanceerde benaderingen in diavoorbereiding op zowel rechtopstaande als omgekeerde epifluorescentiemicroscopen, live-cell en time-lapse beeldvormingstechnieken en kwantitatieve beeldanalyse met behulp van de open-source software FIJI. De benadering in dit manuscript schetst de kwantificering van competitieve interacties tussen symbiotische Vibrio fischeri-populaties door de verandering in oppervlakte in de loop van de tijd te meten voor twee samengebroede stammen die verschillende fluorescerende eiwitten uit stabiele plasmiden tot expressie brengen. Alternatieve methoden worden beschreven voor het optimaliseren van dit protocol in bacteriële modelsystemen die verschillende groeiomstandigheden vereisen. Hoewel de hier beschreven test gebruik maakt van omstandigheden die zijn geoptimaliseerd voor V. fischeri,is deze benadering zeer reproduceerbaar en kan deze gemakkelijk worden aangepast om de concurrentie tussen kweekbare isolaten uit diverse microbiomen te bestuderen.

Introduction

Dit artikel schetst een methode voor het kwantificeren van bacteriële concurrentie op het niveau van één cel met behulp van fluorescentiemicroscopie. De structuur en functie van microbiële gemeenschappen wordt vaak gevormd door competitieve interacties tussen microben, en in veel gevallen vereist het karakteriseren van deze interacties het observeren van verschillende bacteriestammen in coincubatie^{1,2,3,4,5,6,7,8} . Traditioneel wordt bacteriële concurrentie op populatieniveau gekwantificeerd door kolonievormende eenheden (CFU's) van remmer- en doelstammen voor en na een coincubatieperiode te tellen^2,9. Mechanismen voor microbiële competitie zijn breed verdeeld over bacteriën en kunnen afhankelijk zijn van diffusie of cel-celcontact om doelcellen te remmen^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.}

Hoewel bacteriestammen vaak worden waargenomen in coincubatie op populatieniveau, schetst dit manuscript een test voor eencellige kwantificering van bacteriële concurrentie. Verder bevat dit werk suggesties voor het aanpassen van het protocol voor het gebruik met andere bacteriesoorten. Hoewel de specifieke technieken in dit artikel worden gebruikt om contactafhankelijke intraspecifieke concurrentie tussen stammen van de symbiotische bacterie Vibrio fischeri^{20 , 21,22}te bestuderen, kunnen ze worden aangepast voor concurrentie tussen vele organismen. Dit artikel bevat instructies voor het instellen van dia's op zowel rechtopstaande als omgekeerde microscopen, en alle analyse wordt beschreven met behulp van de open-source software FIJI^23, zodat de methode kan worden gebruikt door onderzoekers met toegang tot verschillende beeldvormingsinstellingen en analyseprogramma's. Gezien het belang van het bestuderen van microbiële concurrentie op zowel populatie- als eencellig niveau, zal deze methode een waardevolle bron zijn voor onderzoekers om concurrerende interacties te kwantificeren, met name die welke geen toegang hebben tot eigen analysesoftware.

Protocol

1. Optimalisatie van bacteriestammen

1. Kies twee bacteriestammen voor eencellige bacteriële concurrentietests. Hier worden twee stammen van V. fischeri gebruikt: een doelstam (ES114²⁴) en een remmende stam (MJ11²⁵) waarvan bekend is dat deze de doelstam doodt met behulp van het type VI-secretiesysteem op chromosoom II (T6SS2)¹, een contactafhankelijk dodingsmechanisme.
2. Bepaal de juiste besturingselementen voor het experiment. In dit voorbeeld is de juiste controle om zowel de wild-type als de T6SS-mutante inhibitorstammen te incuberen met de doelstam om het effect van T6SS-gemedieerde doding te kwantificeren.
   OPMERKING: Aanvullende controles kunnen een doelstam omvatten die het noodzakelijke immuniteitsgen (en) tot expressie brengen om T6SS-afhankelijke doding te voorkomen of een remmende mutante stam die wild-type kopieën van de gemuteerde genen in trans tot expressie brengen om T6SS-activiteit te herstellen¹.
3. Transformeer indien mogelijk stammen met stabiele plasmiden die coderen voor genen voor verschillende fluorescerende eiwitten (bijv. GFP of RFP) om stamtypen op de microscoop visueel te onderscheiden. Hier wordt de inhibitorstam getagd met een GFP-coderend plasmide (pVSV102) en de doelstam met een dsRed-coderend plasmide (pVSV208)²⁶.
   OPMERKING: Als het niet mogelijk is om stabiele plasmiden te gebruiken, kunnen fluorescerende tags op het bacteriële chromosoom worden geïntroduceerd voor visualisatie^27,28.
4. Tijdens de eerste optimalisatieperiode worden klonale culturen van de gelabelde stammen in beeld gebracht onder elk van de fluorescerende filters die tijdens het experiment zullen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat cellen alleen zichtbaar zijn in het beoogde kanaal. Zorg er bijvoorbeeld voor dat een GFP-gelabelde stam alleen zichtbaar is in het FITC-kanaal.

2. Agarose pad voorbereiding

1. Bereid agarose pad oplossing door 2% laagsmelt agarose (w/v) op te lossen in mPBS. Verwarm de oplossing kort in de magnetron en vortex totdat de agarose volledig is opgelost. Houd deze oplossing warm door deze in een waterbad van 55°C te plaatsen totdat deze klaar is voor gebruik. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het voorbereiden van agarose pads.
   OPMERKING: Hier werd mPBS bereid door 20 g / L NaCl toe te voegen aan standaard 1x PBS.
2. Wikkel vijf keer een stuk laboratoriumtape rond een glasplaat. Herhaal dit proces een tweede keer op dezelfde dia, zodat de afstand tussen de twee stukken tape iets kleiner is dan de breedte van een coverslip (figuur 1A). Als u bijvoorbeeld 25 mm² coverslips gebruikt, moeten de stukjes tape ongeveer 20 mm uit elkaar worden geplaatst.
   OPMERKING: Hoewel het aantal keren dat de tape om de dia wordt gewikkeld, kan worden gewijzigd om de dikte van de agarose-pad aan te passen, is het belangrijk dat de lagen tape aan beide zijden van de dia dezelfde hoogte hebben, zodat de agarose-pad vlak blijft.
3. Pipetteer warme agarose-oplossing tussen de twee stukken tape en bedek onmiddellijk met een coverslip zodat deze op de stukjes tape rust. Dit zorgt ervoor dat het oppervlak van de agarose pad vlak blijft. Het volume agarose-oplossing dat in deze stap wordt gepipipeerd, moet voldoende zijn dat de coverslip contact maakt met de vloeistof en eventuele bubbels in de agarose-oplossing naar buiten duwt. Voor deze specifieke opstelling is 200 μL warme agarose voldoende.
4. Laat de agarose pad stollen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan de coincubation assay. Stap 2.2 produceert een agarose pad van ongeveer 20 mm².
5. Knip deze agarose pad met een scheermesje in vier, 5 mm² pads voor gebruik voor beeldvorming.
   OPMERKING: Agarose pads kunnen tot een week voorafgaand aan het experiment worden gemaakt en bij 4 °C worden bewaard in een lege, steriele petriplaat die is afgesloten met parafilm om uitdroging te voorkomen.

3. Bereid stammen voor op co-incubatie

1. Streif elke stam die in de coincubatietest moet worden gebruikt uit -80 °C-voorraden op LBS-agarplaten aangevuld met de juiste antibiotica en incubeer 's nachts bij 24 °C. Voor dit voorbeeld worden drie stammen gebruikt: de wild-type inhibitor-stam, de type VI-secretiesysteemmutant en de doelstam.
2. Begin de volgende dag met nachtculturen in biologisch duplicaat door twee kolonies van elke stam te plukken en ze opnieuw te suspenderen in LBS-medium aangevuld met de juiste antibiotica en 's nachts te incuberen bij 24 °C met schudden bij 200 tpm.
3. Op de volgende ochtend repliceert subcultuur elke biologische 1:1000 in vers LBS-medium zonder antibiotica en incubeert bij 24 °C met schudden gedurende 4-5 uur of totdat cellen een OD₆₀₀ van ~ 1,5 bereiken.
   OPMERKING: De timing van stap 3.1, 3.2 en 3.3 moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende bacteriesoorten, omdat hun groeisnelheid aanzienlijk kan variëren. Voor deze test waren cellen bedoeld om zich in de mid-log fase te bevinden aan het begin van de coincubation assay.

4. Coincubate bacteriestammen

1. Te beginnen met mid-log culturen uit stap 3.3, meet en registreer de optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) voor alle monsters.
2. Normaliseer elk monster tot een OD₆₀₀ = 1,0, wat overeenkomt met ongeveer 10⁹ KVE/ml voor V. fischeri, door de cultuur te verdunnen met LBS-medium.
3. Meng de twee concurrerende stammen samen in een verhouding van 1:1 op basis van volume door 30 μL van elke genormaliseerde stam toe te voegen aan een gelabelde buis van 1,5 ml. Vortex de gemengde-stamcultuur voor 1-2 s.
   OPMERKING: In sommige gevallen kan het aangewezen zijn om coculturen in verschillende verhoudingen te mengen. Wanneer de ene soort bijvoorbeeld veel sneller groeit dan de andere, kan het nodig zijn om de langzamer groeiende soort met een numeriek voordeel te starten om de concurrentie te observeren. Optimalisatie kan ook nodig zijn als OD₆₀₀ niet overeenkomt met vergelijkbare CFU/ml voor beide stammen.
4. Herhaal stap 4.3 voor elke biologische replicatie en behandeling. In het hier getoonde voorbeeld zal dit resulteren in een totaal van vier gemengde stambuizen: twee biologische replicaties met de wild-type inhibitorstam gemengd met de doelstam en twee biologische replicaties met de type VI secretiesysteem mutante stam gemengd met de doelstam.
5. Om ervoor te zorgen dat concurrerende cellen voldoende dicht zijn voor contactafhankelijk doden in de coincubatie op het agarpad, concentreert u elke gemengde cultuur 3-voudig door de gemengde cultuur gedurende 1 minuut in een standaard 1,5 ml centrifugebuis te centrifugeren bij 21.130 x g,waarbij het supernatant wordt weggegooid en elke pellet opnieuw wordt opsuspendeerd in een 20 μL LBS-medium. Herhaal dit voor elk monster.
   OPMERKING: Sommige bacteriële cellen zijn gevoelig voor schade door centrifugering bij hoge rcf; in dergelijke gevallen kan de gemengde cultuur gedurende 3 minuten worden gecentrifugeerd bij 4600 x g²⁹. Bovendien is het bij het kwantificeren van contactafhankelijke concurrentie belangrijk om te zorgen voor voldoende celdichtheid op de dia om doden te observeren. In dit artikel hadden "drukke" behandelingen, waarbij doden wordt waargenomen, ongeveer 10 cellen / 20 μm²_; zie de sectie Discussie voor meer informatie.

5. Dia-instelling

1. Wanneer u een rechtopstaande microscoop gebruikt, plaatst u een ~5 mm² agarose pad op een standaard glazen dia van 1 mm. Spot 2 μL van een gemengde cultuur op de agarose pad en plaats een #1.5 coverslip (25 mm²) over de spot. Zie figuur 1B voor een voorbeeld.
2. Wanneer u een omgekeerde microscoop gebruikt, spot u 2 μL van een gemengde cultuur op de # 1,5 coverslipbodem van een petrischaaltje van 35 mm en plaatst u een ~ 5 mm² agarose pad over de coincubation spot. Plaats een 12 mm ronde glazen afdekplaat over de agarose pad. Zie figuur 1C voor een voorbeeld.
3. Herhaal stap 5.1 of 5.2, afhankelijk van de gebruikte microscoopopstelling, voor de resterende drie gemengde culturen, wat resulteert in vier dia's of schotels die moeten worden afgebeeld.
4. Laat de dia's ongeveer 5 minuten op het bankje zitten voordat u doorgaat naar stap 6. Hierdoor kunnen cellen zich op het agarpad nestelen en wordt beweging tijdens het beeldvormingsproces elimineren.

6. Fluorescentiemicroscopie

1. Begin met het focussen op cellen met wit licht (fasecontrast of DIC) om de effecten van fotobleken te minimaliseren. Gebruik op basis van de gemiddelde grootte van een enkele bacteriële cel een oliedoel van 60x of 100x.
2. Pas de belichtingstijd en acquisitie-instellingen voor elk kanaal aan, zodat cellen zichtbaar zijn in het juiste kanaal met minimale achtergronddetectie.
   OPMERKING: Het is passend om verschillende belichtingstijden te gebruiken voor verschillende kanalen, maar dezelfde blootstellingstijd moet worden gebruikt voor alle biologische replicaties en behandelingen voor een bepaald kanaal.
3. Selecteer voor elk monster ten minste vijf gezichtsvelden (FOV) en verkrijg afbeeldingen in elk geschikt kanaal met behulp van de acquisitie-instellingen uit stap 6.2 (zie voorbeelden in figuur 2). Sla de XY-punten van elke FOV op, zodat dezelfde FOV tijdens het laatste tijdstip kan worden afgebeeld. Het in beeld brengen van dezelfde FOV op elk tijdstip is noodzakelijk om het aandeel van het gebied te bepalen dat tijdens de analysestappen door doel- of remmercellen wordt ingenomen.
   OPMERKING: In dit voorbeeld wordt de fluorescentie van GFP gedetecteerd met behulp van een filter met een excitatiegolflengte van 467 - 498 nm en een emissiefilter van 513 - 556 nm en is vals groen gekleurd. Fluorescentie van dsRed wordt gedetecteerd met behulp van een filter met een excitatiegolflengte van 542 - 582 nm en een emissiefilter van 603 - 678 nm en is vals gekleurd magenta.
4. Herhaal na 2 uur stap 6.3 voor elk monster met behulp van de eerder opgeslagen XY-punten(fig. 2).
   OPMERKING: De timing van volgende afbeeldingen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor organismen met verschillende groeisnelheden of concurrentiemechanismen.

7. Beeldanalyse in FIJI

1. Download en installeer de FIJI-beeldverwerkingssoftware met behulp van de instructies hier: https://imagej.net/Fiji/Downloads
2. Open FIJI en importeer afbeeldingsbestanden voor analyse.
   OPMERKING: In de meeste gevallen . TIFF-bestanden zullen worden gebruikt voor beeldanalyse, hoewel sommige beeldacquisitiesoftware zal exporteren met behulp van eigen bestandstypen. FIJI kan de meeste eigen bestandstypen herkennen en afbeeldingen kunnen als volgt worden geïmporteerd en geanalyseerd.
3. Voor elke afbeelding die in stap 6.3 en 6.4 is verkregen, converteert u de afbeelding naar grijswaarden, scheidt u de kanalen en begint u met drempels (Ctrl + Shift + T) en het maken van een binair masker van de voorbewerkte afbeelding(Figuur 3A,B).
   OPMERKING: Hier worden de standaard drempelinstellingen in FIJI gebruikt. In sommige gevallen kan het nodig zijn om die instellingen te wijzigen, in welk geval dezelfde instellingen moeten worden gebruikt voor alle afbeeldingen in dat experiment.
4. Schaal instellen voor de afbeelding (| analyseren Schaal instellen) met behulp van de juiste waarden voor de microscopie-instelling²³.
5. Metingen instellen (| analyseren Metingen instellen) en selecteer Gebied.
   OPMERKING: Andere metingen kunnen worden toegevoegd als ze geschikt zijn voor het experiment. Alleen de objectgebiedmeting is vereist voor de hier getoonde voorbeeldanalyse.
6. Deeltjes analyseren (| analyseren Analyseer deeltjes) met behulp van de standaardinstellingen(Figuur 3C). Als er vuil in het monster zit, kan het nodig zijn om de grootte of circulariteit aan te passen om niet-celdeeltjes eruit te filteren. Selecteer | weergeven Contouren zodat de output van deze analyse een genummerde schets van alle geanalyseerde deeltjes zal bevatten(Figuur 3D).
   OPMERKING: Het vergelijken van de omtrek in figuur 3D met de oorspronkelijke afbeelding is vooral belangrijk in de optimalisatiestap om ervoor te zorgen dat (1) alle cellen worden geanalyseerd en (2) dat vuil wordt uitgesloten van de analyse.
7. Exporteer de metingen uit stap 7.4 (Figuur 3E) naar een spreadsheetsoftware voor verdere analyse en grafieken.
8. Herhaal stap 7.1 - 7.5 voor alle kanalen en afbeeldingen die tijdens het experiment zijn verkregen.

8. Berekening van het percentage van het initiële doelgebied in de loop van de tijd

1. Zorg ervoor dat het geëxporteerde bestand voor elk gezichtsveld dat in sectie 7 wordt geanalyseerd, een individuele gebiedsmeting bevat voor elk deeltje dat is geanalyseerd. Begin met het fluorescentiekanaal van de doelstam en bereken het somdeeltjesoppervlak voor elk afzonderlijk gezichtsveld. Voor twee biologische replicaties met elk vijf FOV moet dit resulteren in tien somgebieden per behandeling op elk tijdstip.
2. Bereken het percentage van het initiële doelgebied in de loop van de tijd voor elke FOV met behulp van de volgende vergelijking: ( )
3. Herhaal deze berekening voor alle behandelingen en grafiek het percentage van het initiële doelgebied (resultaat van de vergelijking uit stap 8.2) voor elke behandeling(figuur 4A).
4. Bepaal of er voor elke behandeling een netto toename van de doelpopulatie is (wat wijst op groei), een netto afname van de doelpopulatie (wat wijst op overlijden) of geen verandering (wat wijst op geen groei of overlijden).
   OPMERKING: Procenten van het initiële doelgebied met waarden van meer dan 100 geven een nettodoelgroei aan en waarden lager dan 100 duiden op nettodoelsterfte. Procent van de initiële streefwaarden die op 100 blijven, duidt op geen netto verandering in de doelpopulatie. Zie discussie voor voorgestelde vervolgexperimenten.

9. Berekening van het percentage van het initiële inhibitorgebied in de loop van de tijd

1. Herhaal stap 8.1 tot en met 8.3, ditmaal met behulp van de metingen die zijn verzameld uit het fluorescentiekanaal van de inhibitorstam in rubriek 7 (figuur 4B).
2. Bepaal of er een netto toename van de remmerpopulatie was (groei); een netto afname van de remmerpopulatie (overlijden), of geen verandering voor elke behandeling. Waarden groter dan 100 duiden op netto remmergroei en waarden lager dan 100 duiden op netto remmersterfte.

Results

Om competitieve interacties tussen bacteriën op het niveau van één cel te visualiseren en te kwantificeren, werd een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor V. fischeri door onze gevestigde op CFU gebaseerde test^{1, 2}te wijzigen. Deze methode maakt gebruik van GFP- en dsRed-codering van stabiele plasmiden om verschillende stammen van V. fischerivisueel te onderscheiden. De competitieve uitkomst van deze interacties kan worden gekwantificeerd door de beelden te analyseren die uit deze test zijn verkregen met behulp van de open-source software FIJI. Als voorbeeld werd het volgende experiment uitgevoerd met behulp van V. fischeri-isolaten. Een remmerstam herbergde een plasmide dat codeert voor GFP, en een doelstam herbergde een plasmide dat codeert voor dsRed. Aangezien de door de remmer gecodeerde T6SS2 een contactafhankelijk dodingsmechanisme is, werden behandelingen opgenomen waarbij cellen ofwel overvol (hoog cel-celcontact) ofwel dispergeerden (laag cel-celcontact) op een dia om de impact van experimentele opstelling op de uiteindelijke resultaten van deze test te benadrukken. In de steekproefgegevens werden concurrerende stammen gemengd in een verhouding van 1:1 en gedurende 2 uur geïncubeerd op een agarosepad, en zowel initiële als laatste (2 uur) foto's werden gemaakt. Als controle werd ook een T6SS2-mutante stam samen met de doelstam gemunt in zowel drukke als verspreide omstandigheden. Culturen van elke stam werden bereid en gemunt zoals hierboven beschreven en dia's werden voorbereid zoals weergegeven in figuur 1.

Figuur 2 toont representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van elke experimentele behandeling met hetzelfde gezichtsveld afgebeeld op een initieel en laatste tijdstip. Voor elke behandeling werd een wild-type inhibitor of T6SS-mutante stam met een GFP-coderend plasmide gemengd in een verhouding van 1:1 met de doelstam die een dsRed-coderend plasmide herbergde. Tijdens een 2 uur durende durende knoopperiode met deze experimentele opstelling kunnen groeiende V. fischeri-cellen 1-2 delingen doorlopen (Figuur 2; grijze pijlen). In figuur 2Awerd cel-celcontact tussen het doelwit en de remmer geforceerd door de gemengde cultuur te concentreren voordat ze op de dia werden gespot. Meerdere doelcellen worden waargenomen om afgerond te worden en / of verdwijnen in de loop van 2 uur, consistent met doelcellen die worden geëlimineerd door de remmer (Figuur 2; witte pijlen). Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het interpreteren van afrondings- of lysingdoelcellen. In figuur 2Bwerd dezelfde coincubatie op een dia gespot, dit keer zonder de gemengde cultuur te concentreren, zodat de cellen verspreid bleven en er minimaal contact was tussen spanningen op de dia. Hier worden geen doelcellen waargenomen die verdwijnen of ronden, wat suggereert dat de doelstam niet werd geremd in deze behandeling. Figuur 2C en figuur 2D tonen dezelfde overvolle en verspreide behandelingen die hierboven zijn beschreven, dit keer met een T6SS-mutant als de remmende stam. Doelcellen werden niet waargenomen om te verdwijnen of rond te worden wanneer ze werden geconcubeerd met een T6SS-mutant in drukke of verspreide omstandigheden, wat opnieuw suggereert dat het doelwit bij geen van beide behandelingen werd geremd.

Figuur 3 toont de FIJI-analyseworkflow die wordt gebruikt om de concurrentie in dit protocol te kwantificeren. Een representatieve afbeelding van het doelkanaal werd geselecteerd (Figuur 3A) en een binair masker werd gemaakt met behulp van de standaarddrempelinstellingen in FIJI (Figuur 3B). De afbeeldingsschaal is geschikt ingesteld voor deze microscopie-opstelling. Deeltjes werden geanalyseerd met behulp van de grootteparameter = 0 - oneindig, circulariteitsparameter = 0,00 - 1,00 en Show Outlines werd geselecteerd (Figuur 3C). De resultaten van deze deeltjesanalyse worden weergegeven als zowel een genummerde omtrek van elk deeltje(figuur 3D),als als een tabel met kolommen voor het deeltjesnummer, de bestandsnaam (label) en het deeltjesoppervlak in μm² (gebied)(figuur 3E).

In figuur 4worden gegevens verkregen uit figuur 3E in een grafiek weergegeven en geanalyseerd. In figuur 4Awordt het percentage van het initiële doelgebied op het uiteindelijke tijdstip voor elke behandeling weergegeven volgens stap 8.2. Als het percentage van het oorspronkelijke doelgebied groter is dan 100, vertegenwoordigt dit een netto toename van het doel (d.w.z. groei) en wordt het waargenomen in omstandigheden waarin de doelpopulatie niet significant wordt geremd. Als het percentage van het oorspronkelijke doelgebied echter lager is dan 100, duidt dit resultaat op een netto afname van het doel (d.w.z. sterfte) en wordt het waargenomen in omstandigheden waarin de doelpopulatie aanzienlijk wordt geremd. Wanneer het doelwit werd gemunt met een wild-type remmer in drukke omstandigheden, tonen de gegevens een netto afname in het doelgebied. Wanneer het doelwit daarentegen werd geconcubateerd met een wild-type remmer in disperse omstandigheden of een T6SS-mutant in drukke of verspreide omstandigheden, tonen de gegevens een netto toename van het doelgebied. Het percentage van het initiële doelgebied wanneer het doelwit werd gemunt met een wild-type remmer in drukke omstandigheden was lager dan 100 en significant lager dan alle andere behandelingen volgens een eenrichtings-ANOVA gevolgd door een Tukey's meerdere vergelijkingstest voor alle behandelingen(p < 0,0001). Deze gegevens geven aan dat doelceldood afhankelijk is van een functionele T6SS in de remmer en onderstrepen het belang van een experimentele opstelling die voldoende cel-celcontact mogelijk maakt, om celdood te detecteren door een contactafhankelijk dodingsmechanisme.

Figuur 4B toont het percentage van het initiële inhibitorgebied op het laatste tijdstip voor elke behandeling. In dit voorbeeld werd de nettogroei van de inhibitorstam waargenomen bij alle behandelingen. Het percentage van het initiële inhibitorgebied was echter significant hoger wanneer een wild-type remmer werd gemunt met het doelwit in drukke omstandigheden in vergelijking met alle andere behandelingen volgens een eenrichtings-ANOVA gevolgd door een Tukey's meervoudige vergelijkingstest voor alle behandelingen(p < 0,0001). Aanvankelijk kwamen we ervan uit dat de netto toename van het inhibitorgebied kan worden aangedreven door de toename van de beschikbare ruimte om in te groeien naarmate doelcellen worden geëlimineerd. Dezelfde toename van de groei van remmers werd echter niet waargenomen bij disperse behandelingen, waarbij remmercellen ruimte hadden om te groeien vanaf het begin van de co-cubatie. Als alternatief zou dit resultaat kunnen suggereren dat voedingsstoffen die vrijkomen uit lyserende doelcellen zorgen voor een grotere toename van de remmerpopulatie. Alles bij elkaar suggereren deze resultaten dat de inhibitorstam het doelwit alleen op een T6SS-afhankelijke manier elimineert wanneer hoog cel-celcontact wordt geforceerd door cellen op de dia te verdringen.

Figuur 1: Agarose pad voorbereiding en slide setup voor coincubation assays. (A) Setup voor het maken van 2% agarose pads. Vijf lagen laboratoriumtape (groen) worden om een afdekslip gewikkeld op twee punten op ongeveer 20 mm van elkaar. Vervolgens wordt warme 2% agarose in mPBS (geel) tussen de stukjes tape gepipimpt en onmiddellijk bedekt met een 25 mm² afdekslip en gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur laten stollen. Gebruik een scheermesje om de agarose pad in ~ 5 mm² stukken te snijden en gebruik een pincet om de pad over te brengen naar een nieuwe dia voor beeldvorming. (B)Plaats bij het maken van een rechtopstaande microscoop de 5 mm² agarose pad direct op de dia, volg de gemengde cultuur (blauw) en een 12 mm ronde #1.5 cover slip. (C)Wanneer u een afbeelding maakt op een omgekeerde microscoop, spot u de gemengde cultuur rechtstreeks op de # 1,5 glazen afdekplaat van een petrischaaltje van 35 mm en plaatst u een agarose-pad bovenop de cultuur, gevolgd door een tweede 12 mm ronde afdekslip om de agarose-pad plat te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Timelapse-beelden van coincubatieplekken in drukke of verspreide omstandigheden. (A) Representatieve beelden op initiële en laatste tijdstippen waar een gemengde cultuur van doel- en wildtyperemmer 3x voorafgaand aan spotting op de dia werd geconcentreerd om cel-celcontact tussen stammen te forceren. Witte pijlen in het TRITC-kanaal geven voorbeelden aan van doelcellen die in de loop van het experiment rond of lyseren. BRepresentatieve beelden waarbij een gemengde cultuur van doel- en wildtyperemmer werd gespot zonder zich te concentreren, zodat cellen worden verspreid en er minimaal cel-celcontact tussen stammen is. Grijze pijlen in FITC- en TRITC-kanalen geven voorbeelden van celdeling in de loop van het experiment. (C) Representatieve beelden waarbij gemengde cultuur van doel en T6SS^- mutant 3x voorafgaand aan spotting op de dia werd geconcentreerd om cel-celcontact tussen stammen te forceren. (D) Representatieve beelden waarbij gemengde cultuur van doel en T6SS^- mutant werd gespot zonder zich te concentreren, zodat cellen worden verspreid en er minimaal cel-celcontact tussen stammen is. Schaalbalken = 5 μm en zijn consistent in alle afbeeldingen; TRITC-kanaal is vals gekleurd magenta, FITC-kanaal is vals gekleurd groen. Op alle beelden werd deconvolutie uitgevoerd; achtergrond werd afgetrokken en helderheid/contrast werd uniform aangepast voor alle afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fiji-analyseworkflow. (A) Representatief beeld voor analyse. Deze workflow wordt herhaald voor beide kanalen in alle weergavevelden en voorbeelden. Schaalbalken = 5 μm en zijn consistent in alle afbeeldingen; TRITC-kanaal is vals gekleurd magenta, FITC-kanaal is vals gekleurd groen. (B) Binair masker gemaakt door de afbeelding te drempelen met behulp van de standaardinstellingen in FIJI. (C) Voorbeeld van instellingen voor deeltjesanalyse die in dit manuscript worden gebruikt. Groottebereik = 0 - oneindig μm²; circulariteit = 0,00 - 1,00; show = contouren. (D) Deeltjesomtrek gemaakt als output van deeltjesanalyse in (C). De deeltjesomtrek in (D) moet worden vergeleken met de oorspronkelijke afbeelding (A) om ervoor te zorgen dat alle cellen in de deeltjesanalyse zijn vastgelegd. (E) Resultatentabel gemaakt als output van deeltjesanalyse in (C). Objectnummer (kolom 1) komt overeen met afzonderlijke deeltjes (een of meer cellen) die in paneel(D)rood zijn omlijnd en gelabeld. Label = bestandsnaam van de geanalyseerde afbeelding; Oppervlakte = totale deeltjesoppervlakte in μm². Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Steekproefgegevens om te beoordelen of de doelstam wordt geremd. Het percentage van het begingebied op de laatste tijdstippen voor de doelstam (A) en remmerstam (B), bij verschillende initiële celdichtheden. Diadichtheid duidt op een beginnende celdichtheid die overvol is (hoog celcontact tussen stammen), of meer dispergeer (laag celcontact tussen stammen) zoals beschreven in figuur 2. Het genotype van de inhibitor geeft aan dat een wild-type of de T6SS-mutant (T6SS^-) stam werd samengevallen met de doelstam. Asterisken geven een significant verschil aan in % verandering bij het vergelijken van alle behandelingen (eenrichtings-ANOVA gevolgd door een Tukey's multiple comparisons test waarin alle behandelingen worden vergeleken; (p < 0,0001). Stippellijn geeft aan dat er geen netto verandering in het rekgebied is tussen het begin- en het eindtijdpunt; een verandering in % > 100 duidt op een nettotoename (d.w.z. groei) en een verandering < 100 duidt op een netto afname (d.w.z. celdood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het hierboven beschreven protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het kwantificeren en karakteriseren van interbacteriële concurrentie op het niveau van één cel. Deze test, die werd ontwikkeld door onze op CFU gebaseerde concurrentietest op agarplaten¹,^2tewijzigen, maakte de visualisatie van eencellige concurrentie tussen V. fischeri-isolaten mogelijk en er worden suggesties gegeven voor het optimaliseren van de methode voor een breed scala aan systemen en microscopie-opstellingen. Hoewel de hier beschreven methode is geoptimaliseerd voor de lichtorgaansymbiont V. fischeri,kan deze gemakkelijk worden aangepast om veel verschillende, kweekbare microben te huisvesten. Het is belangrijk op te merken dat concurrentiemechanismen kunnen worden gereguleerd door een willekeurig aantal omgevingsvariabelen, waaronder temperatuur, zoutgehalte en viscositeit^{30,31,32,33,34.} Eerder werk heeft bevestigd dat V. fischeri concurreert met behulp van een contactafhankelijk Type VI Secretiesysteem dat actief is op oppervlakken³⁰, waardoor de omstandigheden beschreven in deze test geschikt zijn voor het bestuderen van concurrentie tussen de voorbeeldstammen. Het is ook belangrijk om rekening te houden met de initiële dichtheid van cellen op de dia bij het kwantificeren van bacteriële concurrentie. Aangezien contact tussen doel- en remmercellen vaak nodig is om te doden, moet de gemengde cultuur zodanig worden geconcentreerd dat het cel-celcontact wordt gemaximaliseerd en cellen in één vlak op de dia blijven. Celculturen moeten worden gekweekt tot een vergelijkbare optische dichtheid (mid-log fase) en vervolgens worden geconcentreerd om contact te forceren in plaats van eenvoudigweg culturen te laten groeien tot een hogere optische dichtheid als gevolg van de fysiologische veranderingen van cellen in verschillende groeifasen. In andere systemen moeten de kweekomstandigheden en de experimentele opstelling mogelijk worden gewijzigd om ervoor te zorgen dat het concurrentiemechanisme actief is en kan worden gedetecteerd in de coincubatieconditie.

De agarose pads die in deze test worden gebruikt, bieden verschillende voordelen: ze bieden stabilisatie zodat cellen niet vrij bewegen en ze voorkomen dat de cultuur in de loop van het experiment uitdroogt. Bovendien, als chemische inductoren, zoals isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), nodig zijn voor het experiment, kunnen ze gemakkelijk worden toegevoegd aan de agarose-oplossing. Het is echter belangrijk op te merken dat het agarosepreparaat waarschijnlijk moet worden aangepast voor verschillende systemen. In het hierboven beschreven voorbeeld werd de agarose pad bereid door 2% agarose (w/v) op te lossen in 20 psu mPBS, het standaard zoutgehalte dat wordt gebruikt in V. fischeri groeimedium. Bovendien moet in sommige gevallen een koolstofbron aan de agarose-pad worden toegevoegd om cellen te laten groeien en concurreren tijdens langere experimenten. In een dergelijk geval kan de mPBS in agarose pads worden vervangen door elk groeimedium, hoewel de voedingsstoffen in het groeimedium kunnen komen met de afweging van extra achtergrondfluorescentie.

Zonder eigen beeldanalysesoftware kan het erg moeilijk zijn om individuele celtellingen te krijgen wanneer het cel-celcontact hoog is, wat, zoals we hier laten zien, nodig is om contactafhankelijk doden te observeren. Deze test is ontworpen om een alternatieve methode voor kwantificering te bieden die niet afhankelijk is van individuele celtellingen. In plaats daarvan wordt het totale celoppervlak voor elk fluorescentiekanaal gebruikt om de mate van doden tussen samengebroede stammen te kwantificeren. Omdat deze methode afhankelijk is van het gebied in plaats van het aantal afzonderlijke cellen, zijn standaarddrempelinstellingen meestal voldoende om het totale celoppervlak te schetsen. De nauwkeurigheid van de drempelwaarde kan worden geverifieerd door het totale objectoppervlak voor een representatief gezichtsveld te delen door de gemiddelde celgrootte voor het modelorganisme en dit geschatte celgetal te vergelijken met een handmatig celgetal voor hetzelfde beeld.

In coincubations tussen één remmer en één doel (niet-killer) stam wordt de nettogroei van de remmer voorspeld. Zoals te zien is in figuur 4,kan de groei van remmers significant hoger zijn bij behandelingen waarbij doden wordt waargenomen, in vergelijking met behandelingen waarbij doden niet wordt waargenomen, misschien omdat voedingsstoffen die vrijkomen door lyserende doelcellen de remmerstam sneller laten groeien. In het hier getoonde voorbeeld wordt netto doelsterfte waargenomen omdat T6SS-gemedieerde concurrentie resulteert in doelcellysis waarbij het doelwit fysiek wordt geëlimineerd. Het is echter belangrijk op te merken dat niet alle concurrentiemechanismen resulteren in de fysieke eliminatie van doelcellen. Als een doelwit wordt uitgeschakeld door een toxine dat groeiremming veroorzaakt, kan het hier beschreven protocol ertoe leiden dat de zichtbare doelpopulatie in de loop van de tijd stabiel blijft, omdat doelcellen niet langer groeien maar ook niet lyseren. In een dergelijk geval zou het passend zijn om de resultaten van deze test te vergelijken met vervolgtests voor de levensvatbaarheid van doelcellen, zoals plating voor kolonievormende eenheden (CFU's) of door levend-dode assays uit te voeren door kleuring met propidiumjodide of SYTOX groen^35,36.

Vergeleken met coincubatie-assays die afhankelijk zijn van CFU-tellingen, maakt deze test het mogelijk om de ruimtelijke structuur van concurrentie tussen stammen te observeren en te kwantificeren en veranderingen in de morfologie van doelcellen in de loop van de tijd te volgen. Het is bijvoorbeeld bekend dat remmercellen die doden met behulp van een T6SS coderen voor LysM-domeineiwitten die de doelcelwand afbreken, wat resulteert in initiële celronding en vervolgens lysis¹³, wat we hebben waargenomen in het voorbeeld in figuur 2A. Verder kan dit protocol worden gebruikt om de concurrentie met hoge resolutie over zeer korte tijdschalen te volgen. In het hier getoonde voorbeeld wordt een significante afname van het doelgebied waargenomen na slechts twee uur wanneer cellen overvol zijn en cel-celcontact wordt geforceerd tussen stammen(figuur 4). De hier beschreven beeldanalyse zou ook kunnen worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie, die het mogelijk zou maken om bacteriële concurrentie in vivo of in complexe biofilms te bestuderen, zonder de ruimtelijke verdeling van coincubated stammen te verstoren.

Samenvattend is de hier beschreven test bedoeld om een toegankelijke en gemakkelijk te wijzigen aanpak te bieden voor het visualiseren en kwantificeren van bacteriële concurrentie op het niveau van eencellige met behulp van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan worden toegepast op diverse bacteriële isolaten en kan worden gebruikt om bacteriële concurrentie te visualiseren, zelfs in complexe omgevingen zoals binnen een gastheer of biofilmmatrix.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher	05-408-129
10 uL single channel pipette
1000 uL single channel pipette
20 uL single channel pipette
200 uL single channel pipette
Agarose	Fisher	BP165-25	Low melting agarose
Calculator
Cellvis 35 mm Dish	Fisher	NC0409658	#1.5 cover glass bottom
Chloramphenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
DAPI Nucleic Acid Stain	Fisher	EN62248	optional (if not using stable plasmids)
FIJI image analysis sofware	ImageJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	open-source software
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	Fisher	12-545-81P	#1.5 cover glass; 12 mm diameter
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Lens Cleaning Tissue Paper	Fisher	S24530
Parafilm	Fisher	13-374-12
Petri Plates	Fisher	FB0875713	sterile with lid
Razor Blades	Fisher	S65921
Semi-micro Cuvettes	VWR	97000-586
Spectrophotometer
SYBR Green Nucleic Acid Stain	Fisher	S7563	optional (if not using stable plasmids)
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides	Fisher	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass	Fisher	22-050-235	#1.5 cover glass, 25 mm2
Type F Immersion Oil	Fisher	NC0297589
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software			Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software.
Vortex
Water bath			Used to keep agarose warm prior to pipetting
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Add only for plates)
DI water			950 mL
Sodium Chloride	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Yeast Extract	Fisher	BP9727-2	5 g
mPBS (marine PBS)			Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad
10X PBS	Fisher	ICN1960454
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS1-160P	Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here
Sterile Vacuum Filter Units	Fisher	SCGVU01RE	Used to filter-sterilize mPBS
Vacuum pump			Used to filter-sterilize mPBS